专利名称：C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽-1类似物及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种新型的C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽-I类似物；本发明同时涉及一种该内吗啡肽-I类似物的制备方法及其在制备镇痛药物中的应用。
背景技术：
在1997年，美国都兰大学神经生物学家Zadina和他的同事们通过免疫组化筛选肽库的办法，从牛脑中分离并且提纯得到了对于μ阿片受体有着很高选择性与亲和 性的配体(见 Zadina, J. Ε. ; Hackler , L. ; Ge, L. J. ; Kastin , A. J. A potent andselective endogenous agonist for the μ -opiate receptor. Nature . 1997, 386:499-502)。该配体被称作是内源性阿片肽，其结构目前发现的有两种，它们分别为内吗啡肽-I (Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)和内吗啡肽-2(Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)。然而有研究表明，内吗啡肽-2有着天然的弱的治疗学特性，其镇痛效能要比内吗啡肽-I的低，并且副作用也比内吗啡肽-I的大。Peter等人也发现，在离体酶解稳定性方面，内吗啡肽_2的稳定性没有内吗啡妝_1 的好(见Peter A, Toth G, Tomboly C，Laus G, Tourwe D. Liquid chromatographicstudy of the enzymatic degradation of endomorphins, with identification byelecteospray ionization mass spectrometry,;1999，846:39-48)。在治疗疼痛中，与吗啡镇痛能力相当的阿片类镇痛药物起着至关重要的作用，特别是对于重度疼痛中的治疗始终处于不能替代的地位。最重要的是，内吗啡肽还对神经疼痛有显著的治疗效果；同时内吗啡肽在有效的镇痛药物浓度下其副作用会更小。但是，这些阿片类的药物不能进入到临床上使用，因为阿片类药物对有疼痛的病人会产生非常多的副作用，这些副作用包括以下几个方面便秘，成瘾，耐受，呕吐，和呼吸抑制等。还有几个内吗啡肽不能成为临床药物的原因是，内吗啡肽镇痛时间比较短，酶解稳定性比较差，通过BBB的能力很弱以及口服无药效等等。因此，通过对内吗啡肽-I进行结构改造，在尽量不降低或提高其亲和活力的前提下，提高酶解稳定性和血脑屏障通透能力，从而得到外周给药产生高效镇痛活性的内吗啡肽-I类似物成为近年研究的方向。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽-I类似物——四肽化合物Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-Phe (4-N02)-NH。本发明的另一目的是提供一种C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽-I类似物的制备方法；
本还有一个目的，就是提供一种C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽-I类似物在制备镇痛药物中的应用。(一)内吗啡肽-I类似物本发明C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽-I类似物(命名为[GAGPNH2]-EM-I)，是在内吗啡肽-I的N端用胍基化修饰，在内吗啡肽-I的2、3位Pro-Typ被D-Ala-Gly替换，4位Phe苯环对位用氨基化修饰。其具体结构式如下
权利要求
1.一种C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽-I类似物，其结构式如下
2.如权利要求I所述C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽类似物的制备方法，包括以下工艺步骤(1)Boc-Phe (4-N02) -NH2 的合成 将叔丁氧羰基保护的对硝基苯丙氨酸充分溶解于四氢呋喃中，加入叔丁氧羰基保护的对硝基苯丙氨酸摩尔量I. (Tl. 5倍的I-羟基苯并三唑，搅拌使其完全溶解，待溶液的颜色变成红褐色后，再加入叔丁氧羰基保护的对硝基苯丙氨酸摩尔量Γ4倍量的N，N-二异丙基乙胺，搅拌反应12 36小时，旋蒸除去四氢呋喃后溶解于水中，乙酸乙酯萃取，有机相依次用柠檬酸、饱和的碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到的白色固体，即为 Boc-Phe (4-N02) -NH2 ； (2)单苄氧羰基化的脒基吡唑盐酸盐的合成 将脒基吡唑盐酸盐完全溶解于二氯甲烷中，加入脒基吡唑盐酸盐摩尔量2飞倍量的苄氧羰基氯，搅拌反应1(Γ30分钟，再加入脒基吡唑盐酸盐摩尔量:Γ8倍量的三乙胺，于(T5°C下搅拌反应广3小时，升温至室温，搅拌1(Γ20小时，旋蒸除去二氯甲烷，用乙酸乙酯萃取，用饱和的氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，重结晶，得到的白色固体即为单苄氧羰基化的脒基吡唑盐酸盐； (3)双苄氧羰基化的脒基吡唑盐酸盐的合成 在惰性气体保护下，于(T5°C下，将氢化钠充分溶解于四氢呋喃中，依次加入单苄氧羰基化的脒基吡唑盐酸盐、苄氧羰酰琥珀酰亚胺，搅拌反应3(Γ48小时，用冰水猝灭，旋蒸除去四氢呋喃后，用乙酸乙酯萃取，依次用柠檬酸、饱和的碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，得到油状混合物，油状混合物经纯化，得到双苄氧羰基化的脒基吡唑盐酸盐晶体； (4)苄氧羰基化的酪氨酸羧基端的活化 于(Γ5 V下，将苄氧羰基保护的酪氨酸溶解于四氢呋喃中，加入苄氧羰基保护的酪氨酸摩尔量广3倍的N-羟基琥珀酰亚胺和苄氧羰基保护的酪氨酸摩尔量f 3倍的N，N’ -二环己基碳二亚胺，搅拌使其充分溶解，继续搅拌反应1(Γ20分钟，升温至室温，反应12 18小时，抽滤，除去生成的二环己基脲，得到活化滤液； (5)接肽反应 将Cbz保护的酪氨酸摩尔量广4倍的丙氨酸溶于饱和碳酸氢钠溶液中，再将上述得到的活化滤液加入其中，于(T5°C下搅拌反应2(Γ60分钟，升温至室温，反应12 18小时；旋蒸除去四氢呋喃，用乙酸乙酯萃取，除去有机相，保留水相；于犷51下调ρΗ=2飞，然后用乙酸乙酯萃取，有机相依次用质量浓度5 10%的柠檬酸水溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到淡黄色的油状液体；柱层析分离，得到无色的油状物，即为氮端的二肽化合物； (6)H-Tyr-D-Ala-OH 的而成 将氮端的二肽化合物溶于无水甲醇中，加入活性钯碳，室温搅拌下，通氢气反应O. 5 2h;真空抽滤除去活性钯碳，减压浓缩，得无色油状物即为二肽化合物H-Tyr-D-Ala-OH ； (7)Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-OH 的合成 将步骤(3)合成的双苄氧羰基化的脒基吡唑盐酸盐，步骤(6)合成的H-Tyr-D-Ala-OH以1:广1:3的摩尔比加入到N-N-二甲基甲酰胺中，再加入双苄氧羰基化的脒基吡唑盐酸盐摩尔量4 8倍的三乙胺，于(T5°C下搅拌反应25 35分钟，升温至室温，反应48^96小时；用乙酸乙酯萃取，有机相依次用5 10%的柠檬酸水溶液、饱和的食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到淡黄色油状液体；柱层析分离，得到无色油状物，即为Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-OH ；(8)Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-OH 的合成 于 0 5°C下，将 Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-OH溶解于四氢呋喃中，加入 Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-OH摩尔量广3倍的N，N’ - 二环己基碳二亚胺，搅拌使其充分溶解，继续搅拌反应1(Γ20分钟，升温至室温，反应12 18小时，抽滤，除去生成的二环己基脲，得到活化滤液； 将Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-OH摩尔量广4倍的甘氨酸溶于饱和碳酸氢钠溶液中，再将上述活化滤液加入其中，于(T5°C下搅拌反应2(Γ60分钟，升温至室温，反应12 18小时；旋蒸除去四氢呋喃，用乙酸乙酯萃取，除去有机相，保留水相；于0 51下调ρΗ=2飞，然后用乙酸乙酯萃取，有机相依次用质量浓度5 10%的柠檬酸水溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到淡黄色的油状液体；柱层析分离，得到无色的油状物，即为氮端的三肽化合物Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-OH ； (9 )脱Boc-Phe (4-N02) -NH2氨基酸的叔丁氧羰基 于(T5°C下，将步骤(I)合成的氨基酸Boc-Phe (4_N02)-NH2溶于二氯甲烷，之后加入氨基酸Boc-Phe (4-N02) -NH2摩尔量2飞倍量的三氟乙酸，搅拌反应O. 5^2小时，浓缩，得到白色的固体，用乙醚结晶，得到白色固体，即为氨基酸H-Phe (4-N02) -NH2 ；(10)Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-Phe (4-N02)-NH2 的合成 于0 5 V下，将Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-OH溶解于四氢呋喃中，加入Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-OH摩尔量f 3倍的N，N’ - 二环己基碳二亚胺，搅拌使其充分溶解，继续搅拌反应1(Γ20分钟，升温至室温，反应12 18小时，抽滤，除去生成的二环己基脲，得到活化滤液；将 Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-OH 摩尔量 f 4 倍的氨基酸 H-Phe (4_N02) -NH2 溶于饱和碳酸氢钠溶液中，再将上述活化滤液加入其中，于(T5°C下搅拌反应2(Γ60分钟，升温至室温，反应12 18小时；旋蒸除去四氢呋喃，用乙酸乙酯萃取，然后用乙酸乙酯萃取，有机相依次用质量浓度5 10%的柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥，浓缩，得到淡黄色的油状液体；柱层析分离，得到白色固体，即为四肽化合物Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-Phe (4-N02) -NH2 ；(11)⑶-Tyr-D- Ala-Gly-Phe (4_NH2) -NH2 的合成 将四肽化合物Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-Phe (4_N02) -NH2溶于无水甲醇中，加入活性钯碳，室温搅拌下，通氢气反应O. 5^2h ;真空抽滤除去活性钯碳，减压浓缩，得白色护体即为四肽化合物 Cbz2-GU-Tyr-D-Ala-Gly-Phe (4_N02) -NH。
3.如权利要求2所述C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽类似物的制备方法，其特征在于步骤(2)所述重结晶工艺为先用乙酸乙酯溶解白色固体，再用石油醚或环己烷进行结晶，静置，过滤。
4.如权利要求2所述C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽类似物的制备方法，其特征在于步骤(3)所述油状混合物的纯化工艺为将油状混合物用二氯甲烷溶解，以石油醚与乙酸乙酯以6:广3:1的体积比混合也为展开剂，柱层析分离，得到无色块状晶体。
5.如权利要求2所述C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽类似物的制备方法，其特征在于步骤(5)所述柱层析分离的展开剂体系为石油醚、乙酸乙酯，冰醋酸以(30 60) : (60 110) : I体积比的混合液。
6.如权利要求2所述C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽类似物的制备方法，其特征在于步骤(6)所述活性钯碳的加入量为氮端的二肽化合物或四肽化合物质量的25% 30% ;所述活性钯碳中钯的质量百分数为10 20%。
7.如权利要求2所述C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽类似物的制备方法，其特征在于步骤(7)所述淡黄色油状液体的柱层析分离工艺为先用乙酸乙酯与石油醚以1:广1:4体积比混合的展开剂过硅胶柱，再用石油醚、乙酸乙酯、冰醋酸以(3 8) : (Γ3):1的体积比混合的展开剂冲柱。
8.如权利要求2所述C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽类似物的制备方法，其特征在于步骤(10)所述淡黄色的油状液体的柱层析分离方法先用乙酸石油醚与乙酯以1Γ4:1体积比混合的展开剂过硅胶柱，再用乙酸乙酯的展开剂冲柱。
9.如权利要求I所述C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽-I类似物在制备镇痛药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种C端苯丙氨酸对位氨基化修饰的内吗啡肽-1类似物，是在内吗啡肽-1的N端用胍基化修饰，在内吗啡肽-1的2、3位的Pro-Typ被D-Ala-Gly替换，4位Phe苯环对位用氨基化修饰通过液相合成法合成了内吗啡肽-1的新型类似物[GAGPNH2]-EM-1。通过放射配体受体结合实验，离体酶解稳定性实验，温浴甩尾镇痛实验对该类似物进行了一系列的生理学和药理学活性鉴定，结果表明本发明的类似物较其母体具有跟高的亲和能力和更好的酶解稳定性，以及更强的血脑屏障通透能力强，并且副作用低。因此，以其为活性物质，用于制备临床镇痛药物，具有很好的应用前景。
文档编号A61P29/00GK102659920SQ20121014774
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者梁媛, 王一青, 王锐 申请人:兰州大学