专利名称：蝎活性多肽及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体的说是涉及蝎活性多肽及其制备方法与应用。
背景技术：
自身免疫性疾病(autoimmune disease)是机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，即人体免疫系统攻击自身的组织。全球约有5 8%的人口受到约40多种自身免疫性疾病的威胁，包括T细胞介导的类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、白塞病、自身免疫性甲状腺病和I型糖尿病等。在类风湿性关节炎中免疫系统攻击病患的关节部位，多发性硬化症是神经细胞的神精髓鞘(myelin sheaths)受到攻击。这些疾病涉及全身一种或多种组织和器官，严重影响人体健康及生命。针对自身免疫性疾病，目前无有效疗法，且病情反复发作。目前常用对抗自体免疫性疾病的方法，一是利用类固醇来减缓因免疫系统攻击组织所造成的炎症反应，二是使用免疫抑制药物，抑制免 疫系统的作用，但这两种方法都会造成严重的副作用，而且都只能减缓病情的发展速度，不能根治疾病。为了改变自身免疫性疾病药物治疗的落后现状，急需探索新的疾病预防和治疗方法。原始(naive ) T细胞被特异性的抗原物质激活后，进行增殖和分化，一般形成在功能上各异的两类细胞，即效应型记忆T细胞(effector memory, TEM)和中央型记忆T细胞(central memory, TCM)。研究表明，多种自身免疫性疾病与TEM细胞的激活密切相关。在人体T细胞膜上存在两种钾通道，一种是电压门控钾通道Kvl. 3，另一种是中等电导钙激活钾通道IKCal。近年来，研究发现钾通道Kvl. 3在不同类型T细胞上具有显著的时空表达差异性，当T细胞被激活后，只有发挥自身免疫功能的TEM细胞可显著地表达1500 2000个Kvl. 3钾通道。这种钾通道Kvl. 3高表达情况相继在患不同自身免疫性疾病的病人的TEM细胞中得到证实。因此，T细胞膜上钾通道Kvl. 3给治疗自身免疫性疾病带来新的希望[J. Clin. Invest.，2003，111 :1703 ；Immunity,2008，29 :602]。有机小分子药物首先受到更多的关注。如Merck公司、澳大利亚Walter and ElizaHall药物研发中心、美国加利福尼亚大学等机构筛选、分离、合成、改造和鉴定了大量的有机小分子药物候选物[Mol. Pharmacol, 2004,65 :1364 ;Journal of Medicinal Chemistry,2006,49 (4) :1433 ；MoI. Pharmacol, 2005,68 :1254]。但有机小分子候选药物几乎均作用钾通道Kvl. 3和其它相似钾通道，因而极可能造成作用较强的毒副反应，如有机小分子药物作用同源Kvl. UKvl. 2,Kvl. 4,Kvl. 5等活性比Kvl. 3通道低2 70倍。筛选设计多肽成为新的趋势。中国传统医药常用“以毒攻毒”的策略治疗人类的疑难杂症，有毒动物，如蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等是首选。现代研究已表明这些有毒动物的毒液中富含动物活性多肽，这些多肽可特异性作用细胞膜上离子通道。当今，这些动物活性多肽已成为全球竞争研发的重要药物资源[Nat. Rev. Drug. Discov. 2003 2 :63]。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供稳定的治疗自身免疫性疾病的蝎活性多肽。本发明通过筛选我国蝎活性多肽基因库，得到了许多具有重要药用前景的多肽基因，通过已建立的计算机辅助筛选与设计技术[Biophysical Journal, 2004,87 :105 ；Proteins, 2008, 70 :744 ;Journal ofProteome Research, 2010,9 :3118],虚拟筛选至Ij 3 个可能特异性作用钾通道Kvl. 3的蝎活性肽新基因。通过基因工程技术，获得了三种蝎活性多肽，这三种蝎活性多肽分子内均含有3对二硫键，在体外稳定性强，易于长期保存。根据蝎活性多肽在分类学上的结构特征，三者属于同一亚型的a-KTX家族，且都作用于钾通道Kvl. 3。在一个实施方案中，本发明提供了具有如SEQ ID NO :I所示氨基酸序列的蝎活性肽，命名为ADC-I。本发明还提供了具有通过在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加 一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列的多肽。本发明也提供了编码蝎活性多肽ADC-I的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特定多肽的核苷酸序列。在一个实施方案中，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。同时本发明提供了具有编码ADC-I的DNA分子的载体。其中，作为优选，所述载体为具有可以编码ADC-I的DNA分子的pGEX-6p-l。更优选地是，所述载体为具有如SEQIDNO 2所示核苷酸序列的pGEX-6p-l。本发明也提供了所述蝎活性多肽ADC-I的制备方法，包括步骤I :获取具有可以编码SEQ ID NO : I所示的氨基酸序列的DNA分子；步骤2 :将步骤I所获得的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，并转化宿主细胞；步骤3 :诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。目前利用基因工程技术获得DNA分子的方法有很多种，包括利用限制性内切酶酶切具有编码所述蝎活性多肽DNA分子的载体或以具有编码所述蝎活性多肽的DNA分子的cDNA为模板PCR扩增。在一个实施方案中，制备方法步骤I具体为以具有编码SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列的下游引物扩增。本发明所述制备方法步骤2所述表达载体包括pGEX系列、pET系列、pQ E系列和PMAL系列。在一个优选实施方案中，表达载体为pGEX系列中的pGEX-6p-l。本发明所述制备方法步骤2所述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21系列菌株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为Rosetta(DE3)菌株。实验表明，本发明所述蝎活性多肽ADC-I可特异性作用于钾通道Kvl. 3，并可在大鼠动物水平有效地治疗多发性硬化症和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。因此本发明还提供了所述蝎活性多肽在制备治疗或预防钾通道Kvl. 3相关疾病药物中的应用，所述钾通道Kvl. 3相关疾病包括自身免疫性疾病，具体为多发性硬化症或类风湿性关节炎。
图I示重组蝎活性多肽ADC-I及其GST融合表达蛋白的电泳检测图，其中，泳道I为蛋白质分子量Marker ；2泳道为ADC-I未经IPTG诱导的全细胞蛋白；泳道3为ADC-I经IPTG诱导的全细胞蛋白；泳道4为亲和层析后的融合蛋白GST-ADC-I ;泳道5为超滤脱盐浓缩后的融合蛋白GST-ADC-I ;泳道6为融合蛋白GST-ADC-I经EK酶切后的产物；泳道7为经HPLC分离纯化的ADC-I多肽；图2示重组蝎活性多肽ADC-I与GST蛋白质的色谱分离纯化图；图3示重组蝎活性多肽ADC-I质谱分析图；图4示InM蝎活性多肽ADC-1对钾通道Kvl. 3电流的抑制示意图。
具体实施例方式本发明通过筛选我国蝎活性多肽基因库，利用基因工程技术，获得了三种新型蝎活性多肽，分子内均具有3对二硫键，在体外稳定性强，易于长期保存。在一个实施方案中，本发明提供了具有如SEQ ID NO :I所示氨基酸序列的蝎活性多肽命名为ADC-I。本发明还提供了具有通过在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列的多肽。本发明也提供了编码本发明所述蝎活性多肽ADC-I的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特定多肽的核苷酸序列。在一个实施方案中，其核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示。同时本发明提供了具有编码多肽ADC-I的DNA分子的载体。在一个实施方案中，所述载体为具有可以编码所述蝎活性多肽ADC-I的DNA分子的pGEX-6p-l。更优选地是，所述载体为具有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列的pGEX-6p-l。为了制备本发明所述蝎活性多肽，本发明也提供了所述蝎活性多肽的制备方法，包括步骤I :获取具有编码所述蝎活性多肽ADC-I的DNA分子；步骤2 :将步骤I所获得的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，并转化宿主细胞；
步骤3 :诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。目前利用基因工程技术获得DNA分子的方法有很多种，包括利用限制性内切酶酶切具有编码所述蝎活性多肽DNA分子的载体或以具有编码所述蝎活性多肽DNA分子的cDNA为模板PCR扩增。在一个实施方案中，本发明提供了以具有编码所述蝎活性多肽ADC-I的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，获取具有编码所述蝎活性多肽ADC-1DNA。本发明所述制备方法步骤2所述将步骤I所获得的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，并转化宿主细胞具体为步骤I所得DNA分子通过凝胶电泳回收和双酶切插入表达载体，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌。
其中，本发明所述表达载体包括pGEX系列、pET系列、pQ E系列和pMAL系列。在一个优选实施方案中，表达载体为PGEX系列中的pGEX-6p-l。本发明所述转化宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21系列菌株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为Rosetta(DE3)菌株。真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。Rosetta (DE3)是携带PRARE2质粒的BL21衍生菌，可以补充大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子(AUA，AGG，AGA，CUA’CCC, GGA及CGG)对应的tRNA，提高外源基因尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。本发明所述制备方法所述步骤3具体为IPTG诱导培养含重组表达载体的宿主细胞，收集菌体超声波破碎，取上清亲和层析得到融合蛋白，再经脱盐浓缩、小肠激酶酶切和色谱分离，获取色谱纯的蝎活性多肽。其中，所述亲和层析的层析介质为根据表达载体的选择性标签选择的与之相匹配的层析介质。在一个优选实施方案中，表达载体为pGEX-6p-l，亲和层析的层析介质为GST亲和层析胶。
在具体实施方案中，本发明所述制备方法具体为以具有编码所述蝎活性多肽ADC-I的DNA分子的cDNA为模板，用根据编码成熟肽部分的核苷酸序列设计的引物，获取具有编码所述蝎活性多肽ADC-I的DNA分子，凝胶电泳回收和双酶切获取的DNA分子及表达载体pGEX-6p-l,连接构建重组表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)获得重组菌。然后IPTG诱导培养含重组表达载体的宿主细胞，收集菌体超声波破碎，取上清GST亲和层析得到融合蛋白，再经脱盐浓缩、小肠激酶酶切和色谱分离，获取色谱纯的蝎活性多肽ADC-1。本发明通过膜片钳技术鉴定了所述蝎活性多肽ADC-I对钾通道Kvl. 3的药理学活性。结果显示，所述蝎活性多肽ADC-I可特异性抑制钾通道Kvl. 3电流，抑制电流半数的多肽浓度(IC50值)为0. 49 ±0. 45nM，表明蝎活性多肽ADC-I可特异性作用自身免疫疾病的靶标钾通道Kvl. 3。本发明通过在大鼠动物水平上模拟治疗多发性硬化症和类风湿性关节炎检测蝎活性多肽ADC-I药物治疗效果。结果显示，蝎活性多肽ADC-I治疗后，大鼠多发性硬化症和类风湿性关节炎的症状得到显著改善，表明蝎活性多肽ADC-I能有效地治疗多发性硬化症和类风湿性关节炎。本发明通过对蝎活性多肽ADC-I的毒性作用研究，发现蝎活性多肽ADC-I在超过自身免疫疾病动物模型治疗剂量50倍的剂量下对小鼠无明显毒性，表明蝎活性多肽ADC-I毒副作用小。因此本发明还提供了所述蝎活性多肽在制备治疗或预防钾通道Kvl. 3相关疾病药物中的应用，所述钾通道Kvl. 3相关疾病包括自身免疫性疾病，具体为多发性硬化症或类风湿性关节炎。本发明所述蝎活性多肽ADC-I分子内具有3对二硫键，在体外稳定性好，易于长期保存。膜片钳技术鉴定显示可特异性作用钾通道Kvl. 3，特异性强，是目前国际上已发现的活性强的多肽。动物实验表明，重组多肽ADC-I可以有效治疗大鼠的多发性硬化症和类风湿性关节炎，药物效果显著，并且对实验动物毒副作用小。本发明所述蝎活性多肽的制备方法简单易行，操作方便，易于生产和制备高纯度的ADC-I蝎活性多肽。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的蝎活性多肽及其制备方法与应用进行详细说明。实施例I :蝎活性多肽ADC-I基因的获取取40 只三脊豚蝎(Chaerilus tricostatus)蝎尾腺，用 Trizol 试剂(Invitrogen)提取总RNA,提取方法参照Trizol试剂盒说明书。用Poly A Tract mRNAIsolation System(Promega)试剂盒纯化mRNA,并米用 Superscript Plasmid System cDNAlibrary construction kit (Gibco/BRL)试剂盒构建 cDNA 文库。将 cDNA 克隆到 pSPORTl载体中，并转化大肠杆菌DH5 a，随机挑选cDNA克隆进行测序。对测序的结果进行序列分析，共获得可能与钾离子通道相互作用的178个蝎活性肽新基因。通过建立的计算机辅助筛选与设计技术[Biophysical Journal, 2004,87 :105 ；Proteins, 2008, 70 :744 ；Journalof Proteome Research, 2010,9 :3118]，分别预测84个蝎活性肽基因编码多肽的空间结构，然后通过计算机虚拟筛选它们与钾通道Kvl. 3的相互作用，获得了具有编码蝎活性多肽ADC-IDNA分子的cDNA基因，所编码的成熟肽具有如SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的蝎活性多肽ADC-I。实施例2 :扩增编码蝎活性多肽ADC-I的DNA分子I、引物设计以蝎活性多肽ADC-I的cDNA基因序列中编码成熟肽部分的核苷酸序列作为PCR反应的模板序列设计引物。设计的引物为ADC-I上游引物为SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；ADC-I下游引物为SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列；2、扩增DNA分子以蝎毒cDNA为模板，用具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO :4所示的核苷酸序列的下游引物进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为
IOxtaq buffer(with 1.5mM Mg2+)5|il
dNTP(5mM)4|il
上游引物(lOOng/ul)l|il
下游引物(lOOng/ul)l|il 模板(5-50ng/|il)l|il
Taq 酶(2U/|il)0.5|il加入灭菌蒸懼水补足体系总量50 ii I。PCR反应程序为94°C预变性300s94°C 变性 45s55°C退火 45s 32个循72°C 延伸 45s
72。。延伸200s3、重组表达载体构建将PCR扩增产物凝胶电泳回收，用EcoRI和XhoI双酶切，将酶切后的片段插入经EcoRI和XhoI双酶切的表达载体pGEX-6p-l (购自Pharmacia公司)，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌DH5ci (中国典型培养物保藏中心)。从含氨苄青霉素的LB平板中挑取单菌落，在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C培养5小时，然后用PCR扩增的方法对这些培养物进行鉴定。PCR扩增模板用培养获得的菌液，扩增的引物、反应条件和反应过程同DNA 分子扩增过程。选取PCR鉴定正确的菌种进行测序，获得序列正确的含重组表达载体的菌种，提取质粒，转化大肠杆菌Rosetta (DE3)(中国典型培养物保藏中心)。实施例3 :蝎活性多肽ADC-I的表达和纯化提取测序序列正确的含重组表达载体的pGEX-6p-l-ADC_l菌种的质粒转化大肠杆菌Rosetta (DE3)。IPTG (华美生物工程公司)诱导培养转化的大肠杆菌，收集菌体，悬浮于缓冲液(50mM Tris-Cl, I. OmM EDTA,pH8. 0)中，超声波破碎菌体，离心收集上清。所得上清通过GST亲和层析得到融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液脱盐浓缩、小肠激酶(EK)酶切，获得蝎活性多肽ADC-I。利用高效液相色谱对ADC-I多肽进一步分离，去除GST蛋白质，得到色谱纯ADC-I多肽。ADC-I多肽理论分子量为4443. IDa，经质谱分析显示它的分子量为4439. 7Da，与根据氨基酸序列推断的分子量一致。其中，对不同阶段得到的ADC-I多肽及其与GST融合蛋白进行了 PAGE电泳检测，结果见图1，高效液相色谱分离纯化和质谱分析结果见图2和图3。实施例4 :蝎活性多肽ADC-I对钾通道Kvl. 3的药理学活性分析将HEK-293T细胞在含10 %的胎牛血清的DMEM培养基37 °C、5 % CO2条件下培养，将钾通道Kvl. 3重组质粒分别用Sofast 的转染试剂盒转染，转染细胞在0. 8mg/mLGeneticin培养基上选择性培养。利用全细胞膜片钳用仪器(EPC-10双通道膜片钳放大器HEKA, Elektronik, Lambrecht, Germany),对重组蝎活性多肽ADC-1的药理学活性进行测定和分析。实验参数的设置、数据的采集和刺激的施加均通过Pulse软件(Elektixmik，Lambrecht, Germany)来控制。仪器的滤波器设置为IOkHz(Bessel),电极阻抗为2-5MQ,在电极与细胞膜之间形成高阻(1-5GQ)封接后，进行快电容自动补偿(c-fast)，稍加负压破膜后，进行慢电容自动补偿(C-Slow),在-70mV的钳制电位下,从_60mV起给予IOmV步幅递增、80ms步宽的去极化脉冲刺激至+50mV，观察电流情况，将多肽ADC-I通过MPS-2 (INBI0Inc, Wuhan, China)灌注系统实现精确灌注。将3种蝎活性多肽溶解后，经DAD给药系统(ALA)喷射给药，给药管尖端距记录细胞IOOiim左右，结果见图4。由图4可知ADC-I对钾通道Kvl. 3的药理学活性为0. 49±0. 45nM，是目前国际上已发现的活性强的多肽。实施例5 :蝎活性多肽ADC-I治疗多发性硬化症的药效实验
实验动物选取近交系雌性Wistar大鼠(6_8周龄，体重150土 IOg)，豚鼠(300-400g购自武汉大学实验动物中心)。主要试剂福氏完全佐剂(Gibcol/BRL)，卡介苗、百日咳疫苗(上海生物制品所)，豚鼠 MBP (Sigma)。全脊髓匀浆-福氏完全佐剂混合乳剂(GPSCH-CFA)的配制将豚鼠处死后，迅速取出脊髓，用超声破碎仪(Sonics & Materials Inc, America)制成50%的PBS勻衆,与等量的福氏完全佐剂(卡介苗10mg/ml)混合,用注射器抽打至油包水乳剂。EAE的诱导Wistar大鼠EAE模型Wistar大鼠双后腿足垫皮内注射0. 4mlGPSCH-CFA乳剂，或同时皮内注射约I X 101°百日咳疫苗。每日称重，观察神经症状。饲养2周即出现实验性自身免疫性脑脊髓炎。将实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠随机分为分为三组正常对照组(阴性 对照组)、模型对照组(模型鼠+生理盐水)、给药组(模型鼠+ADC-I多肽)，每组10只。给药组将多肽ADC-I按100 y g -kg-1剂量皮下注射，每天上午I次，正常对照组和模型对照组皮下注射等量生理盐水，连续给药。给药14天后，观察大鼠患实验性自身免疫性脑脊髓炎状况，根据大鼠状况评分，记录每只动物最高临床评分，取它们的均值为平均临床评分，结果见表I。评分标准为无任何临床症状，0分；尾部张力消失，可见轻度步态笨拙，I分；双后肢无力，被动翻身后可以恢复，2分；双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，3分；四肢瘫痪伴尿、便失禁，4分；濒死状态或死亡，5分。表I EAE模型中各实验组大鼠的评分(i±s)
~平均临床评分
分组n
IOdI2d14d
正常对照组 10 0.00±0.000.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00
模型对照组 10 0.45±0.161.49±0.38 3.15±0.432.82±0.47~
多肽给药组 10 0.41±0.210.85±0.32 0.93±0.291.23±0.35~实验结果表明在没有药物治疗情况下，模型对照组得分最高(2. 82±0. 47);蝎活性多肽ADC-I治疗后，大鼠的症状得到显著改善，平均临床评分为I. 23±0. 35。由此可见，蝎活性多肽ADC-I能有效地治疗多发性硬化症。实施例6 :蝎活性多肽ADC-I治疗类风湿性关节炎的药效实验选取无特定病原体(SPF)级近交系Wistar大鼠(武汉大学实验动物中心)40只，早，体重150±10g，在清洁级环境条件下适应性饲养I周后，以0. 2ml/只剂量的降植烷(pristane)在实验组大鼠尾根部皮内注射。饲养2周即出现类风湿性关节炎症状。将关节炎大鼠随机分为正常对照组(阴性对照组)、模型阴性对照组(模型鼠+生理盐水)、模型阳性对照组(模型鼠+氨甲喋呤)、给药组(模型鼠+Wistar多肽)，每组10只。给药组按IOOil g .kg—1剂量皮下注射，每天上午I次，连续给药；正常对照组和模型阴性对照组皮下注射等量生理盐水；模型阳性对照组按I. 75mg kg-1剂量皮下注射氨甲喋呤(MTX)，每天I次，连续给药。给药21天后，观察大鼠患关节炎状况。观察大鼠患类风湿性关节炎状况，根据大鼠状况评分，记录每只动物最高临床评分，取它们的均值为平均临床评分，结果见表2。评分标准为大鼠一个关节红肿，I分；大鼠二个关节红肿，2分；大鼠各个关节红肿，3分；大鼠整个肢体严重关节炎，4分。表2各实验组大鼠的关节炎评分(i±s)
权利要求
1.一种蝎活性多肽，其特征在于，具有如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。
2.—种蝎活性多肽，其特征在于，具有通过在SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列。
3.编码权利要求I或2所述蝎活性多肽的DNA分子。
4.编码权利要求I所述蝎活性多肽的DNA分子，其特征在于，具有如SEQID NO: 2所示的核苷酸序列。
5.具有权利要求3所述DNA分子的载体。
6.根据权利要求5所述载体，其特征在于，所述载体为pGEX-6p-l。
7.权利要求I所述蝎活性多肽的制备方法，包括如下步骤 步骤I :获取具有可以编码SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列的DNA分子； 步骤2 :将步骤I所获得的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，并转化宿主细胞； 步骤3 :诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述步骤I具体为以具有编码SEQIDN0:1所示氨基酸序列的cDNA为模板，用具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的上游引物和具 有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列的下游引物扩增。
9.权利要求I所述蝎活性多肽在制备治疗或预防钾通道Kvl.3相关疾病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述钾通道Kvl.3相关疾病为自身免疫性疾病。
11.根据权利要求10所述应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症或类风湿性关节炎。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了一种蝎活性多肽及其制备方法与应用。本发明设计的蝎活性多肽具有如SEQIDNO:1所示氨基酸序列。本发明所述制备方法为获取具有编码蝎活性多肽的DNA分子与表达载体融合构建重组表达载体转化宿主细胞，诱导表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。本发明还提供了所述蝎活性多肽在制备治疗或预防钾通道Kv1.3相关疾病药物中的应用。
文档编号A61P37/02GK102617723SQ20121010341
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者吴英亮, 曹志贱, 李文鑫, 韩松 申请人:武汉大学