专利名称：Cd200在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及⑶200或⑶200融合蛋白在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用。
背景技术：
系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种可累及多个脏器组织的自身免疫性疾病，免疫调节缺陷特别是免疫耐受丧失、自身抗体产生、免疫复合物沉积、细胞因子失衡和炎症应答失控为其主要的免疫病理机制。而吞噬功能障碍使得凋亡细胞不能及时被清理以致大量自身抗原释放诱发自身免疫被认为是疾病启动的重要环节，但 内在机制不清。此外，⑶4+Q)25hlghFoxP3+调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs),作为维持T细胞稳态和免疫耐受的关键性调节组分，在SLE患者中存在数量和/或质量上的缺陷，参与了 SLE疾病的发生发展。⑶200是隶属免疫球蛋白超家族的I型跨膜糖蛋白，可表达于多种细胞，包括B细胞、活化T细胞、树突细胞(dendritic cells, DCs)以及神经元细胞。⑶200分子由胞外段、跨膜段和胞内段三个结构域组成，其胞内结构域缺乏信号基序。CD200受体包括⑶200R1-4，其中⑶200R1亲和力最高。⑶200受体主要分布于髓系来源的细胞如DCs、巨噬细胞，也表达于活化T细胞。已知⑶200/⑶200R1信号通路具有免疫调节作用，可抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒、下调巨噬细胞功能等。Hoek等发现CD200缺乏的小鼠中枢神经系统的巨噬细胞/髓系细胞的内源性活化增加，对实验性变应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)和胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)的易感性增加。给予 CD200R_Ig 阻断 CD200-CD200R的相互作用可增加小鼠对CIA的易感性。Broderick等也报道阻断⑶200可导致小鼠早发实验性自身免疫性视网膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU) oRosenblum等人在研究CD200敲除小鼠中紫外线介导半抗原耐受的实验中发现，皮肤细胞表达的CD200在先天性自身免疫性脱发中发挥重要作用。尽管诸多证据显示CD200/CD200R1在实验性自身免疫性疾病中具有重要作用，这一信号通路在人类的自身免疫性疾病如SLE中的作用仍不明确。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供CD200或CD200融合蛋白在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用。其中，CD200可单独或与其他片段融合成融合蛋白进行应用，所述的融合蛋白可优选为CD200Fab、CD200Fc、CD200-毒素、CD200-细胞因子，更优选为CD200Fc融合蛋白。进一步地，本发明还提供一种纠正SLE患者中诱导生成⑶4+⑶25highFoxP3+Treg细胞缺陷的方法，其为施用有效量的CD200或CD200融合蛋白。其中，所述的诱导生成⑶4+CD25highFoxP3+Treg细胞缺陷为TGF-P信号转导分子诱导生成⑶4+⑶25highFoxP3+Treg细胞缺陷。再进一步地，本发明还提供一种治疗系统性红斑狼疮的药物，其为含有治疗有效量的⑶200或⑶200融合蛋白。所述的融合蛋白可优选为CD200Fab、CD200Fc、CD200-毒素、CD200-细胞因子，更优选为⑶200Fc融合蛋白。进一步地，本发明还提供激动型抗⑶200R1抗体在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用。更进一步地，本发明还提供一种治疗系统性红斑狼疮的药物，其含有治疗有效量的激动型抗⑶200R1抗体。 本领域技术人员应当理解，所述的药物中还可含有常规的辅料，并将药物制备成本领域常规的剂型，如片剂、注射剂等。本发明表明，SLE患者中⑶200+细胞和血清⑶200水平显著增高，而⑶200R1 mRNA和蛋白水平均显著下降，以⑶4+T细胞和DCs尤为显著。SLE患者中，⑶200Fc可减少Th 17细胞比例并纠正⑶4+CD25highFOXP3+Treg的诱导缺陷。而拮抗性抗⑶200R1抗体可促进抗⑶3/抗⑶28刺激的⑶4+T细胞增殖。此外，还发现SLE患者早期凋亡细胞的⑶200表达上调并可抑制DCs对其结合和吞噬的能力。当体外给予足量的外源性⑶200分子时能够纠正系统性红斑狼疮患者调节T细胞的发育缺陷和减少Thl7的发育分化并抑制DC的迁移趋化功能，而已有较多证据证实调节T细胞缺陷和Thl7细胞增多及DC的功能异常参与SLE的发病机制，表明CD200分子可能具有潜在的治疗价值。而制备高亲和力的CD200重组蛋白是本领域的常规技术，应用简单，可通过体内对调节T细胞和Thl7细胞及DC细胞的调节而多环节发挥治疗作用，可制备成系统性红斑狼疮的新型治疗药物。拮抗性抗CD200R1抗体能够促进淋巴细胞增殖，表明激动型抗CD200R1能发挥抑制淋巴细胞增殖的作用，而CD200发挥的免疫调节作用需通过受体实现。体外实验中给予足量的⑶200分子是通过结合并激动⑶200R特别是⑶200R1实现的，因此，表明激动型抗CD200R1发挥抑制淋巴细胞增殖及多环节免疫调节作用，从而抑制系统性红斑狼疮患者体内过度亢进的免疫状态而发挥治疗作用。
图I所示为SLE患者和健康对照⑶200和⑶200R1的表达。其中，A, SLE患者PBMC中的⑶200表达上调。直方图显示PBMC中⑶200+细胞，灰色部分为同型对照；B，SLE患者(n=53)和健康对照(n=24)的PBMC及CD4+T细胞、CD14.单核细胞(CDM+Mo)、CDllcXD123highpDC(pDC)和 CDllc+CD1231nDC(mDC)等各亚群中 CD200+细胞比例；C, SLE 患者中，⑶3+⑶200+细胞比例与血清C3水平负相关；D，SLE患者PBMC中⑶200R1的表达下调。直方图显示PBMC中的⑶200R1+细胞，灰色部分为同型对照；E，SLE患者(n=53)和健康对照(n=24)的 PBMC 及 CD4+T 细胞、CD14+单核细胞(CDM+Mo)、CDllcXD123high pDC(pDC)和CDllc+CD1231nDC(mDC)等各亚群中 CD200R1+ 细胞比例；F，SLE 患者 PBMC 中 CD200mRNA 和⑶200RlmRNA表达均显著低于健康对照；G，SLE患者中血清⑶200水平与血清C3水平负相关(r=_0. 45, p=0. 014)。图2所示为浆样树突细胞PDC (⑶I lc_CD123high) (Gate2)和髓样树突细胞mDC (CD11c+CD1230 (Gate3)中 CD200 表达的流式图。图3 所示为纯真 T 细胞(naive T) (CD4+CD45RA+)和记忆 T 细胞(CD4+CD45R0+)中⑶200R1表达的流式图。图4所示为PBMC中D0K2(左图)和p-D0K2(右图)表达的免疫印迹分析。⑶200Fc可诱导D0K2 (右图泳道2)磷酸化，这一作用可通过与拮抗性抗⑶200R1抗体的预孵育而阻断(右图泳道3)。图5所示为⑶200Fc和拮抗性抗⑶200R1抗体对于抗⑶3/抗⑶28刺激的⑶4+T细胞增殖的影响。其中，A, SLE和健康对照中，⑶200Fc对于抗⑶3/抗⑶28刺激的⑶4+T细胞增殖无显著影响。B，SLE患者中，拮抗性抗⑶200R1抗体可促进抗⑶3/抗⑶28刺激下的CD4+T细胞增殖，并呈量效关系。健康对照中无此发现。流式散点图为代表图，共进行了5例SLE和5例健康对照的实验。图6A，SLE患者(n=30) PBMC中早期自发凋亡地淋巴细胞比例(Annexin V+PF) 显著高于健康对照(n=15) (p=0. 027)。B，早期凋亡细胞⑶200表达显著高于活细胞CD200 (Annexin V_PI_)，而同种荧光标记的CD4无此趋势(n=45) (p〈0. 001)。C，以早期凋亡细胞与活细胞中⑶200的阳性率之比定义的⑶200相对表达率，SLE患者显著高于健康对照(p=0. 037)。图7所示为⑶200Fc抑制DC迁移、结合并吞噬早期凋亡细胞(Annexin V+PF)。其中，A，不成熟DC(PKH67染色，绿色)与靶细胞(PKH26染色，红色)共孵育，荧光显微镜检，白色箭头不成熟DC贴近靶细胞；黄色箭头不成熟DC吞噬靶细胞；左上靶细胞为⑶200_活细胞；右上靶细胞为⑶200+活细胞；左下靶细胞为⑶200_凋亡细胞；右下靶细胞为⑶200+凋亡细胞。B，荧光显微镜计数结合并吞噬了靶细胞的DC的比例。计数10个视野内的所有细胞(平均40-50个细胞/HP，共约计数400-500个细胞)。C，流式细胞仪定量吞噬了靶细胞的DC(PKH26/PKH67双阳性)。D，transwell实验中DC迁移的比例(n=5)。图8所示为⑶200Fc减少SLE患者Thl7细胞的分化。SLE患者(n=9)或健康对照(n=6)的PBMC分别与⑶200Fc共培养48h，流式细胞仪检测Thl7细胞比例。图中所示数据以Thl7细胞所占⑶4+T细胞的比例表示。A图显示一例SLE患者和一例健康对照PBMC分别与⑶200Fc和IgG对照孵育后的Thl7表达流式代表图；B图显示9例SLE患者PBMC与⑶200Fc和IgG对照孵育的Thl7分化的统计学分析结果。图9所示为⑶200Fc可纠正SLE患者中TGF- P诱导⑶4+CD25飞细胞分化为CD4+CD25highFoxP3+Treg细胞的缺陷。分选SLE和健康对照PBMC中的CD4+CD25_T细胞，培养于RPMI 1640完全培养基，给予抗⑶3/抗⑶28抗体刺激，并加入IL-2和TGF- ^联合培养，给予⑶200Fc处理7天，数据来源于5个独立的实验。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。FITC、PE、APC 或 PE-Cy7 标记的鼠抗人 CD4 (RPA-T4)、CDllc (3. 9)、CD25 (BC96)、CD200R(0X-108)和CD123(6H6)及相应同型对照均购自美国BioLegend公司；CD200 (0X104)、IFN- y (B27)、IL-4 (MP4-25)、IL-17 (eBio64DEC17)、Foxp3 (PCHlOl)及相应同型对照购自美国eBioscience公司；重组人IL_2、IL_4、TGF_ P I和GM-CSF及相应对照购自美国P印roTech公司；重组人CD200_Fc、抗人CD200R1抗体及对照、CD200 Duoset ELISA试剂盒均购自美国R&D公司KD4+⑶25+调节性T细胞磁珠分选试剂盒(Miltenyi Biotec130-091-301)购自德国美天旎公司；Cell Trace CFSE细胞增殖试剂盒和凋亡试剂盒(Vybrant Apoptosis Assay Kit # 2)购自美国 Invitrogen公司;PKH26、PKH67、ionomycin和 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)购自美国 Sigma-Aldrich 公司。实施例I流式细胞仪检测细胞表面CD200和⑶200R1的表达I)患者与健康对照选取2009 2011年在北京协和医院风湿科就诊的SLE患者161例(见表I)，诊断均符合由美国风湿学会(American College of Rheumatology, ACR) 1987年修订的分类标准。患者均为女性，年龄12 55岁(平均29. 0±10. 2岁)。另选取性别年龄匹配的健康对照95人。该研究通过北京协和医院伦理委员会伦理审批。表I SLE患者的特征(n=161)
权利要求
1.CD200或CD200融合蛋白在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的CD200融合蛋白为CD200Fab、CD200Fc、CD200-毒素、CD200-细胞因子。
3.一种纠正SLE患者中诱导生成⑶4+⑶25highFOXP3+Treg细胞缺陷的方法，其特征在于，施用有效量的⑶200或⑶200融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的诱导生成⑶4+CD25highFOXP3+Treg细胞缺陷为TGF-P信号转导分子诱导生成⑶4+CD25highFOXP3+Treg细胞缺陷。
5.一种治疗系统性红斑狼疮的药物，其特征在于，含有治疗有效量的CD200或CD200融合蛋白。
6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述的CD200融合蛋白为CD200Fab、CD200Fc、CD200-毒素、CD200-细胞因子。
7.激动型抗CD200R1抗体在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用。
8.一种治疗系统性红斑狼疮的药物，其特征在于，含有治疗有效量的激动型抗CD200R1 抗体。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，具体涉及CD200或CD200融合蛋白在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用。当体外给予足量的外源性CD200分子时能够纠正系统性红斑狼疮患者调节T细胞的发育缺陷和减少Th17的发育分化并抑制DC的迁移趋化功能，表明CD200分子具有潜在的治疗价值。而制备高亲和力的CD200重组蛋白是本领域的常规技术，应用简单，可通过体内对调节T细胞和Th17细胞及DC细胞的调节而多环节发挥治疗作用，可制备成系统性红斑狼疮的新型治疗药物。
文档编号A61P37/02GK102698266SQ20121015030
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月15日 优先权日2012年5月15日
发明者张烜, 李扬, 赵丽丹 申请人:中国医学科学院北京协和医院