专利名称：胸腺素α原在制备预防和治疗肝癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及胸腺素α原，尤其是涉及一种胸腺素α原在制备预防和治疗肝癌药物中的用途。
背景技术：
1984年，Haritos等从大鼠胸腺分离出一种含有111个氨基酸残基的多肽，由于其N端含已发现的所有胸腺素α原家族成员的序列，因此命名为胸腺素α原。人ProTa 由109个氨基酸残基组成，与大鼠ProT α的序列相比，有6个位点的差异，包括4个位点的替代和 2 个位点的缺失(I、Haritos AA, Goodall GJ, Horecker BL, Prothymosin alpha isolation and properties of the major immunoreactive form of thymosin alphal in rat thymus. Proc Natl Acad Sci U S A，1984,81 :1008 ;2、Haritos AA. Alpha-thymosins relationships in structure，distribution，and function. Isozymes Curr Top Biol Med Res 1987，14 :123-152 ;3、Goodall GJjDominguez FiHorecker BL. Molecular cloning of cDNA for human prothymosin alpha. Proc Natl Acad Sci USA 1986 ；83 (23) 8926-8928 ;4、Pan LXiHaritos AAiWideman JiKomiyama T,Chang M,Stein S et al. Human prothymosin alpha amino acid sequence and immunologic properties.Arch Biochem Biophys 1986 ；250(1) :197-201) 1985 年，Haritos 等(5、Komiyama T，Pan LX, Haritos AA, et al. The primary structure of rat parathymosin. Proc Natl Acad Sci USA 1986 ；83 (5) :1242-1245) 发现大鼠ProTA能增强小鼠抗白色念珠菌(Candida albicans)感染的能力，1986年Pan又发现Ρι Τ α能剌激转移抑制因子(MIF)的释放，其作用比Ta I强10 20倍(6.Haritos AA,r.Blacher,S. Stein,J. . Horecker. Parathymosin alpha a peptide from rat tissues with structural homology to prothymosin alpha. Proc Natl Acad Sci U S A，82: 1050-1053 ;7、Pan LX, Haritos AA, Wideman J，et al. Human prothymosin alpha amino acid sequence and immunologic properties.Arch Biochem Biophys 1986 ；250 (I) 197-201)，1987年，S a Ivin等发现腹腔注射ProT α能增强RF/J小鼠产生抗体的能力，锌能加强这种作用，能使青年大鼠和老年大鼠的细胞免疫和体液免疫都增强(8、Salvin SB， Horecker BL, Pan LX, Rabin BS.The effect of dietary zinc and prothymosin alpha on cellular immune responses of RF/J mice. Clin Immunol Immunopathol 1987 ； 43(3) :281_2880 )。Papanastasiou (9、Papanastasiou M, Baxevanis CN，Papamichail M. Promotion of murine antitumor activity by prothymosin alpha treatment I.Induction of tumoricidal peritoneal cells producing high levels of tumour necrosis factor alpha. Cancer Immunol Immunother 1992 ；35 (2) :145_150o )发现， CBA/2小鼠如果腹腔接种肿瘤细胞，一般8-12天之内产生腹水，10-14天后死亡，20 %的经过ProTa处理的小鼠不产生腹水，并能够使不产生腹水中的40% -60%的小鼠寿命可以延长到70天。当腹腔注射ProTa时，能够增强巨噬细胞、提高N K，LA K细胞的活性(10、Lopez-Rodriguez JL, Cordero OJ, Sarandeses C，. Interleukin-2 killer cells in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha. Lymphokine Cytokine Res 1994 ；13 (3) :175-182 ；1K Baxevanis CN, Gritzapis AD, Dedoussis GV, . Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1994 ；38 (4) :281-286);增强 MHC 限制的细胞免疫(12、Baxevanis CN,Thanos D，Reclos GJ,J et al. Prothymosin alpha enhances human and murine MHC class II surface antigen expression and messenger RNA accumulation. J Immunol 1992 ；148 (7) :1979-1984 ;13、Baxevanis CN, Thanos D，Reclos GJ, et al. Prothymosin alpha enhances human and murine MHC class II surface antigen expression and messenger RNA accumulation. J Immunol 1992; 148 (7) : 1979-1984)，抑制系统性红斑狼疮(14、Baxevanis CN, Reclos CJ, Papamichail M et al. Prothymosin alpha restores the depressed autologous and allogenic mixed lymphocyte responses in patient with systemic lupus erythematosus. Immuopharmaco immunotoxico，1987，9 :429。)，促进IL-2，MIF的分泌和TN F-α，IFN-Y的合成；促进IL-2受体的表达(15.Baxevanis CN， Gritzapis AD, Spanakos G，. Induction of tumor-specific T lymphocyte responses in vivo by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1995 ；40 (6) :410-418; 16、Lopez-Rodriguez JL, Cordero OJ, Sarandeses C，. Interleukin-2 killer cells in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha. Lymphokine Cytokine Res 1994 ；13 (3) :175-182 ;17、Baxevanis CN, Gritzapis AD, Dedoussis GV, . Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1994 ；38 (4) :281-286 ;18、Voutsas IF，Baxevanis CN, Gritzapis AD, et al. Synergy between interleukin-2 and prothymosin alpha for the increased generation of cytotoxic T lymphocytes against autologous human carcinomas. Cancer Immunol Immunother 2000 ；49 (8) :449-458 ; 19、Cordero OJ, Sarandeses CS， Lopez JL, et al. Prothymosin alpha enhances IL_2receptor expression in norma human T-lymphoctyes. Int J Immunpharmacol, 1991,13 1059o )，从而产生非特异性肿瘤杀伤作用，同时，诱导肿瘤特异性细胞毒T细胞(CD8+)和辅助性T细胞(CD4+)的特异性抗肿瘤作用。ProTa在疾病早期可以剌激淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokien activated killer cells, LAK)活性，它是通过增加淋巴细胞与靶细胞的结合进而增加IFN-Y和IL-2 的分泌来实现的(20、Lopez-Rodriguez 几，Cordero OJ, Sarandeses C，. Interleukin-2 killer cells in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha. Lymphokine Cytokine Res 1994 ；13 (3) : 175-182 ;21、Baxevanis CN, Gritzapis AD, Dedoussis GV, . Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1994 ；38 (4) :281-286)。单独使用 ProTa时可以剌激TNF-a和IL_2的分泌，如果与IL_2联合使用时，可增加NK细胞CD25及 ⑶18/11黏附分子的表达。在IFN-Y存在的条件下，PiOTa主要通过增加⑶54(细胞黏附分子配体)的表达，剌激单核细胞与集结的肿瘤细胞的结合，达到清除肿瘤细胞的目的(22、 Baxevanis CN,Gritzapis AD,Spanakos G,. Induction of tumor-specific T lymphocyte responses in vivo by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1995 ；40 (6)410-418 ;23、Lopez-Rodriguez JL, Cordero OJ, Sarandeses C，. Interleukin-2 killer cells in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha. Lymphokine Cytokine Res 1994 ；13 (3) :175-182 ;24、Baxevanis CN, Gritzapis AD, Dedoussis GV,. Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunotherl994 ;38 (4) :281-286 ;25、Voutsas IF, Baxevanis CN, Gritzapis AD, et al. Synergy between interleukin-2 and prothymosin alpha for the increased generation of cytotoxic T lymphocytes against autologous human carcinomas. Cancer Immunol Immunother 2000,49(8) :449-458) 近来研究表明，ProTa 在DNA疫苗中还可以起到疫苗佐剂的效果(26、Jin Y，Cao C，Li P，Liu X，Huang W，Li C et al. Boosting immune response to hepatitis B DNA vaccine by coadministration of Prothymosin alpha-expressing plasmid. Clin Diagn Lab Immunol 2005 ；12 (12) 1364-1369 ;27、Shiau ALiChen CC,Yo YT,Chu CYiWang SY,Wu CL.Enhancement of humoral and cellular immune responses by an oral Salmonella choleraesuis vaccine expressing porcine prothymosin alpha. Vaccine 2005 ;23 (48-49) :5563_5571。)。但是目前还没有任何关于胸腺素α原通过抑制调节性T淋巴细胞活性的途径来预防和治疗肝癌相关的报道。
发明内容
本发明的第一目的在于提供胸腺素α原在抑制调节性T淋巴细胞活性中的用途。本发明的第二目的在于提供胸腺素α原在制备预防和治疗肝癌药物中的应用。以下给出重组人前胸腺素α原的制备方法从健康中国人外周血淋巴细胞通过提取RNA后，采用RT-PCR的方法获得中国人特有胸腺素α原cDNA，利用基因工程技术体外重组包含胸腺素α原基因的重组表达载体，再将表达载体转入原核细胞大肠杆菌中进行克隆表达纯化获得重组胸腺素α原蛋白。详细过程参见中国专利(ZL2008. 10072084. 4 ;发明人周克夫等)以下给出胸腺素α原在肝癌预防和治疗中的功能实验1)Η22原位肝癌小鼠模型的制备选择腹腔接种Η22后15d，生长状况良好的荷瘤鼠，从腹腔用一次性注射器无菌吸取腹水，以生理盐水稀释细胞，洗涤2次，再用生理盐水稀释细胞数为8X IO6个/ml，活细胞计数大于95%，取O. 2ml瘤细胞悬液接种于小鼠右腋皮下。于接种7 8日皮下肿瘤长至0.3 O. 4cm大小后，分离肿瘤组织，无菌条件下剪成 O. 5mm大小的组织。2)将30只小鼠无菌条件下进行开腔手术，露出部分肝脏，用针头将肿瘤组织推进肝脏随即用生物胶封闭开口，再将腹腔缝合。3)实验分组将30只经过手术的原位移植肝癌小鼠模型混匀后，再按A，B，C，D四组每组10只分笼饲养。A，B组为用药组，腹腔注射胸腺素α原剂量分别为150 μ g/只和 300 μ g/只。C组为对照组注射同样剂量的生理盐水，另外选择同样大小的10只小鼠为正常对照组，不移植肿瘤但同样注射生理盐水。每3天测体重I次。实验以21天为周期。4)指标测定实验结束后分离肝肿瘤称重，并测量腹水体积。5)小鼠脾脏调节性T淋巴细胞的检测
(I)无菌分离小鼠脾脏，用无菌针管头部研磨后用200，300目过滤膜过滤，过滤液在氯化铵溶液作用下去除红细胞获得淋巴细胞溶液。(2)用淋巴细胞分离液分离获得纯淋巴细胞。(3)应用检测调节性T淋巴细胞的荧光抗体，⑶4，⑶25，⑶127-FITC分别标记进行三色染色后，上流式细胞仪分析记录结果。同时用同型作为阴性对照。可采用外科手术方法成功建立体内移植肝癌H22模型。采用腹腔注射胸腺素α原，观察该重组蛋白在预防及治疗肝癌中的作用，包括肝肿瘤的大小以及防止腹水的形成。经过胸腺素α原的注射治疗和预防，能够明显抑制肝肿瘤的生长同时能够减少腹水的形成。通过检测小鼠脾脏调节性T淋巴细胞的水平，证明肝癌对照组脾脏调节性T淋巴细胞的水平明显比正常小鼠脾脏调节性T淋巴细胞的水平高差异极显著(P <0.01)； 而用药组调节性T淋巴细胞的水平则明显比正常对照组和实验对照组低，差异极显著(P
<O. 01)。实验结果发现，重组胸腺素α原能够明显抑制体内小鼠肝癌Η22的生长，通过分析小鼠脾脏调节性T淋巴细胞水平，进一步证实该作用的机理是通过下调小鼠脾脏调节性 T淋巴细胞水平，从而解除对小鼠免疫功能的抑制条件，调动机体正常自身免疫功能，达到抑制体内肿瘤细胞生长的目的。结果分析证明，重组人前胸腺素α原在预防和治疗体内肝癌具有明显作用，效果显著。并且明确阐明其中作用机理。因此，利用该蛋白能够用于预防和治疗肝癌的发生和发展。对于开发相应的预防和治疗药物具有重要意义。由此可见，胸腺素α原可用于抑制调节性T淋巴细胞活性，并且可在制备预防和治疗肝癌药物中应用。所述胸腺素α原包括所有哺乳动物提取的胸腺素α原以及基因工程表达的胸腺素α原。所述肝癌包括各型肝癌。所述药物包括口服药物、皮下注射药物和腹腔注射药物等。
图I为ProT α体内抑制小鼠肝癌细胞Η22 (原位移植型)的作用(Kl Κ3代表正常小鼠肝脏；C1 C3代表对照组小鼠肝脏及生长的肿瘤；T1 T3用药组小鼠肝脏及生长的肿瘤)。图2为ProT α体内抑制小鼠肝癌细胞Η22 (原位移植型)的效果分析(K代表正常小鼠肝脏；c代表对照组小鼠肿瘤克数；τ用药组小鼠肿瘤克数；*代表显著性差异)。图3为流式细胞仪分析图，Rl代表圈定的淋巴细胞，横坐标FS代表(forword scatter)前向散射光；纵坐标ss代表侧向散射光(side scatter)。图4为流式细胞仪分析图，R2代表⑶4+/⑶127表达的细胞；横坐标 FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表异硫氰酸突光素标记的二抗；Q)4 :代表白细胞分化抗原；纵坐标PE-⑶127 :代表PE染色的荧光二抗。
图5为流式细胞仪分析图，R3代表CD25表达的细胞。横坐标FITC (Fluorescein Isothiocyanate),代表异硫氰酸突光素标记的二抗KD4 :代表白细胞分化抗原；纵坐标 PRP-CY5-CD25代表白细胞分化抗原图6为流式细胞仪分析图，同型阴性对照，横坐标代表FITC (Fluorescein Isothiocyanate),异硫氰酸突光素标记的二抗；CT4 :代表白细胞分化抗原。纵坐标 PRP-CY5-CD25代表白细胞分化抗原图7为流式细胞仪分析图，正常小鼠I调节性T淋巴细胞表达情况；横坐标 FITC (Fluorescein Isothiocyanate),代表异硫氰酸突光素标记的二抗；0)4 :代表白细胞分化抗原。纵坐标PRP-CY5-⑶25代表白细胞分化抗原。图8为流式细胞仪分析图，正常小鼠2调节性T淋巴细胞表达情况；横坐标 FITC (Fluorescein Isothiocyanate),代表异硫氰酸突光素标记的二抗；0)4 :代表白细胞分化抗原。纵坐标PRP-CY5-⑶25代表白细胞分化抗原。图9为流式细胞仪分析图，正常小鼠3调节性T淋巴细胞表达情况；横坐标 FITC (Fluorescein Isothiocyanate),代表异硫氰酸突光素标记的二抗；0)4 :代表白细胞分化抗原。纵坐标PRP-CY5-⑶25代表白细胞分化抗原。图10为流式细胞仪分析图，对照组小鼠I调节性T淋巴细胞表达情况；横坐标 FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表异硫氰酸突光素标记的二抗；0)4 :代表白细胞分化抗原。纵坐标PRP-CY5-⑶25代表白细胞分化抗原。图11为流式细胞仪分析图，对照组小鼠2调节性T淋巴细胞表达情况；横坐标 FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表异硫氰酸突光素标记的二抗；0)4 :代表白细胞分化抗原。纵坐标PRP-CY5-⑶25代表白细胞分化抗原。图12为流式细胞仪分析图，对照组小鼠3调节性T淋巴细胞表达情况；横坐标 FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表异硫氰酸突光素标记的二抗；0)4 :代表白细胞分化抗原。纵坐标PRP-CY5-⑶25代表白细胞分化抗原。图13为流式细胞仪分析图，用药组小鼠I调节性T淋巴细胞表达情况；横坐标 FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表异硫氰酸突光素标记的二抗；0)4 :代表白细胞分化抗原。纵坐标PRP-CY5-⑶25代表白细胞分化抗原。图14为流式细胞仪分析图，用药组小鼠2调节性T淋巴细胞表达情况；横坐标 FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表异硫氰酸突光素标记的二抗；0)4 :代表白细胞分化抗原。纵坐标PRP-CY5-⑶25代表白细胞分化抗原。图15为流式细胞仪分析图，用药组小鼠3调节性T淋巴细胞表达情况；横坐标 FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表异硫氰酸突光素标记的二抗；0)4 :代表白细胞分化抗原。纵坐标PRP-CY5-⑶25代表白细胞分化抗原。图16为用药组、对照组及正常小鼠脾脏调节性T淋巴细胞表达情况比较分析图(K 代表正常小鼠，C代表对照组，Tl代表使用胸腺素α原组小鼠；Treg/Rl，代表调节性T淋巴细胞与所有淋巴细胞总数的比值，*代表显著性差异；**代表极显著差异；***代表极显著差异)。从以上附图的结果发现，重组胸腺素α原能够明显抑制体内小鼠肝癌Η22的生长，通过分析小鼠脾脏调节性T淋巴细胞水平进一步证实该作用的机理是通过下调小鼠脾脏调节性T淋巴细胞水平，从而解除对小鼠免疫功能的抑制条件，调动机体正常自身免疫功能。达到抑制体内肿瘤细胞生长的目的。综合以上结果分析证明重组人前胸腺素α原在预防和治疗体内肝癌具有明显作用，效果显著。并且明确阐明其中作用机理。因此，利用该蛋白能够用于预防和治疗肝癌的发生和发展。对于开发相应的预防和治疗药物具有重要意义。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。实施例所采用的材料与方法说明如下。I.实验取材重组人前胸腺素α原制备从健康中国人外周血淋巴细胞通过提取RNA后，采用 RT-PCR的方法获得中国人特有胸腺素α原cDNA，利用基因工程技术体外重组包含胸腺素 α原基因的重组表达载体，再将表达载体转入原核细胞大肠杆菌中进行克隆表达纯化获得重组胸腺素α原蛋白。详细过程可参见中国专利(ZL2008. 10072084. 4 ;发明人周克夫等)。试验动物为昆明种小鼠，SPF级，(20±2)g，6_7周龄，雄性，厦门大学实验动物中心提供，合格证号0501452。肿瘤种鼠由厦门大学医学院实验动物中心提供。CD4 FITC(rat anti-mouse) ；CD25 PERCP-CY5. 5(rat anti-mouse) ；CD127 PE(rat anti-mouse);同型IGG2A FITC Control突光单抗均购自BD公司。2.实施方法2. I肿瘤抑制率实验重组人前胸腺素α原蛋白抑制小鼠肝癌Η22及抑制调节性T淋巴细胞活性实验， 选择腹腔接种Η22后15d，生长状况良好的荷瘤鼠，从腹腔用一次性注射器无菌吸取腹水， 以生理盐水稀释细胞，洗涤2次，再用生理盐水稀释细胞数为8X IO6个/ml，活细胞计数大于95%,取0. 2ml瘤细胞悬液接种于小鼠右腋皮下。于接种7 8日皮下肿瘤长至0. 3 0. 4cm大小后，分离肿瘤组织，无菌条件下剪成0. 5mm大小的组织，同时将30只小鼠无菌条件下进行开腔手术，露出部分肝脏，用针头将肿瘤组织推进肝脏随即用生物胶封闭开口，再将腹腔缝合。将30只经过手术的原位移植肝癌小鼠模型混匀后，再按A，B, C，D 4组每组 10只分笼饲养。A，B组为用药组，腹腔注射胸腺素原剂量分别为150 μ g/只和300 μ g/只。 C组为对照组注射同样剂量的生理盐水，另外选择同样大小的10只小鼠为正常对照组，不移植肿瘤但同样注射生理盐水。每3天测体重I次。实验以21天为周期。实验结束之后解剖小鼠分离肝脏肿瘤并测肿瘤重量。统计分析采用Graph prime统计软件分析,显著性差异按(P < 0. 05);差异极显著按(P < 0. 01) ο结果见图I和图2，从图中可以看出用药组肿瘤重量明显比对照组小，差异显著(P
<0. 05)2. 2胸腺素原对小鼠脾脏调节性T淋巴细胞的影响将以上实验分离获得的小鼠脾脏，经研磨和200目尼龙网和300目尼龙网过滤后， 采用小鼠淋巴细胞分离液分离获得脾脏淋巴细胞，用2%多聚甲醛的PBS液中(4%)。再按进行荧光抗体作用后采用流式细胞仪进行三色染色，分别检测出正常小鼠脾脏，用药组和对照组脾脏调节性T淋巴细胞的比率。代表调节性T淋巴细胞的流式细胞分析结果见图3(为淋巴细胞)、图4(CD4+/ ⑶127表达的细胞)、图5 (⑶25表达的细胞)；采用无抗体的同型阴性对照图见图6以正常小鼠脾脏分离的调节性T淋巴细胞见图7 9，可以看出正常小鼠调节性T 淋巴细胞均能够检测到；移植性肝癌小鼠脾脏调节性T淋巴细胞见图10 12，从图中看出肝癌对照组调节性T淋巴细胞的表达量明显比正常组高，差异极显著(P < O. 01)。同样移植性肝癌小鼠，但用胸腺素α原进行干预，其脾脏中的调节性T淋巴细胞的水平见图13 15，从图中看出，其水平明显比肝癌对照组低。差异极显著(P <0.01)三组小鼠调节性T淋巴细胞的结果比较分析图见图16，从图中看到，正常小鼠调节性T淋巴细胞水平适中，对照组最高，而用药组最低。用药组与对照组存在极显著差异(P
<O. 01)；以上结果首次证明胸腺素α原通过抑制调节性T淋巴细胞的水平达到抑制肝癌的生长的效果。
权利要求
1.胸腺素α原在抑制调节性T淋巴细胞活性中的用途。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于所述胸腺素α原包括所有哺乳动物提取的胸腺素α原以及基因工程表达的胸腺素α原。
3.胸腺素α原在制备预防和治疗肝癌药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述胸腺素α原包括所有哺乳动物提取的胸腺素α原以及基因工程表达的胸腺素α原。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述肝癌包括各型肝癌。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述药物包括口服药物、皮下注射药物和腹腔注射药物。
全文摘要
胸腺素α原在制备预防和治疗肝癌药物中的应用，涉及胸腺素α原。提供胸腺素α原在抑制调节性T淋巴细胞活性中的用途，以及胸腺素α原在制备预防和治疗肝癌药物中的应用。采用腹腔注射胸腺素α原，观察该重组蛋白在预防及治疗肝癌中的作用，包括肝肿瘤的大小以及防止腹水的形成。经过胸腺素α原的注射治疗和预防，能够明显抑制肝肿瘤的生长同时能够减少腹水的形成。通过检测小鼠脾脏调节性T淋巴细胞的水平，证明肝癌对照组脾脏调节性T淋巴细胞的水平明显比正常小鼠脾脏调节性T淋巴细胞的水平高差异极显著(P＜0.01)；而用药组调节性T淋巴细胞的水平则明显比正常对照组和实验对照组低，差异极显著(P＜0.01)。
文档编号A61K38/22GK102580059SQ20121008616
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者周克夫, 朱苑婷, 王世媛, 粟华, 蔡报伟 申请人:厦门伯赛基因转录技术有限公司, 厦门大学