专利名称：：人乳头瘤病毒型别杂合病毒样颗粒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本发明涉及由不同型别HPVLI蛋白杂合组装形成的人乳头瘤病毒型别杂合病毒样颗粒及其制备方法，所述型别杂合病毒样颗粒可用于预防两种或两种以上HPV感染及由HPV感染所导致的疾病。本发明还涉及上述型别杂合病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染及由HPV感染所导致的疾病如宫颈癌、尖锐湿疣等。
背景技术：
：人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV)主要引起皮肤,粘膜的抚状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为高危型与低危型，其中高危型的HPV感染被证实是诱发包括女性宫颈癌在内的肛生殖器癌症主要原因；低危型则主要引起尖锐湿疣。预防与控制HPV感染的最有效方式是HPV疫苗，特别是能引起宫颈癌的高危型HPV疫苗。HPV的主要衣壳蛋白LI具有自组装为空心病毒样颗粒(Virus-LikeParticle,VLP)的特性。HPVVLP是由72个主要衣壳蛋白LI的五聚体以二硫键连接而构成20面体立体对称结构(Doorbar,J.andP.H.Gallimore.1987.JVirol,61(9):2793-9)。HPVVLP结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可诱导高滴度的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy，etal.1992ProcNatlAcadSciUSA89(24):12180-4)。结构研究和突变分析表明，HPV16LI蛋白Cysl75、Cysl85和Cys428对VLP的基本结构单位五聚体之间的相互作用起关键的作用，Cysl61、Cys229、Cys379对于单体分子间的相互作用是必需的，提示发生在LI蛋白分子内和/或分子间的二硫键对于HPV病毒样颗粒的组装有重要的作用(IshiiY.，TanakaK.，KandaT.2003Virology.308:128-136)。本研究即对这些二硫键进行改造，发明新的人工HPV型别杂合病毒样颗粒。现有的研究发现，HPVVLP主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，仅在一些同源性高的型别之间存在交叉保护。因此，现有的HPV疫苗的保护范围有限。如果要扩大HPV疫苗的保护范围只能通过增加疫苗中所含有的HPVVLP型别来实现。这将大大提高HPV疫苗的生产成本，并可能因为免疫剂量增加而带来潜在的安全性问题。而目前已上市的HPV疫苗(包括Merck公司的GardasiIHPV16,18,6,11四价疫苗和GSK公司的CervarixHPV16，18二价疫苗)均采用单独型别vlp混合制备而成的。因此，本领域仍然需要能够诱导针对多型别HPV保护性抗体的HPVLI病毒样颗粒，从而使制备预防更多型别HPV的宫颈癌疫苗成为可能。
发明内容本发明至少部分基于发明人的以下的出人意料的发现利用大肠杆菌表达系统表达两个或两个以上不同型别的175位与428位半胱氨酸突变或缺失的HPVLI蛋白，所述突变或缺失的HPVLI蛋白单独不能形成病毒样颗粒，然而，按照一定的混合方式及一定的浓度比例混合后去除还原剂，可得到一种新的杂合VLP。该杂合VLP含有两种或两种以上的HPVLI蛋白，可诱导针对两种或两种以上HPV的高滴度中和抗体。因此，在一方面，本发明涉及组装成杂合病毒样颗粒的突变或缺失的HPVLI蛋白，所述蛋白包括但不限于HPVL1-C175A、HPVL1_AC428、HPVL1_AC175、HPVL1_C175S、HPVL1-C428A、HPVL1-C428S等。在一个优选的实施方案中，HPVL1-C175A与HPVL1-AC428按照I:I的摩尔比混合。在其它实施方式中，二者的比例包括21、12等等。在另一个方面，本发明涉及一种制备本发明的杂合病毒样颗粒的方法。在一个优选实施方案中，制备本发明的杂合病毒样颗粒的方法包括a)在大肠杆菌中表达所述突变或缺失HPVLI蛋白，b)将表达所述突变或缺失HPVLI蛋白纯化，得到纯度95%以上的突变或缺失HPVLI蛋白，c)将b)纯化的突变或缺失LI蛋白HPVL1-C175A与HPVLI-AC428按照I:I的摩尔比混合，透析去除还原剂，即得到杂合VLP。d)将c)得到的杂合VLP进一步纯化，收集颗粒组分。本发明还涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的HPV杂合VLP与药学可接受的载体和/或赋形剂混合，任选地还混合一种或多种选自HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58和59的HPV型别的病毒样颗粒或其他型别的杂合VLP。如上所论述的，所获得的疫苗可以用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病如宫颈癌等。在另一个方面，还涉及根据本发明的杂合病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。本发明中相关术语的说明及解释在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。根据本发明，术语“HPVLI”是指人乳头瘤病毒(HPV)的LI蛋白，其序列是本领域公知的(参见，例如NCBI数据库序列号DQ469930.I)。在本发明中，当涉及HPVLI的序列时，参考IshiiY，TanakaK，KandaT.Virology.(2003)，308(I)，128-36。其使用NCBI数据库序列号DQ469930.I进行描述。根据本发明，术语“HPVLI突变体蛋白”是指，在LI蛋白中的某一位或某几位半胱氨酸(C)残基进行缺失或用其它氨基酸残基置换所获得的蛋白质，非必需地包括对LI蛋白进行N端或C端的缺失。根据本发明，术语“HPVX-CYZ”是指，用Z氨基酸残基置换HPVX型LI蛋白质第Y位的半胱氨酸(C)残基所获得的蛋白质，其中X是指HPV的型别，Y是指GenBankABR)6542.1(其核苷酸序列为DQ469930.I)氨基酸序列的从N端甲硫氨酸(M)开始计数的氨基酸所处的位置，如X=16，Y=175是指ABR)6542.I氨基酸序列的第175位氨基酸半胱氨酸C，非HPV16型别的Y值则指将目标蛋白序列与ABR)6542.I氨基酸序列进行序列比对(可使用Blast、FaSta、CluSter等程序)后，相应于ABR)6542.I氨基酸序列的位置。如“HPV16-C175A”指用丙氨酸(A)残基置换HPV16型LI蛋白质ABR)6542.I的第175位的半胱氨酸(C)残基所获得的蛋白质；“HPV52-C175A”指用丙氨酸(A)残基置换HPV52型LI蛋白质中对应于ABR)6542.I氨基酸序列的第175位残基的半胱氨酸残基(C)后所获得的蛋白质。根据本发明，术语“HPVX-ACY”是指，将HPVX型LI蛋白质的第Y位的半胱氨酸(C)残基缺失所获得的蛋白质，其中氨基酸位置编号适用以上定义。如“HPV16-AC428”指将HPV16型LI蛋白质ABR)6542.I的第428位半胱氨酸残基缺失后所获得的蛋白质；“HPV52-AC428”指将HPV52型LI蛋白质中对应于ABR)6542.I氨基酸序列的第428位残基的半胱氨酸残基(C)缺失后所获得的蛋白质。根据本发明，术语“杂合颗粒”是指，将2种或2种以上型别经突变后不能单独组装形成VLP的LI蛋白混合组装，所形成的VLP。根据本发明，术语“X与Y杂合VLP”是指，将X与Y蛋白混合组装，所形成的杂合VLP0如“HPV16L1-C175A与HPV52LI-AC428杂合VLP”是指将HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428蛋白混合组装，所形成的杂合VLP。根据本发明，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与本发明的突变的HPVLI蛋白的氨基酸序列具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸不同(例如保守氨基酸置换)或者具有至少60%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%的同一性，并且其保留了所述截短蛋白的必要特性。此处术语“必要特性”可以是如下特性中的一个或者多个能够诱导针对该型HPV的中和抗体；能够在大肠杆菌中可溶性地表达；利用本发明所涉及的表达纯化方法能够获得高产率的纯化蛋白。根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目XlOO的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48=443-453的方法来实现。还可使用已整合ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和ff.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAMl20权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一丨I"生。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、3分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Bru_ell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于GI698、ER2566、BL21(DE3)、B834(DE3)、BLR(DE3)等等。根据本发明，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。可用于本发明的方法中的缓冲液是本领域公知的，包括但不限于，Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。根据本发明的HPV杂合病毒样颗粒可通过如下步骤获得将上述纯度至少95%的突变或缺失的HPVLI蛋白按I:I的摩尔比混合组装；去除该溶液中的还原剂，得到所述HPV杂合病毒样颗粒。去除还原剂的方式是本领域已知的，包括但不限于，透析，超滤或者层析等。根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences.EditedbyGennaroAR,19thed.PennsylvaniaMackPublishingCompany,1995),并且包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，PH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80;佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。发明的有益效果目前制备HPV病毒样颗粒均为单一型别LI组装形成的VLP，主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，仅在一些同源性高的型别之间存在交叉保护。因此，现有的HPV疫苗的保护范围有限。如果要扩大HPV疫苗的保护范围只能通过增加疫苗中所含有的HPVVLP型别来实现。这将大大提高HPV疫苗的生产成本，并可能因为免疫剂量增加而带来潜在的安全性问题。虽然有研究表明，HPVLI蛋白的175位和428位半胱氨酸对于病毒样颗粒组装可能其重要作用，突变或删除这些氨基酸可能影响HPVVLP的形成，但是本发明经过突变分析和组装条件摸索，却出乎意料地发现，这些半胱氨酸只影响同种型别HPVLI蛋白组装成VLP，但是这种影响却可以通过不同型别HPVLI来消除，从而发明制备不同型别HPVLI组装杂合VLP的方法，这种方法完全排除了同种型别HPVLI蛋白组装成为VLP的可能性，因为单独型别的HPVLI蛋白的175位或428位突变体自身无法形成VLP，只有与其他型别的HPVLI蛋白突变体相互补才能形成杂合型的VLP，这样的方法不仅可以应用于HPVVLP的结构和组装机理研究，以及疫苗制备的用途，也可应用于基于HPVVLP结构和组装的纳米材料及相关的研究。将不同型别LI蛋白杂合组装形成杂合具有免疫原性好，易产生非疫苗型别的交叉保护等优点，但如采用不同型别LI蛋白直接混合组装成VLP，不仅组装效率低，组装成的VLP形态也较差，同时还存在可能存在各种配比而VLP不均一的问题，限制了杂合VLP的工业化的制备，严重影响了获得的杂合VLP的免疫原性。本发明提供的杂合VLP和其制备方法有效的解决了上述问题。首先，本发明采用突变后单独无法组装成VLP的LI蛋白为原料，确保了其易于制备。其次，用该突变蛋白以一定的条件和比例组装制备杂合VLP，能够获得高组装效率的杂合VLP，且组装比例一致，组装得到的杂合VLP状态均一。进一步，该杂合VLP在同等剂量下能比同种VLP混合免疫在体内获得更高滴度的中和抗体，具有更好的免疫原性，此外，还能获得更高滴度的非疫苗型别的中和抗体，与混合的多价VLP相比，更适合作为疫苗使用。下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。图I显示了实施例I中经HIC(疏水相互作用色谱)纯化获得的HPV-Ll突变体的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M:蛋白分子量标记；泳道I:HPV16L1-C175A经HIC(疏水相互作用色谱)纯化洗脱级分；泳道2:HPV16L1-AC428经HIC(疏水相互作用色谱)纯化洗脱级分；泳道3HPV52L1-C175A经HIC(疏水相互作用色谱)纯化洗脱级分；泳道4HPV52L1-AC428经HIC(疏水相互作用色谱)纯化洗脱级分；结果显示，经过ButylSepharose4FastFlow柱纯化后，HPV16L1-C175A、HPV16L1-AC428、HPV52L1-C175A、HPV52L1-AC428蛋白纯度达到95%以上。图2显示了实施例2中所得的HPV-Ll突变体蛋白复性后透射电镜观察(放大100，000倍，Bar=0.Ii!m)结果。图2A，复性后的HPV16L1-C175A蛋白；图2B，复性后的HPV16L1-AC428蛋白；图2C，复性后的HPV52L1-C175A蛋白；图2D，复性后的HPV52L1-AC428蛋白。结果显示，在这4个图的视野中可见大量半径在5nm左右的五聚体，没有病毒样颗粒存在。图3显示了实施例3中所述方法制备的HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428在不同的缓冲液条件下，按摩尔比I:I组装的杂合VLP的透射电镜观察结果(100，000倍，Bar=0.Ium)o图3A,HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428在50mMPB(磷酸钠缓冲液)，pH6.0,0.5MNaCl组装成的杂合VLP;图3B，HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428在20mMPB，pH6.5,0.5MNaCl组装成的杂合VLP;图3(，册￥16L1-C175A与HPV52L1-AC428在20mMPB，pH7.0,0.5MNaCl组装成的杂合VLP。结果显示，图3A视野中可见大小不均一半径为20nm左右的病毒样颗粒，图3B视野中可见大小均一，半径30nm左右的病毒样颗粒，图3C视野中可见大量半径在5nm左右的五聚体，没有病毒样颗粒存在。图4显示了实施例4中所述方法制备的HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428按不同的摩尔比例组装的杂合VLP的凝胶过滤层析的结果。结果显示，HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428按摩尔比I:I组装的杂合VLP颗粒组装比例比较合适，五聚体剩余最少。图5显示了实施例4中所述的方法制备的HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428按不同的摩尔比例组装的杂合VLP的透射电镜观察结果(100，000倍，Bar=0.Iiim)。图5A,HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428按摩尔比2.5I组装的杂合VLP；图5B,HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428按摩尔比2I组装的杂合VLP;图5C，HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428按摩尔比II组装的杂合VLP;图HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428按摩尔比I:2组装的杂合VLP。结果显示，图5A视野中可见大量半径在5nm左右的五聚、体，没有病毒样颗粒存在。图5B视野中可见大小不均一，半径20-30nm左右的病毒样颗粒；图5C视野中可见大小均一，半径30nm左右的病毒样颗粒；图5D视野中视野中可大小不均一的，半径20nm左右的病毒样颗粒，并有大量半径在5nm左右的五聚体。图6显示了实施例4所述方法得到的HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLP的冷冻电镜观察的结果及其重建的三维结构。图6A，HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLP;图6B，HHPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLP的重建的三维结构。重建的三维结构显示，HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLP是由72个壳粒(形态亚单位，五聚体)形成的T=7的二十面体结构(h=l，k=2)。与一般的符合准等价原理的二十面体病毒衣壳不同，HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLPVLP结构中所有的组成亚单位均为五聚体，而未见六聚体，且VLP的最外围直径为约60nm。这与之前报道的天然HPV病毒颗粒及真核表达系统(例如，痘病毒表达系统)来源的HPVVLP的三维结构(BakerTS,NewcombWff,OlsonNH.etal.BiophysJ.(1991),60(6):1445-1456.HagenseeME,OlsonNH,BakerTS,etal.JVirol.(1994),68(7):4503-4505.BuckCB,ChengN,ThompsonCD.etal.JVirol.(2008),82(11):5190-7.)类似。图I显示了实施例4中制备的HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLPSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M:蛋白分子量标记；泳道I:HPV16L1蛋白；泳道2HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLP;泳道3HPV52L1蛋白。结果显示电泳结果表明HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLP有两条特异条带，分别与HPV16L1、HPV52L1的条带相一致。图8显示了实施例4中制备的HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLP与HPV16特异线性抗体21A5进行蛋白质免疫印迹检测结果。泳道M:蛋白分子量标记；泳道IHPV52L1蛋白；泳道2HPV16L1蛋白；泳道3HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLP。结果显示HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLP与HPV52特异线性抗体21A5Western反应有特异性的条带。图9显示了实施例4中制备的HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLP与HPV52特异线性抗体12D10进行蛋白质免疫印迹检测结果。泳道M:蛋白分子量标记；泳道IHPV52L1蛋白；泳道2HPV16L1蛋白；泳道3HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLP。结果显示HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLP与HPV52特异线性抗体Western反应有特异性的条带。图10显示了实施例4中制备的HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428杂合VLP，突变体蛋白和HPVVLP热稳定性检测的结果。图11显示了实施例7中免疫不同阶段血清中和抗体滴度检测结果。结果表明根据实施例1-4所述方法获得的HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428、HPV52L1-C175A与HPV16L1-AC428杂合VLP具有良好的免疫原性，可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV16、HPV52的中和抗体。同时还产生针对HPV58、33、35的中和抗体。图12显示了实施例5中所述的HPV52L1-C175A与HPV16L1-AC428杂合VLP，HPV16L1-C175A与HPV6L1-AC428杂合VLP，HPV6L1-C175S与HPV16L1-AC428HPV6杂合VLP，HPV6L1-C175S与HPV52L1-AC428HPV52L1-C175S，HPV52L1-C175A与HPV6L1-AC428杂合VLP在储存缓冲液中的透射电镜观察结果(100，000倍，Bar=0.Iiim)。图12A，HPV52L1-C175A与HPV16L1-AC428杂合VLP；图12B,HPV16L1-C175A与HPV6L1-AC428杂合VLP;图12C,HPV6L1-C175S与HPV16L1-AC428HPV6杂合VLP；图12D,HPV6L1-C175S与HPV52L1-AC428杂合VLP;图12E，HPV52L1-C175A与HPV6L1-AC428杂合VLP。结果显示，视野中均可见大小较均一半径为25nm左右的病毒样颗粒。具体实施例方式现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Samtoook等人，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人,精编分子生物学实验指南,第3版,JohnWiley&Sons,Inc.,1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。实施例I.用于构建杂合病毒样颗粒的HPVLI突变蛋白的表达与纯化构津HPVLI突变蛋白表汰载体基因克隆采用定点突变PCR反应来进行，使用的初始模板包括PT0-I7-HPV16L1N30C质粒(在表I中简写为16L1)，pT0-I7-HPV52LlN40C质粒(在表I中简写为52L1)，PT0-T7-HPV6L1N5C质粒(在表I中简写为6L1)。各个PCR反应的模板、弓丨物见表1，PCR反应扩增条件设为94°C变性10分钟，25个循环的“94°C变性50秒，指定温度退火一定时间，72°C延伸50秒”，最后72°C延伸10分钟。所使用的PCR引物的序列列于表2。表I.构建突变HPVLI蛋白的各PCR反应条件表2:用于构建突变HPVLI蛋白的引物序列(SEQIDNO19-30)SEQIDNO:引物名称_引物序列_19HPV16L1-C175A-F5，TGWGCAAAGGATCCCCAAGTACCAATGTTGCAGTAAAT-3520HPV16L1-C175A-R5，-AnTACTGCAACATTGGTACTTGGGGATCCnTGCC-3’21HPV16L1-AC428-F5-ACATCCCAGGCAAITGCTCAAAAACATACACCT-3’22HPV16L1-AC428-R5，-AGGTGTATGTTTnGAGCMITGCCTGGGATGT-3’23HPV52L1-C175A-F5，GGCAAGGGCACCCCCGCCAACAACAACAGCGGCAAC-3，24HPV52L1-C175A-R5，GrTGCCGCTGTTGTTGITGGCGGGGGTGCCCTTGCC-3，25HPV52L1-AC428-F5，AGCACCGCCATCACCCAGAAGAACACCCCCCCCAAG~3，26HPV52L1-AC428-R5，CrrGGGGGGGGTGTTCITCTGGGTGATGGCGGTGCT-3，27HPV6L1-C175S-F5，TGGGGTAAAGGTAAACAGGCCACTMTACACCTGTACAG~328HPV6L1-C175S-R5，CTGTACAGGTGTAmGTGGCCTGnTACCTTTACCCCA-329HPV6L1-AC428-F5’CAGTCACAGGCCAITACCCAAAAGCCCACTCCTGAAAAG^30_HPY6L1-AC428-R5TTCAGGAGTGGGCmTGGGTAATGGCCTGTGACTG~3_PCR扩增得到产物(50uL)加入2uLDpnI限制性内切酶，在37°C处理60min。取IOuL转化40uL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)细菌，将其涂布于含卡那霉素(终浓度25mg/mL，下同)的固体LB培养基(LB培养基成分10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同)，并37°C静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管，在37°C220转/分钟下振荡培养10小时，从中取ImL菌液于_70°C保存。利用17引物，测得pT0_T7质粒中插入的目的片段的核苷酸序列分别为SEQIDN0:13、14、15、16、17、18，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO:4、5、6、7、8、9。权利要求1.包含两个或更多个不同型别的HPVLI蛋白的杂合病毒样颗粒，其中所述HPVLI蛋白在第175位与428位半胱氨酸发生置换和/或缺失。2.权利要求I的杂合病毒样颗粒，其中所述杂合病毒样颗粒包括来源于一种基因型的HPVL1-C175置换突变体和来自另一种不同基因型的HPVL1-C428缺失突变体。3.权利要求I的杂合病毒样颗粒，其中所述杂合病毒样颗粒包括来源于一种基因型的HPVL1-C428置换突变体和来自另一种不同基因型的HPVL1-C175缺失突变体。4.权利要求1-3任一项的杂合病毒样颗粒，其中所述HPVLI的置换突变体选自C175A置换突变体，C175S置换突变体，C428A置换突变体，C428S置换突变体。5.权利要求1-3任一项的杂合病毒样颗粒，其中所述HPVLI的缺失突变体选自AC175缺失突变体，AC428缺失突变体。6.权利要求1-5任一项的杂合病毒样颗粒，其中所述HPVLI蛋白突变体源自下列两种或更多种HPV基因型HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58和59，优选为HPV16,52和6，最优选为HPV16L1-C175A与HPV52L1-AC428、HPV52L1-C175A与HPV16L1-AC428、HPV16L1-C175A与HPV6L1-AC428、HPV52L1-C175A与HPV6L1-AC428、HPV6L1-C175S与HPV16L1-AC428或HPV6L1-C175S与HPV52L1-AC428杂合病毒样颗粒。7.权利要求1-6任一项的杂合病毒样颗粒，其中组装成杂合病毒样颗粒的两种不同型别的HPVLI蛋白的配比为I:1，2:I或I:2。8.制备权利要求1-7任一项的杂合病毒样颗粒的方法,包括a)在大肠杆菌中表达所述突变或缺失HPVLI蛋白，b)将表达所述突变或缺失HPVLI蛋白纯化，得到纯度95%以上的突变或缺失HPVLI蛋白，c)将b)纯化的突变或缺失的HPVLI蛋白按照I:I的摩尔比混合，透析去除还原剂，即得到杂合VLP;优选地，所述方法包括将所制备的杂合病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合，以制备用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病如宫颈癌的疫苗。全文摘要本发明涉及人乳头瘤病毒型别杂合病毒样颗粒及其制备方法。所述病毒样颗粒可用于预防两种或两种以上HPV感染及由HPV感染所导致的疾病。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染及由HPV感染所导致的疾病如宫颈癌、尖锐湿疣等。文档编号A61P31/20GK102747047SQ20121004712公开日2012年10月24日申请日期2012年2月28日优先权日2012年2月28日发明者夏宁邵,张军,李少伟,王大宁,顾颖,魏旻希申请人:厦门万泰沧海生物技术有限公司,厦门大学