专利名称：绿原酸的抗癌新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及绿原酸的新用途，属于生物医药领域。
背景技术：
绿原酸广泛存在于各种药用植物如金银花等中，目前对它的化学结构研究已经清楚，已有人对其进行药用研究，报道了绿原酸可以应用于治疗肿瘤等疾病。绿原酸(chlorogenic acid)是一种从双子叶植物(如忍冬叶、咖啡豆、向日葵) 的叶和果实分离得到的酚类，也是许多中草药(如杜仲、金银花、茵陈等)及中药复方制剂抗菌消炎、清热解毒的主要活性成分，目前已成为中草药制剂质量控制的主要指标之一。绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。它是一种由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(鸡纳酸，quinic acid,即1_轻基六氢没食子酸)缩合而成的缩酹酸，异名咖啡鞋酸，化学名3-0-咖啡酰奎尼酸(3-0-caffeoylquinic acid),分子式为C16H18O9，分子量345. 31，半水合物为针状晶体，110°C时变为无水化合物，易溶于热水、 乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，常温下呈淡黄色或类白色粉末。绿原酸的结构式如下植物中绿原酸的生物合成包括了一系列的酶促反应。在酶的催化下，葡萄糖转化成莽草酸(shikimic acid)，后者再转化成苯丙氨酸，最后经合成酶作用得绿原酸。绿原酸在植物中分布广泛，从高等双子叶植物到蕨类植物均有报道，但含量较高的植物不多，主要存在于忍冬科忍冬属(Lonicera)、菊科蒿属(Artemisia)植物中，其中包括杜仲、金银花、 向日葵、咖啡、可可树。由于绿原酸是极性较强的有机酸，易溶于醇、热水，难溶于氯仿、乙醚，因此绿原酸的提取方法较多，有醇(甲醇、乙醇)溶法、水提醇沉、醇提铅沉、石灰乳沉淀法及聚酰胺柱层析法等。现已经报道的绿原酸有多种药理作用，其中，关于癌症的治疗用途仅限于宫颈癌、 肺癌和肝癌，未有用其治疗膀胱癌的报道。
发明内容
本发明提供了绿原酸治疗癌症的新用途。首先，本发明提供了绿原酸在制备治疗膀胱癌的药物中的用途。本发明还提供了一种治疗膀胱癌的药物组合物，它是以有效量的绿原酸为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的药剂。其中，所述的药剂中每制剂单位含有绿原酸I 3000mg。
HO COOH
其中，所述的药剂是口服制剂或者注射剂。本发明绿原酸可抑制膀胱癌细胞的增殖，具有治疗膀胱癌的作用，而且，本发明绿原酸是非细胞毒类药物，具有非细胞毒类药物的共同特点1.具有调节作用和细胞稳定作用(Cytostatic) ；2.临床治疗不一定需达到剂量性毒性(DLT)和最大耐受量(MTD) ；3.直接针对引起癌变分子机制，比传统化疗更有选择性和疗效；4.与常规治疗(化疗、放疗)合用有更好的疗效。本发明还提供了绿原酸与阿霉素类药物在制备治疗膀胱癌的联合用药物中的用途。所述的阿霉素类药物是指阿霉素或者阿霉素衍生物。其中，所述绿原酸与阿霉素类药物的重量配比为绿原酸10份，阿霉素类药物I 份。其中，所述阿霉素类药物为阿霉素。本发明最后提供了一种治疗膀胱癌的联合用药物，它包含不同规格的单位制剂， 用于同时、分别或者依次给绿原酸与阿霉素类药物，以及药学上可接受的载体。所述绿原酸与阿霉素类药物的重量配比为绿原酸10份，阿霉素类药物I份。所述阿霉素类药物为阿霉素。联合用药(drug combination)是指为了达到治疗目的而采用的两种或两种以上药物同时或先后应用。本发明绿原酸与阿霉素类药物联合用于治疗膀胱癌的效应为相加 (+)，因绿原酸本身既具有抑制肿瘤的作用，同时又对机体无害，且可以提高机体免疫力、改善机体造血功能和肝肾功能，因此将绿原酸与阿霉素联合使用时，既可以降低阿霉素的使用剂量，还可以进一步降低阿霉素对机体的毒副作用，具有良好的临床应用前景。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
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具体实施例方式
4
以下通过具体的药效实验证明本发明的有益效果。试验例I绿原酸抑制膀胱癌的作用一、体外实验I、试验材料I. I受试药物绿原酸白色粉末，由四川九章生物化工科技发展有限公司提供，批号为101204， 绿原酸含量为99. 68% ；阳性对照药阿霉素注射液(ADM)，购买于浙江海正药业有限公司，批号为 091001，规格 IOmg/支。I. 2主要试剂培养基及试剂培养基RPML1640 (Gibco公司)，小牛血清(兰州民海)，青霉素(华北制药股份有限公司)、硫酸链霉素(华北制药股份有限公司)，WST_1 (美国Roche公司)。I. 3主要仪器二氧化碳细胞培养箱(日本SANYO)，1X70倒置相差荧光显微镜(日本Olympus)， 生物安全柜(美国NUAIRE)，μ -Quant微孔板测定仪(BioTek公司)，培养器皿96孔培养板，培养瓶(BD公司)。I. 4细胞株细胞株共4株，见表I。表I绿原酸抗肿瘤作用体外实验研究用细胞株
株名__名称
BIU-875637 Τ-24
Τ739_2.试验方法2. I药物及试剂配制2. I. I绿原酸的配制取绿原酸适量,用生理盐水溶解配成6. 4mg/ml的储存溶液,经O. 22 μ mMillipore 无菌过滤器无菌过滤除菌。2. I. 2阿霉素注射液的配制取阿霉素I支，用灭菌生理盐水稀释成I. 28mg/ml的储存溶液。2. I. 3培养液配制RPML1640细胞培养基溶解于超纯水(IOOOml)中，搅拌溶解，加2. 2gNaHC03和 IOmlHEPES搅拌溶解，再加青霉素适量(终浓度为100U/ml)和链霉素适量(终浓度为 100 μ g/ml)，充分混合后，用0. 22 μ m滤膜无菌过滤，分装，于_20°C冻存，此为基础培养基。 临用前37°C水浴解冻，加10%的小牛血清，调整培养液pH为7. 2 7. 4，此为完全培养基。2. I. 4细胞增殖检测试剂Cell Proliferation Reagent (WST-I) (Roche 11644807001)试剂按要求冷藏。
人膀胱癌细胞株人膀胱癌细胞株人移行细胞膀胱癌细胞株小鼠膀胱癌细胞株
2. 2细胞复苏及接种2. 2. I细胞复苏将冻存细胞株从_152°C超低温冰柜中取出，40°C水浴解冻，离心并用基础培养基洗涤后用完全培养基悬浮细胞，转移到细胞培养瓶内，静置于5% CO2细胞培养箱中37°C培养，每2 3天换液。细胞生长铺满细胞瓶后用O. 25%胰蛋白酶消化传代培养至实验所需细胞数量。2. 2. 2细胞接种取对数生长期细胞，O. 25%胰蛋白酶消化，用基础培养基洗涤离心(IOOOrpm 5min 两次)，用完全培养基悬浮细胞并调整细胞浓度为6 X IOVml，接种细胞于96孔板内，每孔 50 μ I (细胞数量6 X IO3/孔)，每个药物浓度接种3个复孔，并设正常对照组(肿瘤细胞+ 完全培养基)和空白对照组(完全培养基)，每组3个复孔。2. 2. 3 加药接种后次日细胞贴壁后按以下分组加药。(I)绿原酸组用完全培养基将6. 4mg/ml绿原酸储存溶液配制成256 μ g/ml的溶液，然后用完全培养基按对倍稀释法逐步稀释，得含绿原酸256、128、64、32、16、8、4和
2μ g/ml的完全培养基，备用；取5(^ I上述含不同浓度绿原酸的完全培养基到已接种细胞的96孔板中，使绿原酸终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2和I μ g/ml，每个浓度3复孔。(2)阿霉素组用完全培养基将阿霉素I. 28mg/ml储备液稀释成25. 6 μ g/ml的溶液，然后用完全培养基按对倍稀释法逐步稀释得到含阿霉素25. 6、12. 8,6. 4,3. 2、I. 6,0. 8、 O. 4和O. 2 μ g/ml的完全培养基，备用；取50 μ I上述含不同浓度阿霉素的完全培养基到已接种细胞的96孔板中，使阿霉素终浓度分别为12. 8,6. 4,3. 2、I. 6,0. 8,0. 4、0. 2和O. I μ g/ ml，每个浓度3复孔。(3)绿原酸+阿霉素组测定绿原酸对阿霉素的增效作用，初步考察绿原酸对阿霉素6. 4 μ g/ml浓度组的增效情况作用。在已接种的96孔板中，分别加入25 μ I浓度为 25. 6 μ g/ml的阿霉素溶液,使阿霉素终浓度为6. 4 μ g/ml,再加入25 μ I不同浓度绿原酸培养基溶液，使绿原酸的终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2和I μ g/ml，每个浓度3复孔。(4)正常对照组设肿瘤细胞正常对照组孔，不加药物处理，只加等量(100 μ I)完全培养基，与上述3个组别同步实验。(5)空白对照组每孔不接种细胞，只加等量(100 μ I)完全培养基，设3个复孔作为空白对照。2. 2. 4 测定加药后细胞培养48小时，在上述3个实验组、正常对照组和空白对照组孔内加入 10 μ IffST-I溶液，置37°C细胞培养箱继续孵育4小时后，在μ -Quant微孔板测定仪上测定不同药物组、正常对照组和空白对照组440nm波长处的吸收值。2. 2. 5数据处理(I)计算GI (生长抑制率)=(I-OD药物组/OD对照组)X 100%。(2)以同一药物不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图，可得到剂量效应曲线。(3)根据药物浓度及对应的肿瘤细胞抑制率，采用Logit法IC5tl计算软件计算半数抑制浓度(IC5tl值)。
(4)联合用药以公式Q = E (a+b) / (Ea+Eb-Ea X Eb)计算有无协同作用。其中 E(a+b)为两药合用的抑制率，即实验合并效应，Ea和Eb为两药单用时的抑制率，分母 (Ea+Eb-EaXEb)为期望合并效应，Q为两者比值。Q值在O. 85 I. 15时，两药合并效应为相加(+)，Q值在I. 15 20时为协同(++)，0值> 20为明显协同(+++)，Q值在O. 05 O. 85时为拮抗，Q值< O. 05为明显拮抗。3.试验结果3. I绿原酸对人膀胱癌细胞(BIU-87)的体外抑瘤作用3. I. I细胞形态观察结果各组加药处理48小时后，在倒置显微镜下观察细胞形态，与正常对照组比较，绿原酸(I 128 μ g/ml)对细胞生长有一定的影响，部分细胞变圆、脱落、悬浮；而阿霉素处理过的细胞，低浓度时即有大量细胞死亡，有大量细胞碎片；联合用药各组细胞死亡亦明显， 大量细胞变圆、脱落、悬浮。3. I. 2绿原酸对人膀胱癌细胞(BIU-87)的抑制率、半数抑制浓度(IC5tl)和剂量效应曲线绿原酸及阿霉素对人膀胱癌细胞(BIU-87)的抑制率和半数抑制浓度(IC5tl)分别见表2和表3，剂量效应曲线见图I。表2绿原酸对人膀胱癌细胞(BIU-87)的抑制率和半数抑制浓度(IC5tl)0084] 表3阿霉素对人膀胱癌细胞(BIU-87)的抑制率和半数抑制浓度(IC5tl)
权利要求
1.绿原酸在制备治疗膀胱癌的药物中的用途。
2.一种治疗膀胱癌的药物组合物，其特征在于它是以有效量的绿原酸为活性成分， 加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的药剂。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述的药剂中每制剂单位含有绿原酸I 3000mg。
4.根据权利要求2或3所述的药物组合物，其特征在于所述的药剂是口服制剂或者注射剂。
5.绿原酸与阿霉素类药物在制备治疗膀胱癌的联合用药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述绿原酸与阿霉素类药物的重量配比为绿原酸10份，阿霉素类药物I份。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述阿霉素类药物为阿霉素。
8.一种治疗膀胱癌的联合用药物，其特征在于它包含不同规格的单位制剂，用于同时、分别或者依次给绿原酸与阿霉素类药物，以及药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的联合用药物，其特征在于所述绿原酸与阿霉素类药物的重量配比为绿原酸10份，阿霉素类药物I份。
10.根据权利要求8或9所述的联合用药物，其特征在于所述阿霉素类药物为阿霉素。
全文摘要
本发明公开了绿原酸在制备治疗膀胱癌的药物中的用途，公开了一种治疗膀胱癌的药物组合物，它是以有效量的绿原酸为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的药剂，公开了绿原酸与阿霉素类药物在制备治疗膀胱癌的联合用药物中的用途和一种治疗膀胱癌的联合用药物。本发明提供的绿原酸具有抑制膀胱癌细胞的作用，对正常细胞无细胞毒性，有良好的药用价值。
文档编号A61K31/216GK102579419SQ20121008631
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者严永江, 张欣, 张洁, 杨华蓉, 梁贵伦, 田晨煦, 黄望, 黄英 申请人:四川九章生物化工科技发展有限公司