专利名称：一种采用振荡式生物反应器制备猪瘟活疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及疫苗制备领域，具体地，涉及采用振荡式生物反应器制备猪瘟活疫苗的方法。
背景技术：
猪痕(classical swine fever, CSF)最早发生于1833年美国的俄亥俄州，初称猪霍乱，1903年被证明病原体是一种病毒，欧洲 则称之为古典猪瘟。我国最早1925年在东南大学农科院有免疫血清方面的研究报告。猪瘟是世界范围内猪的最严重的疾病之一，因而被OIE (国际兽医局)列为A类传染病，我国也将其列为一类传染病。其病原为猪瘟病毒(CSFV)，属黄病毒科瘟病毒属成员。以出血和发热为主要特征，是一种对猪危害极大的传染病。当前使用的猪瘟疫苗均是用兔化弱毒疫苗(HCLV，即著名的C株，或中国株)，根据生产工艺的不同分为猪瘟活疫苗(细胞源)，即猪瘟细胞苗；猪瘟活疫苗(兔源)，即猪瘟组织苗，猪瘟组织苗又根据生产用成年兔还是乳兔分为猪瘟脾淋苗和猪瘟乳兔苗。世界公认的中国C株兔化弱毒的突出优点是，用其接种的猪不产生病毒血症和脑炎病变，可以安全地免疫接种任何怀孕期的母猪和哺乳仔猪，不影响受精率及存活率，不引起流产、死胎，可安全地用于建立种猪群(Tesmer等，1973)。常用的还有日本GPE株、法国Thiverval株等都是广泛应用的CSFV疫苗株，一般均可提供终生免疫。传统转瓶法制备猪瘟活疫苗的工艺其不足在于存在外源污染的危险，产毒滴度较低；单位体积内有效工作细胞数量较低；效率低下，批次间差异大，稳定性差。因此开发研制新型制备猪瘟疫苗的方法是提高病毒产量和节约成本的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供稳定高效制备猪瘟活疫苗的方法，以克服现有技术的不足。本发明提供一种采用振荡式生物反应器制备猪瘟活疫苗的方法，包括下列步骤(I)培养制苗用细胞将制苗用细胞接种到含有细胞培养液与微载体的生物反应器罐内，启动细胞吸附程序，振荡式吸附3 4h后或细胞吸附率达80%以上时，转化为细胞培养程序，进行振荡式细胞培养，待细胞生长至I. 5X IO8 3X IO8个/g微载体时，停止培养；(2)繁殖制苗毒液将猪瘟病毒悬液接种于步骤(I)培养的细胞中，倒置吸附0. 5 Ih后，进行振荡式病毒培养，每I 2d收获病毒液，并及时更换维持液,收获次数为15 20次，汇总收获的病毒液；(3)将经检验合格的病毒液澄清过滤，加入冻干保护剂，充分混匀后定量分装，冻干，即得到猪瘟活疫苗。
本发明方法所用的生物反应器为BelloCell型振荡式细胞微载体悬浮培养生物反应器。该生物反应器主要由主体机台、控制器及培养瓶组成。工作过程如下主体机台由步进马达驱动可上下移动薄板平台。当平台上升时，BelloCell-500内下方伸缩瓶中之培养基挤压至上瓶身，而使得载体浸润于培养基中，让细胞进行所需养分和废弃物的交换；当平台下降时，培养基则再次回流至下方伸缩瓶，使载体暴露于空气中，让氧气快速交换，形成良好的细胞培养环境。本发明方法步骤(I)中生物反应器罐内BioNoc II微载体密度为llg/L，接入细胞量为I X 107/g IX 108/g微载体。使用的微载体为多孔性不织布，微载体数量为865±5%个，约为5. 5g，约占IOml的空间，可提供细胞生长面积约达2400cm2/g。所述微载体为网状和/或片状。所述步骤(I)振荡式细胞吸附程序参数为细胞培养液通过微载体的上升速度为I. Omm/s，顶端停留25s，下降速度为I. Omm/s，底端停留Os ;振荡式细胞培养程序参数为细 胞培养液通过微载体的上升速度为1.5mm/s,顶端停留Os,下降速度为1.5mm/s,底端停留60s。本发明步骤⑵中接种10% 20%猪瘟兔化弱毒株细胞毒种或I % 2%猪瘟兔化弱毒株脾毒种，所述百分比为毒种与病毒培养液的体积比。所述猪瘟兔化弱毒株细胞毒种病毒滴度为每Iml含病毒> 100000个家兔感染量。所述猪瘟兔化弱毒株脾毒种病毒滴度为每Iml含病毒> 100000个家兔感染量。其中步骤(2)振荡式病毒培养参数为病毒培养液通过微载体的上升速度为I. Omm/s,顶端停留IOs ;病毒培养液通过微载体的下降速度I. Omm/s,底端停留30s。应当理解，本领域技术人员可根据实际生产情况进行反应器控制参数的调整。本发明步骤(2)病毒培养后获得的病毒液每Iml含病毒> 1000000个家兔感染量。本发明制苗用细胞为PK15细胞系。本发明细胞培养液为含5% 8%胎牛血清的DMEM，病毒培养液、维持液为含I 2%胎牛血清的MEM，pH值为7. 0 7. 4。本发明细胞培养和病毒培养的条件为温度为36. 5 37°C，CO2浓度1% 5%。本发明方法步骤(3)中所述的冻干保护剂为5%蔗糖脱脂牛奶。本发明提供了上述方法在制备猪瘟活疫苗中的应用。本发明提供了上述方法制备得到的猪瘟活疫苗。本发明提供了一种采用振荡式生物反应器制备猪瘟活疫苗的方法，其有益效果在于I)本发明方法生产的猪瘟病毒毒价高，兔体热反应含量比用传统转瓶工艺生产的猪瘟病毒高约10倍，按照《中华人民共和国兽药典(2010版)》方法对制得的疫苗进行无菌、支原体、鉴别、外源病毒、安全、效力等各项检验，均符合中规定；2)应用振荡式微载体反应器培养PK15细胞的猪瘟病毒工艺，微载体提供了更大的细胞贴壁表面积，单位体积培养液的细胞产率高，可以随时观察细胞在载体表面的生长情况，高培养密度PK15细胞能提高病毒滴度，本方法随时监控细胞生长或病毒繁殖时的最佳生化条件，且每批反应器生产上清的病毒滴度均一，培养基利用率高，病毒收获过程不复杂，疫苗批次间差异小、质量稳定；3)采用本发明振荡式细胞微载体悬浮培养系统，与传统悬浮培养系统相比，细胞培养方法简单，培养时不产生剪切力与气泡，细胞生长环境良好；4)本发明方法的培养系统占用空间小，且操作劳动强度小，减小污染环节，使其具有显著的经济效益。
图I为细胞接种2天时微载体上细胞的显微照片，箭头所指为微载体上的细胞；图2为病毒接种5天时微载体上细胞的显微照片，箭头所指为微载体上的细胞；图3为振荡式微载体悬浮培养生物反应器结构示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。本发明实施例中所使用的生物反应器为美国赛宇公司的BelloCell型生物反应器(主机台BelloStage-3000,控制器，罐体BelloCell-500)，所使用的载体为BioNoc II多孔性不织布，载体数量为865±5%个载体，约为5. 5g，约占IOml的空间，可提供细胞生长面积约达2400cm2/g。实施例中所使用的生物反应器主要由主体机台、控制器及培养瓶组成。工作过程如下主体机台由步进马达驱动可上下移动薄板平台。当平台上升时，BelloCell-500内下方伸缩瓶中之培养基挤压至上瓶身，而使得载体浸润于培养基中，让细胞进行所需养分和废弃物的交换；当平台下降时，培养基则再次回流至下方伸缩瓶，使载体暴露于空气中，让氧气快速交换，形成良好的细胞培养环境。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I用振荡式微载体悬浮生物反应器规模生产猪痕病毒(I)I、病毒与细胞株用于制作猪瘟活疫苗的病毒是猪瘟兔化弱毒株(C株)，来源于中国兽医药品监察所国家兽医微生物菌种保藏中心，经过致病性测试，本弱毒株病毒不具有致病性(该毒株按照细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用)。以对猪瘟兔化弱毒株(C株)具有良好敏感性的猪肾细胞系(PK15)，作为制苗用细胞系。2、制备方法2. I制苗用细胞的培养将制苗用细胞系PK15细胞接种到含500mLDMEM液体培养基(包括 8%胎牛血清(FBS)、100UI/mL青霉素、IOOii g/mL链霉素 pH7. 2)和 5. 5g BioNoc II载体的罐体内；细胞初始接种量为1.25父107个细胞/^微载体。于37°C、5% CO2培养环境下，细胞吸附4h，使其最大量地吸附载体之上。细胞吸附程序参数为培养液通过微载体的上升速度为I. Omm/s，顶端停留25s，下降速度为I. Omm/s，底端停留Os ; ;4h后，细胞吸附率达80%以上，切换为细胞培养程序，使接种细胞最高效的生长。细胞培养程序参数为培养液通过微载体的上升速度为I. 5mm/s,顶端停留Os,下降速度为I. 5mm/s,底端停留60s。细胞接种2天时微载体上细胞的显微照片见图I。2. 2制苗毒液的繁殖于37°C、5% CO2培养环境下，细胞在载体上生长4天，细胞数达3 X IO8个细胞/g微载体，将兔化弱毒株细胞毒种或猪瘟兔化弱毒株脾毒种(每Iml含病毒> 100000个家兔感染量)分别各自按病毒培养液体积的接种于上述细胞。以MEM为液体培养基(包括I % FBS、100UI/mL青霉素、100 u g/mL链霉素，pH7. 2)，倒置吸附Ih后,启动病毒培养程序,即培养液通过微载体的上升速度为I. Omm/s,持续IOs ;培养液通过微载体的下降速度为I. Omm/s，持续30s。于37°C、5% CO2培养环境下继续培养，每天换液，从接毒后的第4天开始每天收获病毒液一次，连续收获20次，并置-20°C保存。病毒接种5天时微载体上细胞的显微照片见图2。本实施例所使用的振荡式微载体悬浮培养生物反应器结构示意图见图3。收获病毒液(半成品)的检验按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录42,49页进行检验，检验结果无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用，各次收获的病毒液分别用家兔测定，每Iml含病毒> 1000000个家兔感染量。 2. 3配苗、分装及冻干经检验合格的病毒液，混合于同一容器内，澄清过滤后，按I I的比例加入5%蔗糖脱脂乳稳定剂，充分摇匀，定量分装，每头份含细胞毒液不少于
0.015mL，分装冻干后制得成品。成品检验按照《中华人们共和国兽药典》(2010年版)进行检验。以猪瘟细胞毒、猪瘟脾毒为制苗毒种使用上述方法分别制成3批疫苗，共6批疫苗，猪瘟细胞毒源的疫苗编号分别为PK15-1-01、PK15-1-02、PK15-1-03和猪瘟脾毒源的疫苗编号为 PK15-1-11、PK15-1-12、PK15-1-13。3、结果3. I半成品检验制备6批半成品，按照《中华人们共和国兽药典》(2010年版)要求进行了无菌检验、支原体检验、支原体检验，6批半成品均未检出细菌、霉菌、支原体和外源病毒，6批半成品病毒含量达到100万家兔感染量/mL，是传统转瓶培养工艺生产猪瘟兔化弱疫苗(细胞源)半成品标准(5万家兔感染量/mL)的20倍。3. 2成品检验3. 2. I物理性状检验制备的6批疫苗，其均为乳白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加入稀释液后溶解迅速，无异味。3. 2. 2无菌检验按照《中华人们共和国兽药典》(2010年版)附录42页进行检验，所制疫苗均为无菌生长。3. 2. 3支原体检验按照《中华人们共和国兽药典》(2010年版)附录49页进行检验，所制疫苗均为无支原体生长。3. 2. 4鉴别检验将疫苗用生理盐水稀释成每ml含100个兔子的最小感染量的病毒悬液，与等量的抗猪瘟病毒特异性血清充分混合，置15°C作用60分钟，期间振摇2 3次。同时设病毒对照和生理盐水对照。中和结束后，分别接种兔子2只，每只兔子耳静脉注射I. 0ml，测温方法及体温反应标准同效力检验项。6批疫苗样品的结果，除阳性对照组出现热反应外，其余组在接种后120h内均不出现热反应。3. 2. 5外源病毒检验按照《中华人们共和国兽药典》(2010年版)附录40页进行检验，所制疫苗均为无外源病毒污染。3. 2. 6安全检验用生理盐水将疫苗稀释成6头份/ml，每批疫苗分别肌注健康易感猪4头，每头5ml (含30头份)。接种后测温观察，按《中华人们共和国兽药典》(2010年版)72页进行。结果表明各批次试验猪体温正常，其他体征正常，判断疫苗合格。
3. 2. 7效力检验选择用兔检验的方法，将疫苗用灭菌生理盐水稀释成不同浓度，耳缘静脉注射体重I. 5 3. Okg的兔子2只，每只I. 0ml，按照《中华人们共和国兽药典》(2010年版)72页进行。疫苗效力检验合格，每头份含有15000个家兔感染量，是传统猪瘟活疫苗(细胞源)疫苗效力标准的20倍，结果见表I。表I家兔效力检验结果
权利要求
1.一种采用振荡式生物反应器制备猪瘟活疫苗的方法，其特征在于包括下列步骤 1)培养制苗用细胞 将制苗用细胞接种到含有细胞培养液与微载体的生物反应器罐内，启动细胞吸附程序，振荡式吸附3 4h后或细胞吸附率达80%以上时，转化为细胞培养程序，进行振荡式细胞培养，待细胞生长至I. 5X IO8 3X IO8个/g微载体时，停止培养； 2)繁殖制苗毒液 将猪瘟病毒悬液接种于步骤I)培养的细胞中，倒置吸附0. 5 Ih后，进行振荡式病毒培养，每I 2d收获病毒液,并及时更换维持液,收获次数为15 20次,汇总收获的病毒液； 3)将经检验合格的病毒液澄清过滤，加入冻干保护剂，充分混匀后定量分装，冻干，即得到猪痕活疫苗。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为BelloCell型振荡式细胞微载体悬浮培养生物反应器。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤I)生物反应器罐内BioNocII微载体密度为llg/L，接入细胞量为IXioVg IXioVg微载体。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤I)振荡式细胞吸附程序参数为细胞培养液通过微载体的上升速度为1.0mm/s,顶端停留25s,下降速度为1.0mm/s,底端停留Os ;振荡式细胞培养程序参数为细胞培养液通过微载体的上升速度为I. 5mm/s，顶端停留Os,下降速度为1.5mm/s,底端停留60s。
5.如权利要求I所述方法，其特征在于，步骤2)中接种10% 20%猪瘟兔化弱毒株细胞毒种或1% 2%猪瘟兔化弱毒株脾毒种，所述百分比为毒种与病毒培养液的体积比。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2)振荡式病毒培养参数为病毒培养液通过微载体的上升速度为1.0mm/s,顶端停留IOs ;病毒培养液通过微载体的下降速度1.0mm/s,底端停留30s。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2)病毒培养后获得的病毒液每Iml含病毒> 1000000个家兔感染量。
8.如权利要求I所述方法，其特征在于，所述制苗用细胞为PK15细胞系；细胞培养液为含5% 8%胎牛血清的DMEM，病毒培养液为含I 2%胎牛血清的MEM，pH值为7. 0 7. 4 ;培养温度为36. 5 37°C, CO2浓度1% 5%。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤3)中所述的冻干保护剂为5%蔗糖脱脂牛奶。
10.权利要求1-9任一所述的方法制备的猪瘟活疫苗。
全文摘要
本发明提供了一种猪瘟活疫苗的制备方法，该方法将制苗用细胞接种到含有培养液与微载体的振荡式生物反应器中，使细胞贴附在微载体上。待细胞密度达到约108/g微载体时，接种猪瘟兔化弱毒株，繁殖病毒。收获病毒液，澄清过滤后加入冻干保护剂，充分混匀后定量分装，冻干，得到猪瘟活疫苗。使用本发明的制备方法，细胞生长快、密度高、可连续培养和收获，病毒产量高，生产工艺简单。优于目前使用的传统制备猪瘟疫苗的方法，具有良好的应用前景。
文档编号A61P31/14GK102743748SQ201210181238
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月4日 优先权日2011年12月12日
发明者周建民, 潘春刚, 田宇婧, 马良 申请人:中牧实业股份有限公司