专利名称：重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗及制备方法
重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗及制备方法抟术领域:
本发明提供一种重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗，同时还提供所述疫苗的制备方法，用于预防犬瘟热的发生和流行，属于动物传染病疫苗生产技术领域。
背景技术：
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犬瘟热是由副粘病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus,⑶V)引起多种动物的ー种急性、热性、高度接触性病毒性传染病。CDV自然感染宿主在不断扩大，除犬科动物外，还可感染大熊猫、小熊猫、狮、虎和豹等食肉目所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物病。犬瘟热病毒基因组为非分节段的单股负链RNA。负链RNA病毒的主要特点是基因 组RNA不具有感染性，而且裸露的基因组RNA本身也不能作为模板，只有在与核蛋白N/NP结合成核糖核蛋白(RNP)复合体后，才能作为模板起始复制和转录，并表达和包装出活病毒，关键是获得有功能的RNP。RNA病毒感染性克隆的构建，实现了从病毒整体与分子之间、病毒与宿主关系方面研究病毒的毒力和致病性。可以采取基因敲除、插入、置換、或构建嵌合病毒等方法对病毒基因功能进行研究。⑶V囊膜表面的纤突是由H和F两种糖蛋白组成。研究表明H、F蛋白是宿主免疫系统的主要目的抗原，是产生中和抗体的重要抗原。二者在病毒的吸附和侵入宿主细胞过程中起作用，病毒通过H蛋白吸附到细胞表面的受体上，并协助F蛋白介导病毒囊膜与宿主细胞膜、感染细胞与非感染细胞的融合，使病毒在宿主体内扩散。H蛋白主要诱导了体液免疫，并且抗CDV H蛋白单克隆抗体(MoAb)具有中和病毒活性；F蛋白诱导的免疫反应能阻止病毒感染，并且在有病毒増殖的情况下抑制症状的发生。用相关或非相关病毒的糖蛋白基因取代自身糖蛋白基因后的重组病毒也已成功用于疫苗研制。在狂犬病毒(RV)研究中，RABV G蛋白是唯一的膜蛋白并诱导VNA (中和抗体)的产生，额外的RABV G蛋白(2个或3个)被克隆至RABV基因组，并成功拯救出携帯2-3个G蛋白基因的致弱RV，使得G蛋白表达量增加，其神经中枢的致病性进ー步下降，免疫原性提高，由此可见，过表达G蛋白可潜在的增强适应性免疫应答及提高免疫保护率。发明内容:
本发明提供一种重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗，为ー种新型的犬瘟热病毒疫苗，以预防犬瘟热的发生和流行。本发明还公开了重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗制备方法，适用于エ业化生产。本发明的技术解决方案如下以临床上所用的犬瘟热弱毒疫苗株为基础，通过反向遗传技术改造获得表达双血凝素的新型犬瘟热弱毒疫苗，用于犬瘟热新型疫苗的研制与生产。首先在犬瘟热病毒反向遗传操作平台的基础上，通过RT-PCR方法获得CDV弱毒株的H基因，将H基因定向克隆到真核表达载体pCI-CDV-EGFP质粒中，构建带有双H基因的全长真核表达质粒PCI-CDV-JP-2H ;将构建的全长质粒pCI-CDV-JP-H、和三个辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L共转染BSR细胞，拯救包装获得重复表达血凝素的重组犬瘟热病毒rCDV-JP-2H。最后用重组病毒进行免疫动物实验，评价改造后的犬瘟热病毒弱毒株的免疫效果。本发明提供的重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗，其特征在于
以犬瘟热病毒弱毒株(CDV-JP)为基础在P和M基因之间的非编码区额外加入血凝素基因，构建表达双血凝素(双H)的重组犬瘟热弱毒活疫苗(r⑶V-JP-2H)。本发明所述重复表达血凝素H重组犬瘟热疫苗株的生产方法，包括以下步骤
1)用RNA提取试剂盒提取犬瘟热弱毒病毒基因组总RNA；
2)RT-PCR方法获得犬瘟热血凝素H基因，片段长度为1824bp ；
上游引物5，-GTTTAAACATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGC CTAAGTCCTCTCCGCCACCATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGT-3’
下游引物5，-GGGGTTTAAACTCAGGGATTTTAACGGTTAC-3>
其中5’端分别引入的都为Pme I酶切位点；
3)将步骤2)中目的扩增片段连接到克隆载体pBluescript中，构建克隆测序质粒pBluescript-H ;pBluescript_cl 质粒和 pBluescript-H 经 Pme I 酶切后，将 H 基因片段定向克隆到pBluescript-cl质粒中，构建中间克隆载体pBluescript-cl-H ；
4)pBluescript-cl-Η 质粒和 pCI-CDV-EGFP 质粒经 Sal I 和 Mlu I 双酶切后，将 cl_H目的片段定向克隆到真核表达载体pCI-CDV-EGFP中构建带有双血凝素基因的全长真核表达质粒pCI-⑶V-JP-2H ;其中，额外的H蛋白插入的位点是P与M基因之间的非编码区；
5)双血凝素基因的全长真核表达质粒pCI-⑶V-2H及三个真核表达辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L共转染BSR细胞，拯救包装获得表达双血凝素血凝素的重组犬瘟热病毒rCDV-JP-2H ；
6)以重组病毒接种Vero细胞，经扩大培养増殖，并对增殖重组病毒进行病毒滴度测定，至病毒TCID5tl达IO5个TCID5(l/mL，_70°C冰箱中保存备用。本发明的积极效果在于选用了犬瘟热病毒优势保护性抗原基因作为改造目标，以增强其免疫保护效果，构建和拯救的重复表达血凝素的重组犬瘟热病毒r⑶V-JP-2H在细胞水平上具有较好的细胞增殖活性，并且出现的CPE更加典型，在临床上与改造前母本病毒以同样病毒滴度免疫犬试验，表明改造后的弱毒株取得了更好的免疫效果，从而达到更好的预防动物犬瘟热的目的。
图I :本发明重复表达血凝素(H)的重组犬瘟热全长质粒的构建策略 图2 :本发明重复表达血凝素(H)的重组犬瘟热全长质粒酶切鉴定结果；PCI-CDV-JP-2H全长质粒酶切鉴定结果I 8 :pCI-CDV-JP-2H全长质粒分别用Pme I、Sal I 和 Mlu I、Sal I 和 Not I、Pst I、Cpo I、Xho I、Nhe I、Sma I 酶切结果;M: Marker15000 ；
图3 :本发明疫苗在BSR细胞上所引起的细胞病变(CPE)图(10X10)；
图4 :本发明疫苗间接免疫荧光照片(10X 10)；
图5 :本发明疫苗电子显微镜观察图(40000)；
图6、图7 :本发明疫苗与亲本疫苗株免疫犬的抗体效价。
具体实施方式
:下列实施例g在进ー步举例(以双血凝素重组疫苗为例)描述本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。实施例I
I.犬瘟热弱毒株H基因的RT-PCR扩增 I)提取总RNA:
在反向遗传操作平台的基础上，用经典总RNA提取试剂盒提取犬瘟热弱毒病毒基因组总RNA，步骤如下； I吸取200ul样品，加入到EDPC水处理过的I. 5ml EP管中，再加入200ul变性剂(solution I),轻轻混合均勻。2加入1.5ul β-巯基こ醇、20ul醋酸钠、200ul水饱和酚、40ul异戊醇，震荡混勻，12000rpm, 4°C离心 IOmin03取出上清,加入到另ー无Rnase的I. 5mlEP管中，加入200ul的异丙醇,混合均勻后，12000rpm，4°C离心 lOmin。4弃上清，加入Iml 75% DEPC酒精溶液上下颠倒混匀，12000rpm，4°C离心IOmin0之后重复洗涤一次。5弃净上清液，倒置lOmin，让酒精充分挥发。2 )反转录及PCR扩增
以⑶V基因组总RNA为模板，进行反转录。RT反应体系(总体系20ul)
权利要求
1.一种重复表达血凝素囊膜糖蛋白重组犬瘟热疫苗，其特征在于以犬瘟热弱毒株(CDV-JP)为基础在P和M基因之间的非编码区额外加入囊膜糖蛋白基因，构建表达双囊膜糖蛋白(双H)的重组犬瘟热弱毒活疫苗(rCDV-JP-2H)。
2.根据权利要求I所述的重复表达血凝素囊膜糖蛋白重组犬瘟热疫苗，其特征在于含有以下引物 上游引物5，-GTTTAAACATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAAGTCCTCTCCGCCACCATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGT-3’ 下游引物5，-GGGGTTTAAACTCAGGGATTTTAACGGTTAC-3>。
3.根据权利要求I所述复表达血凝素囊膜糖蛋白重组犬瘟热疫苗的制备方法，包括以下步骤 1)用RNA提取试剂盒提取犬瘟热弱毒株(CDV-JP)基因组总RNA； 2)RT-PCR方法获得犬瘟热血凝素H基因，片段长度为1824bp ； 上游引物5，-GTTTAAACATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAAGTCCTCTCCGCCACCATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTGGGT-3’ 下游引物5，-GGGGTTTAAACTCAGGGATTTTAACGGTTAC-3> 其中5’端分别引入的都为Pme I酶切位点； 3)将步骤2)中目的扩增片段连接到克隆载体pBluescript中，构建克隆测序质粒pBluescript-H ;pBluescript_cl 质粒和 pBluescript-H 经 Pme I 酶切后，将 H 基因片段定向克隆到pBluescript-cl质粒中，构建中间克隆载体pBluescript-cl_H ； 4)pBluescript-cl-Η 质粒和 pCI_CDV_EGFP 质粒经 Sal I 和 Mlu I 双酶切后，将 cl_H目的片段定向克隆到真核表达载体pCI-CDV-EGFP中构建带有双血凝素基因的全长真核表达质粒pCI-⑶V-2H ;其中，额外的H蛋白插入的位点是P与M基因之间的非编码区； 5)带有双血凝素基因的真核表达全长质粒pCI-⑶V-2H及三个辅助质粒pCI-N、pCI-P、PCI-L共转染BSR细胞，拯救包装获得表达双血凝素的重组犬瘟热病毒r⑶V-JP-2H ； 6)以重组病毒接种Vero细胞，经扩大培养，并对增殖重组病毒进行病毒滴度测定，至病毒TCID5tl达IO5个TCID5Q/mL，_70°C冰箱中保存备用。
全文摘要
本发明提供一种重复表达血凝素重组犬瘟热疫苗及制备方法，以犬瘟热病毒弱毒株(CDV-JP)为基础在P和M基因之间的非编码区额外加入血凝素基因，构建表达双血凝素(双H)的重组犬瘟热弱毒活疫苗(rCDV-JP-2H)。选用了犬瘟热病毒优势保护性抗原基因作为改造目标，以增强其免疫保护效果，构建和拯救的重复表达血凝素的重组犬瘟热病毒rCDV-JP-2H在细胞水平上具有较好的细胞增殖活性，并且出现的CPE更加典型，在临床上与改造前母本病毒以同样病毒滴度免疫犬试验，表明改造后的弱毒株取得了更好的免疫效果，从而达到更好的预防动物犬瘟热的目的。
文档编号A61K39/175GK102813919SQ20121010085
公开日2012年12月12日 申请日期2012年4月9日 优先权日2012年4月9日
发明者高玉伟, 王磊, 杨松涛, 冯娜, 李天松, 黄耕, 王铁成, 赵永坤, 王化磊, 夏咸柱 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所