专利名称：一种肝素钙化合物及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肝素钙化合物，尤其是低分子肝素钙，以及其制法，属于医药技术领域。
背景技术：
肝素钙，即低分子肝素钙或低分子量肝素钙，其化学名称硫酸氨基葡聚糖钙。抗血栓药物包括肝素类、非肝素抗血小板凝集药物、酶类及其他四个小亚类，肝素类和酶类基本上以生化药物为主。其中肝素类占有最大的市场份额，在肝素类中又以肝素类药物占主导，低分子肝素钙和低分子肝素钠分别占有整个抗血栓类药物20%和7%的市场份额。生物活性肝素自被发现虽已有80余年的历史，但由于到目前为止还没有一种能完全替代它的产品，所以它仍然是最重要的生化药物之一，其在临床的应用已有60余年的历史，它是预防手术后血栓形成和治疗急性静脉血栓的首选药物。除此之外，肝素或其衍生物还用于调血脂、抗炎、抗过敏以及免疫调节等方面。普通肝素是含多种氨基葡聚糖苷的混合物。肝素钙在体内外均能延缓或阻止血液凝固。其抗凝机理复杂，对凝血的各个环节均有作用，包括抑制凝血酶原转变为凝血酶、抑制凝血酶活性，妨碍纤维蛋白原转变为纤维蛋白、防止血小板聚集。肝素钙还可降低血脂， 改变血液粘稠度，改善冠状动脉循环等作用。肝素钙的抗FIIa作用较肝素钠强，抗FXa作用较肝素钠弱。由于其是以钙盐形式在体内发挥作用，经皮下注射后，在血液循环中缓慢扩散，不会减少局部细胞间毛细血管的钙胶质，也不改变血管通透性，几乎无肝素钠皮下注射可引起局部出血的副作用。适用于预防和治疗血栓-栓塞性疾病以及血栓形成。肝素钙还具有较明显的抗肾素和抗醛固酮活性，故亦适用于人工肾、人工肝和体外循环使用。近年来的研究发现，肝素钙还有调血脂、抗炎、抗补体、抗过敏、免疫调节等多种非抗凝方面的药理作用。CN101649008A公开了一种低分子量肝素钠盐的生产工艺，它是由以低分子量肝素钠粗品为原料生产低分子肝素钠的工艺，包括制备肝素钠溶液、降解液、中和液、收集沉淀物、制低分子肝素钠粗品、制低分子肝素钠精品等工艺步骤。但是这种制作过程只是常规的精制过程，效果不是很好。CN101519459A公开了一种低分子量肝素钠(钙)的生产工艺，包括取肝素钠溶液，加入亚硝酸钠溶液，进行裂解；碱调节裂解液，再用阴离子交换柱吸附杂质；洗涤，得到超低分子肝素钠(钙)；用超滤膜过滤，再用乙醇得到沉淀物；经脱盐，脱水后，再沉淀，经冷冻干燥后制得成品超低分子肝素钠(钙)；CN101012289A公开了一种肝素钙生产工艺。它是由低分子肝素钠转变而来，包括解聚、还原、转钙，过滤、浓缩等步骤。然而这些制备方法过程都过于繁琐，制作周期较长，不适合工业化生产。由于肝素钙在强碱环境和高温环境下容易发生破坏，更容易发生水解。因此，特别需要一种可以简单有效地精制肝素钙的理想方法，并提高制剂产品的质量。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种低分子肝素钙化合物及其纯化方法，可以简单有效地精制低分子肝素钙，适合于工业化大生产，而且方法简单，产品纯度高，并且提高了制剂产品的质量，减少了毒副作用。申请人:在现有文献的基础上，通过大量筛选实验，发现上述文献以及一般的纯化分离方法难于获得高纯度的化合物。本发明人经过长期认真的研究，意外发现了一种低分子肝素钙化合物的纯化方法，解决了目前合成的低分子肝素钙纯度低的缺点，不但工艺简单，操作方便，成本低，而且提高了纯度，保障了用药的安全性，减少了毒副作用。本发明方法可以用于低分子肝素钙制备的后处理过程，也可用于纯度不合格的低分子肝素钙粗品的纯化，包括以下步骤步骤1，将要纯化的低分子肝素钙溶于水中，充分搅拌下滴加非氧化还原性酸，直至溶液PH值约为1-4 ； 步骤2，加入活性炭吸附，搅拌，然后依次用板框和滤膜过滤，然后再将滤液用超滤膜超滤浓缩；步骤3，向浓缩液中加入氧化钙或氢氧化钙，剧烈搅拌，直至体系的pH值为6 7 ;步骤4，向溶液中加入中性氧化铝搅拌均匀，加到中性氧化铝制备型色谱柱上端进行分离纯化，收集洗脱液；步骤5，向洗脱液中加入乙醇，搅拌；步骤6,梯度降温,析出沉淀；步骤7，将沉淀真空干燥或在干燥剂上干燥，得到精制的低分子肝素钙。以下具体描述本发明。在本发明的步骤I中，将要纯化的低分子肝素钙溶于水中，充分搅拌下滴加非氧化还原性酸，直至溶液pH值约为1-4。本发明人发现，酸碱的选用以及其pH值的控制对产品的纯化和质量非常重要。步骤I中所述的酸优选不具有氧化还原性的酸，例如选自盐酸、乙酸、磷酸和硫酸中的一种， 优选盐酸，而不采用硝酸或甲酸，一般也不采用浓硫酸。加入酸至溶液的pH值为1-4，优选 2-3。在本发明步骤2中，加入活性炭吸附，搅拌，然后依次用板框和滤膜过滤，然后再将滤液用超滤膜超滤浓缩。活性炭的加入量为溶液总体积O. 1-0. 8% (g/ml)，优选O. 2-0. 5% (g/ml)的活性炭，保持温度为5-20°C，优选8-15°C，更优选10-12°C，搅拌15_240min，优选30_120min，更优选 45_60min。过滤所用的滤膜为O. 1-0. 5 μ m,优选O. 2-0. 4 μ m,更优选O. 3 μ m的滤膜，然后再将滤液用超滤膜超滤浓缩，所述超滤膜为8000-18000D，优选9000-15000D，更优选 10000-12000D的超滤膜，获得浓缩液。在本发明的步骤3中，向浓缩液中加入氧化钙或氢氧化钙，剧烈搅拌，直至体系的 pH值为6 7。无论是氢氧化钙还是能够与水形成氢氧化钙的氧化钙，都有助于体系的pH值升高，而且也不会增加含有低分子肝素钙体系中除钙以外的其他阳离子，因此避免了不同于钙离子的其他阳离子的分离过程。在本发明的步骤4中，向溶液中加入中性氧化铝搅拌均匀，加到中性氧化铝制备型色谱柱上端进行分离纯化，收集洗脱液。本申请人经过长期认真的大量研究，分离纯化过程中，筛选了硅胶、氧化铝或大孔树脂等各种填料色谱柱，例如硅胶的粒径为45-250 μ m、孔径为80-100Α的硅胶；氧化铝或中性氧化铝粒径为18-200 μ m的氧化铝或中性氧化铝，大孔树脂型号为AmberliteXAD-6、 AmberliteXAD-7、AmberliteXAD-8、Diaion HP2MG、⑶X-501、HPD400、HPD450、HPD750、 AmberliteXAD-9、AmberliteXAD-10、⑶X-401、⑶X-601等大孔树脂，本发明人意外发现应用大孔树脂对产品的纯度并没有明显改善，硅胶也不理想，而专用的中性氧化铝不仅可以充分吸附上柱物中的成分杂质及其它色素，还对本品纯化有着独到的意外效果，而且操作较简易。所述制备型色谱柱的固定相为粒径为18-200 μ m,孔径约6nm的细孔中性氧化铝。 所述中性氧化铝可以例如为供应商ICN的ICN alIumina N优选粒径为18-63 μ m，孔径为 6nm的细孔中性氧化铝，pH 7. 0，优选粒径为18-32 μ m,孔径为6nm的细孔中性氧化铝，pH
7.O。或者，中性氧化铝例如为供应商Baker柱层析专用中性氧化铝，粒径为50-200 μ m,孔径为 6nm, pH 7. O 或 pH 6· 5。每次纯化药物的质量与色谱柱填料的质量之比为I : 10-200，优选质量比为 I 15-100。流动相的用量只要满足将药物基本上完全洗脱即可，洗脱后的流分分段收集， 不同段的流分中药物的含量不同，为了获得高纯度的药物(例如纯度大于99. 5% )，需将药物含量大于90%的流分合并，优选将药物含量大于95%的流分合并。在本发明方法中得到所需纯度的低分子肝素钙在某种程度上依赖于杂质的种类及其相对含量和色谱柱的操作环境。在流动相中有机溶剂的选择和用量必须是可控的，使得不会过早地把杂质洗脱出来。一般而言，本发明所用色谱柱的色谱柱包括直径为约O. I 至约20cm，优选为至少3cm。此方法中色谱柱长度范围优选为约10厘米至约100厘米，更优选长度范围为约20厘米至约30厘米，最优选的长度为25厘米。在本发明的制备方法中，以上述中性氧化铝为色谱柱固定相填料，以O. 5
5.OmoI/L硫酸调O. I lmol/L硫酸钠溶液pH至4. O 6. 0，优选5. O,作为流动相。流动相的流速为 O. 2-2. Oml/min,优选 O. 5 I. Oml/min。在本发明的步骤5中，向洗脱液中加入乙醇，搅拌。我们研究发现，对于低分子肝素钙，采用常用的单一溶剂中回流或降温重结晶或悬浮于溶剂中回流搅拌的方法，要么难于结晶，要么析出后杂质含量较高。根据本发明，在步骤5中使用的乙醇具有这样的特点，其降低了低分子肝素钙在洗脱液中的溶解度，使得乙醇中溶解性不好的低分子肝素钙能够从溶液中析出，同时乙醇还能溶解洗脱液中微量存在的有机性杂质物质，达到进一步纯化低分子肝素钙的目的。乙醇的加入量一般为洗脱液体积的50%至2倍，优选为洗脱液体积的80%至I. 2 倍，更优选为洗脱液体积的I倍左右。在本发明的步骤6中，梯度降温，析出沉淀。该步骤中所述的梯度降温是指从体系所处的环境温度开始降低到大于0°C的温度，从而有利于低分子肝素钙的析出。
根据本发明，在梯度降温过程中，在I小时内将温度由室温降至15_18°C，然后在 I至3小时内将温度降至10-12°C，最后在2至10小时内，优选5至8小时内将温度降至
0-81，优选2-61，更优选3-51。在此过程中不断有低分子肝素钙析出，直至不再出现析出物为止。令人惊讶地，经过本发明上述处理之后，获得纯度极高的低分子肝素钙。其原因可能是本发明之前的处理步骤已经去除了对产生沉淀有不利影响的杂质性物质，并影响到最终肝素钙体系的沉淀环境。在本发明的步骤7中，将沉淀真空干燥或在干燥剂上干燥，得到精制的低分子肝素钙。为了避免在较高温度下肝素钙发生分解或变性，所述真空干燥一般是在25 30°C下在真空下进行干燥。所述固体干燥剂选自无水硫酸镁、无水氯化钙、无水硫酸钙和活性氧化铝中的一种，优选无水氯化钙。为了避免吸湿，不应采用晾干方式。本发明所述的肝素钙化合物的精制方法，可以得到纯度(肝素钙纯度检测方法可参见新药转正标准第66册，肝素钙第176页)不低于99. 7%的肝素钙精制品，为白色粉末， 取纯化后的低分子肝素钙加水制成每Iml中含50mg的溶液，溶液澄清无色。本发明从根本上改变了国内外低分子肝素钙原料纯度较低的现状，解决了粗制低分子肝素钙或其原料药面临的难题，改善了由于杂质较多引发的一系列临床不良反应。保证了肝素钙的产品质量，减少了毒副作用，该方法简单易操作，适合于工业化生产。本发明另一方面还涉及根据本发明方法制备的低分子肝素钙在制备抗凝血药物中的应用，其特征在于所述成品的肝素钙抗Xa因子效价80-150IU/mg，pH值为4-7. 5， Xa/ II a 比值为 I. 5-4. 5。鉴于低分子肝素钙的粉末流动性、特性溶出速率、固体稳定性以及制备可操作性对其活性的发挥以及所配制的制剂的影响巨大，而纯度得到大幅提高的低分子肝素钙在溶出速率、可配制性以及稳定性方面也相应明显改善。
具体实施例方式以下通过具体实施方式
进一步解释或说明本发明内容，但实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。实施例I取IOg按CN101012289A的方法处理过的低分子肝素钙粗品，经检测其HPLC纯度为93. 68%，将其溶于200mL水中，充分搅拌使其溶解，然后在搅拌下滴加I. OM的盐酸，直至溶液PH值约为2.5 ;加入Ig活性炭吸附，保持温度为10-12°C，搅拌50min，然后依次用板框和O. 3 μ m滤膜过滤，然后再将滤液用10000D超滤膜超滤浓缩；向浓缩液中加入氧化钙， 剧烈搅拌，直至体系的PH值约为6. 8。向溶液中加入IOg中性氧化铝搅拌均匀，然后加到制备型中性氧化铝色谱柱上端，固定相填料为粒径50-200 μ m孔径6nm的Baker柱层析专用中性氧化招，pH 7. O,以
O.8mol/L硫酸调O. 5mol/L硫酸钠溶液pH至5. O,作为流动相，流速为2. Oml/min,柱温 20°C，收集洗脱液。向洗脱液中加入等体积的乙醇，搅拌；在I小时内将温度由室温降至16_18°C，然
7后在I小时内将温度降至11_13°C，最后在2至3小时内将温度降至4-5°C。在此过程中不断有肝素钙析出，直至不再出现析出物为止，在30°C下真空干燥，得到肝素钙89. 4g，为白色粉末，HPLC纯度为99. 70%。取纯化后的低分子肝素钙加水制成每Iml中含50mg的溶液，溶液澄清无色。实施例2取IOg低分子肝素钙原料药(生产厂家为山东博士伦福瑞达制药有限公司，批号 20100103)，经检测其HPLC纯度为96. 52%。将其溶于200mL水中，充分搅拌使其溶解，然后在搅拌下滴加I. OM的硫酸，直至溶液pH值约为3. 5 ;加入I. 5g活性炭吸附，保持温度为 12-14°C,搅拌60min，然后依次用板框和O. 4 μ m滤膜过滤,然后再将滤液用12000D超滤膜超滤浓缩；向浓缩液中加入氢氧化钙，剧烈搅拌，直至体系的PH值约为6. 5。向溶液中加入15g中性氧化铝搅拌均匀，然后加到制备型中性氧化铝色谱柱上端，固定相填料为粒径18-63 μ m,孔径为6nm的ICN alIumina N细孔中性氧化铝，pH 6. 5， 以I. OmoI/L硫酸调I. OmoI/L硫酸钠溶液pH至5. 5，作为流动相，流速为O. 8ml/min,柱温 18 °C，收集洗脱液。向洗脱液中加入为洗脱液体积I. 2倍的乙醇，搅拌；在I小时内将温度由室温降至17-19°C，然后在2小时内将温度降至12-14°C，最后在3至4小时内将温度降至2_4°C。 在此过程中不断有肝素钙析出，直至不再出现析出物为止，在25°C下真空干燥，得到肝素钙 92. 5g，为白色粉末，HPLC纯度为99. 78%。取纯化后的低分子肝素钙加水制成每Iml中含 50mg的溶液，溶液澄清无色。实施例3取IOg过期的低分子肝素钙原料药，经检测其HPLC纯度为89. 56%。将其溶于 300mL水中，充分搅拌使其溶解，然后在搅拌下滴加2. OM的盐酸，直至溶液pH值约为2. 5 ； 加入2. Og活性炭吸附，保持温度为12-14°C，搅拌120min，然后依次用板框和O. 5 μ m滤膜过滤，然后再将滤液用12000D超滤膜超滤浓缩；向浓缩液中加入氧化钙，剧烈搅拌，直至体系的pH值约为6.0。向溶液中加入20g中性氧化铝搅拌均匀，然后加到制备型中性氧化铝色谱柱上端，固定相填料为粒径18-32 μ m孔径为6nm的ICN alIumina N中性氧化铝，pH 6. 5，以
2.OmoI/L硫酸调O. 8mol/L硫酸钠溶液pH至4. 5，作为流动相，流速为I. Oml/min,柱温 20°C，收集洗脱液。向洗脱液中加入为洗脱液体积I. 5倍的乙醇，搅拌；在I小时内将温度由室温降至 17-18 °C，然后在3小时内将温度降至12-14°C，最后在4至5小时内将温度降至2_5 V。在此过程中不断有肝素钙析出，直至不再出现析出物为止，无水氯化钙干燥，得到肝素钙84. 5g， 为白色粉末，HPLC纯度为99. 60%。取纯化后的低分子肝素钙加水制成每Iml中含50mg的溶液，溶液澄清无色。根据上述的实施例对本发明作了详细描述，并且本发明通过与之相关的对比实施例证实本发明取得了令人意外的优异效果。需说明的是，以上的实施例仅仅为了举例说明本发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。本申请所引用的各个参考文献，在此全文引入作为参考。
权利要求
1.一种肝素钙化合物，其特征在于，其制法包括如下步骤步骤1，将要纯化的低分子肝素钙溶于水中，充分搅拌下滴加非氧化还原性酸，直至溶液PH值约为1-4 ；步骤2，加入活性炭吸附，搅拌，然后依次用板框和滤膜过滤，然后再将滤液用超滤膜超滤浓缩；步骤3，向浓缩液中加入氧化钙或氢氧化钙，剧烈搅拌，直至体系的pH值为6 7 ;步骤4，向溶液中加入中性氧化铝搅拌均匀，加到中性氧化铝制备型色谱柱上端进行分离纯化，收集洗脱液；步骤5，向洗脱液中加入乙醇，搅拌；步骤6,梯度降温,析出沉淀；步骤7，将沉淀真空干燥或在干燥剂上干燥，得到精制的低分子肝素钙。
2.根据权利要求I所述制法，其特征在于，步骤I中，所述酸选自盐酸、乙酸、磷酸和硫酸中的一种，优选盐酸，加入酸至溶液的PH 值为1-4，优选2-3。
3.根据权利要求I或2所述的制法，其特征在于，步骤2中，活性炭的加入量为溶液总体积O. 1-0. 8 % (g/ml)，优选O. 2-0. 5% (g/ ml)的活性炭，保持温度为5-20°C，优选8-15°C，更优选10_12°C，搅拌15_240min，优选 30-120min,更优选 45_60min。
4.根据权利要求I至3之一所述的制法，其特征在于，步骤2中，滤膜为O. 1-0. 5 μ m,优选O. 2-0. 4 μ m,更优选O. 3 μ m的滤膜，超滤膜为 8000-18000D，优选 9000-15000D，更优选 10000-12000D 的超滤膜。
5.根据权利要求I至4之一所述的制法，其特征在于，步骤4中，所述制备型色谱柱的固定相为粒径为50-200 μ m，孔径为6nm，pH 7. O或pH 6. 5的Baker柱层析专用中性氧化招或粒径为18-32 μ m,孔径为6nm的ICN al Iumina N细孔中性氧化铝。
6.根据权利要求I至5之一所述的制法，其特征在于，步骤5中，乙醇的加入量一般为洗脱液体积的50%至2倍，优选为洗脱液体积的80% 至I. 2倍，更优选为洗脱液体积的I倍左右。
7.根据权利要求I至6之一所述的制法，其特征在于，步骤6中，在梯度降温过程中，在I小时内将温度由室温降至15-18°C，然后在I至3小时内将温度降至10-12°C，最后在2至10小时内，优选5至8小时内将温度降至0_8°C，优选2-6 °C，更优选3-5 °C。
8.根据权利要求I至7之一所述的制法，其特征在于，步骤7中，真空干燥一般是在25 30°C下在真空下进行干燥，所述固体干燥剂选自无水硫酸镁、无水氯化钙、无水硫酸钙和活性氧化铝中的一种，优选无水氯化钙。
9.根据权利要求I至8之一所述的制法制备的高纯度低分子肝素钙，其纯度大于 99. 7%，为白色粉末，取纯化后的低分子肝素钙加水制成每Iml中含50mg的溶液，溶液澄清无色。
10.根据权利要求I至8之一所述的制法制备的低分子肝素钙或根据权利要求9的高纯度低分子肝素钙在制备药物中的用途，所述药物优选抗凝血药物。
全文摘要
本发明公开了一种肝素钙化合物及其制法，该制法包括将低分子肝素钙粗品溶于水中，搅拌下滴加非氧化还原性酸；加入活性炭吸附，然后过滤，再将滤液用超滤膜超滤浓缩；向浓缩液中加入氧化钙或氢氧化钙，剧烈搅拌；向溶液中加入中性氧化铝搅拌均匀，加到中性氧化铝制备型色谱柱上端进行分离纯化，收集洗脱液；向洗脱液中加入乙醇；梯度降温，析出沉淀；将沉淀干燥，得到精制的低分子肝素钙。该方法工艺简单，操作方便，成本低，适合于规模化生产，而且提高了低分子肝素钙化合物的纯度，保障了其在抗凝血药物中的安全性，提高了制剂产品质量，减少了毒副作用。
文档编号A61P7/02GK102603923SQ201210052448
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者赵雁鸿, 陶灵刚 申请人:海南灵康制药有限公司