专利名称：一种高品质超低分子量肝素的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种制备高品质超低分子量肝素的方法。
背景技术：
肝素(普通肝素即未分级肝素)是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，在体内和体外都有抗凝血作用。在临床上主要用于血液透析、血栓栓塞性疾病、心血管手术、心脏导管检查、体外循环等。其最大的副作用是引起出血，有时甚至会导致出血性死亡，据统计其出血的发生率高达35%。尽管如此，它仍是防止血栓形成、肺栓塞、弥漫性血管内凝血以及某些血栓栓赛性并发症的首选药物。虽然人们采取各种方法，比如减小剂量、局部用药等以降低出血危险，但是都无法从根本上解决问题。肝素的抗凝血活性分为抗栓活性(FXa)和抗凝(FIIa)活性两大类，在抗血栓形成的过程中，抗FXa活性与抗FIIa活性的作用都是必需的，抗血栓 作用的衡量标准用抗FXa / FIIa值表示，其值越大，表示抗血栓作用越强，出血倾向越小。低分子肝素是由未分级肝素经化学降解或酶降解方法制备的钠盐或钙盐，是普通肝素的一种升级产品，其平均分子量约为5000 Da。当皮下注射低分子肝素时，其在体内的抗FXa的作用要比普通肝素强得多，而抗FIIa活性较弱，还具有体内半衰期延长、生物利用度高等优点，是目前主流的抗血栓类的药物。虽然低分子肝素的抗FIIa活性与未分级肝素相比相对较弱，但是它依然会有一定几率引起出血以及血小板减少症。超低分子量肝素是经降解而成的肝素寡糖片段，其主要双糖结构与肝素基本相同，S卩 a-L-IdoA-2-S04-P (I — 4) - a-D-GIrNS03-6_S04，平均分子量约为 2200 Da，而且分子量的分布区间比低分子肝素更加集中。它与低分子肝素产品相比，有着更好的抗血栓活性，更小的出血危险，以及更低的对血小板的影响。对超低分子肝素的研究与开发已受到越来越多的关注，已逐渐成为国内外肝素研究的热点。目前已经证实，在多种转移性或局部进展性实体瘤患者中预防性使用超低分子量肝素后，静脉血栓栓塞事件的发生率大幅降低。我国现有公开号为CN101671711A的发明专利“一种制备超低分子量肝素的方法”和公开号为CN102040671A的发明专利“一种超低分子量肝素的制备及纯化工艺”。其中“一种制备超低分子量肝素的方法”是用麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白降解底物中肝素，得到超低分子量肝素；“一种超低分子量肝素的制备及纯化工艺”是以￠-消除降解法为基础，肝素与有机季铵盐作用生成的肝素季铵盐亲和取代后生成的肝素苄基酯，碱性条件下降解得到低分子量的肝素片段，通过无机陶瓷超滤与中空纤维超滤结合的方法进行分离纯化，获得分子量分布范围在200(T2500D、平均分子量为2200 Da的超低分子量肝素钠(钙)。其中，以酶降解从肝素钠提取超低分子肝素的工艺存在着反应条件苛刻、成本过高、杂质过多、产品难以纯化等缺点。而采用￠-消除降解法制备的超低分子肝素也有着抗FXa因子效价过低、抗FIIa效价过高、会有一定几率导致出血等问题，主要是由于样品纯度不够、杂质含量过多、小分子肝素聚积等因素导致，这些都是目前的提取工艺所不能解决的问题
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是针对现有技术的不足，提供一种高品质超低分子量肝素的低成本制备方法。本发明应用类似于化学合成肝素五糖的作用原理，针对猪肠黏膜来源的肝素，以改良的P -消除降解法为基础，创新性地采用重盐化、磷腈碱解聚、皂化等方法解决了料液中的大分子肝素过多、小分子肝素聚积等关键问题，从而制备得到超小分子片段。通过此种方法制备得到的超低分子肝素钠平均分子量为2000 3000，分子量分布 < 1600的比例(40. 0% ；> 4500 的比例彡 11. 0%> 30，抗FXa 效价:145-180 IU/mg，抗FIIa效价<5.0 IU/mg。与低分子肝素钠和超低分子肝素钠相比，本发明制备的高品质超低分子量肝素钠有着非常好的的抗血栓活性，更小的出血危险，以及更低的对血小板的影响，有望成为新生代的肝素类抗血栓药物。为实现本发明目的，本发明的超低分子量肝素制备方法包括以下步骤
1、肝素-苯索氯铵盐的合成按I:2 3的重量比称取肝素钠和苯索氯铵盐，分别溶于蒸馏水中，将在肝素钠溶液缓慢加入到苯索氯铵盐溶液中，搅拌2小时以上，静置分层，去上清，并将剩余悬浮物离心，收集沉淀物肝素-苯索氯铵盐，然后洗涤并干燥；
2、肝素苄基酯的合成将(I)所得肝素-苯索氯铵盐溶于二甲基甲酰胺，然后加入氯化苄，于55飞(TC下进行酯化反应25 30小时；
3、苄基肝素钠盐的合成配制饱和的醋酸钠乙醇溶液，加入到(2)所得的料液中并搅拌，控制料液温度15°C以下，静置6小时以上；吸去上清液，将下层悬浊液离心，收集沉淀物苄基肝素钠盐，然后洗涤；
4、重盐化称取苄基肝素钠2.5倍重量的苯索氯铵盐和苄基肝素钠，在水溶液中搅拌反应2小时以上，而后再静置分层，去上清，将剩余悬浮物离心，收集沉淀物肝素苄基酯苯索氯铵盐，并用蒸馏水洗涤；
5、解聚反应将苄基肝素苄索铵盐溶于二氯甲烷中，并加入磷腈碱作为催化剂，在室温下搅拌反应24小时以上；然后将反应液转移至饱和的醋酸钠甲醇溶液中，出现沉淀后，离心分离，所得为解聚合的苄基肝素钠盐，甲醇洗涤并干燥；
6、皂化将解聚的苄基肝素钠盐溶于蒸馏水中，于10°C以下，加入氢氧化钠反应2小时以上，再加入氯化钠并用稀盐酸调整pH为6. 5^7. 5，然后向反应液中加入2 3倍的甲醇沉淀，将沉淀洗涤并干燥；
7、碱氧纯化将(6)中所得沉淀溶于蒸馏水中，调整pH值到9.0 11. 0，加入过氧化氢在室温搅拌反应6 8小时；
8、物理纯化将料液转移至纳滤循环罐进行纳滤；测定截留液相对平均分子量和分子量分布，若相对分子量和分子量分布不符合要求，则用1000 Da超滤膜进行超滤操作；再调节滤液PH值到6. 5^7. 4之间，经0. 22 微孔滤器过滤；
9、冻干滤液放入冻干机中干燥。按上述方法，肝素苄基酯的合成中，每公斤肝素-苯索氯铵盐加入的氯化苄的体积为1L。按上述方法,解聚反应中,磷腈碱加入量为节基肝素节索铵盐质量的1%。本发明是根据类似化学合成肝素五糖作用原理，以改良的￠-消除法为基础，通 过创新性地采用重盐化、磷腈碱催化解聚、皂化等步骤，解决了超低分子量肝素制备的传统工艺中大分子肝素过多、小分子肝素聚积等关键性问题。本发明与其他产品的比较如下
权利要求
1.一种高品质超低分子量肝素钠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)肝素-苯索氯铵盐的合成按I:2 3的重量比称取肝素钠和苯索氯铵盐，分别溶于蒸馏水中，将在肝素钠溶液缓慢加入到苯索氯铵盐溶液中，搅拌2小时以上，静置分层，去上清，并将剩余悬浮物离心，收集沉淀物肝素-苯索氯铵盐，然后洗涤并干燥； 2)肝素苄基酯的合成将(I)所得肝素-苯索氯铵盐溶于二甲基甲酰胺，然后加入氯化苄，于55飞(TC下进行酯化反应25 30小时； 3)苄基肝素钠盐的合成配制饱和的醋酸钠乙醇溶液，加入到(2)所得的料液中并搅拌，控制料液温度15°C以下，静置6小时以上，吸去上清液，将下层悬浊液离心，收集沉淀物苄基肝素钠盐，然后洗涤； 4)重盐化称取苄基肝素钠2.5倍重量的苯索氯铵盐，和苄基肝素钠在水溶液中搅拌反应2小时以上，而后再静置分层，去上清，将剩余悬浮物离心，收集沉淀物肝素苄基酯苯索氯铵盐，并用蒸馏水洗涤； 5 )解聚反应将苄基肝素苄索铵盐溶于二氯甲烷中，并加入磷腈碱作为催化剂，在室温下搅拌反应24小时以上，然后将反应液转移至饱和的醋酸钠甲醇溶液中，出现沉淀后，离心分离，所得为解聚合的苄基肝素钠盐，甲醇洗涤并干燥； 6)皂化将解聚的苄基肝素钠盐溶于蒸馏水中，于10°C以下，加入氢氧化钠反应2小时以上，再加入氯化钠并用稀盐酸调整pH为6. 5^7. 5，然后向反应液中加入2 3倍的甲醇沉淀，将沉淀洗涤并干燥； 7)碱氧纯化将(6)中所得沉淀溶于蒸馏水中，调整pH值到9.O 11. 0，加入过氧化氢在室温搅拌反应6 8小时； 8)物理纯化将料液转移至纳滤循环罐进行纳滤；测定截留液相对平均分子量和分子量分布，若相对分子量和分子量分布不符合要求，则用1000 Da超滤膜进行超滤操作；再调节滤液PH值到6. 5^7. 4之间，经O. 22 微孔滤器过滤； 9)冻干滤液放入冻干机中干燥。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，肝素苄基酯的合成中，每公斤肝素-苯索氯铵盐加入的氯化苄的体积为1L。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，解聚反应中，磷腈碱加入量为苄基肝素苄索铵盐质量的1%。
全文摘要
本发明公开了一种高品质超低分子量肝素的制备方法。以改良的β-消除降解法为基础，创新性地加入了重盐化、磷腈碱解聚、皂化等方法解决了料液中的大分子肝素过多、小分子肝素聚积等关键问题，从而制备得到超小分子片段。通过此种方法制备得到的超低分子肝素钠平均分子量为2000～3000，其分子量分布为＜1600的比例≤40.0%；＞4500的比例≤11.0%；抗FXa/FIIa＞30，其中抗FXa效价145-180IU/mg，抗FIIa效价＜5.0IU/mg。与低分子肝素钠和超低分子肝素钠相比，这种高品质超低分子量肝素钠有着非常好的抗血栓活性，更小的出血危险，以及更低的对血小板的影响，有望成为新生代的肝素类抗血栓药物。
文档编号A61P7/02GK102633908SQ201210131730
公开日2012年8月15日 申请日期2012年5月2日 优先权日2012年5月2日
发明者周霞, 郭维, 雷晓刚 申请人:雷晓刚