专利名称：一种抗ev71病毒寡核苷酸的结构和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种固相合成的寡核苷酸的序列、结构及其在治疗EV71(肠道病毒71型)病毒(Human enterovirus 71)感染相关疾病中的用途。
背景技术：
EV 71病毒感染性强且致病率高，尤其是神经系统方面的并发症。该病易于传播，容易发生流行，预防控制难度大。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利等国家相继暴发以中枢神经系统疾病为主要临床特征的EV71型手足口病流行，并导致较高的病死率和致残率。1997年以来，EV71感染为主的手足口病在马来西亚、中国台湾、新加坡等地大规模暴发流行。1998年中国台湾发生迄今最大的一次主要为EV71型手足口病流行，共报告129106例手足口病或疱疹性咽峡炎病例，其中重症患1405例，死亡78例。中国内地自1981年在 上海始见本病，此后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北及广东等十几个省市均有EV71型手足口病的发生和流行。特别值得注意的是近年来本病流行有蔓延增多趋势。2008年3月10日至5月31日短短时间内安徽阜阳共报告手足口病7470例，共发现111例重症病例，其中死亡23例，病死率0. 31 %。目前EV71病毒感染无特殊治疗药物，故临床上对无并发症患者之治疗只能采取支持性疗法，而对有并发症的患者也只能对症治疗，采取一些降颅压、降温、辅助抗病毒等的治疗。因此，研究特异性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒感染的药物对治疗与预防EV71病毒感染及其相关性疾病具有重要现实意义。核酸类药物是一类全新的基因靶向创新药物，长期以来一直是国际研究的热点，特别是近几年小核酸的发现进一步将核酸药物的研究推向一个前所未有的发展高潮。反义寡核苷酸是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15 30个核苷酸。通过碱基互补的原理，干扰相关基因的转录和翻译，或者整个基因组的复制，其优点在于其理论上的高度靶特异性，是一种理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物。由于反义寡核苷酸作用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗肿瘤和抗病毒新药。国外已有一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阻断EV71病毒复制、抑制病毒致病的寡核苷酸序列、结构及其药物。本研究的内容是针对EV71病毒保守序列，利用网上服务器Soligo设计了 5条寡核苷酸(表I)，从设计的这5条20个碱基长度的寡核苷酸序列中进行初步筛选。结果显示靶向EV71的5’非编码区保守序列EV5抑制病毒所致细胞病变作用最佳，EV2次之。在RD细胞系中评价结果显示EV5可特异且剂量依赖性地抑制EV71病毒的复制及致细胞病变作用。在EV71感染小鼠模型评价结果显示EV5在小鼠体内能够显著的抑制EV71病毒感染死亡率，缓解EV71病毒感染引起的小数体重增加缓慢以及抑制EV71病毒复制的作用。
表I寡核苷酸序列及结构特征
序号长度(nt)序列(5’-3’)
IEVl20GTAGTCGGTTCCGCTGCAGA
2EV220ATTCAGGGGCCGGAGGACTA
3EV320TGCACACCGGATGGCCAATC
4EV420GCCGCATTCAGGGGCCGGAG
5EV520GATTAGCCGCATTCAGGGGC·
根据本发明，针对EV715’非编码区的寡核苷酸EV5能特异性抑制EV71病毒的感染复制，有可能成为治疗及预防EV71病毒感染相关疾病的新型生物工程药物。根据本发明，针对EV715’非编码区的寡核苷酸能有效的抑制EV71病毒的复制并保护细胞使其免于EV71病毒感染所致细胞病变，是一种特异性高、毒副作用小的新型抗EV71病毒的潜在药物。根据本发明，反义寡核苷酸的长度与其细胞通透性，与靶序列结合亲和性及作用特异性等因素相关，EV5的长度根据实验确定，本发明包含了与EV5具有相同序列的任何长度寡核苷酸。根据本发明，为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及组织靶向性等，本发明包含了 EV5的硫代修饰。根据本发明，反义寡核苷酸的长度与其细胞通透性，与靶序列结合亲和性及作用特异性等因素相关，EV5的长度根据实验确定，本发明包含了与EV5具有60%及其以上连续相同序列的任何长度寡核苷酸。根据本发明，为了进一步验证EV5的特异性效果，本发明包含了 EV5序列的3’端及5’端的脂肪链修饰。根据本发明，本发明的寡核苷酸可按本领域已知方法配成药物制剂。根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。本发明的实施对严重危害人类健康的EV71病毒感染的治疗具有重要的社会效益和经济效益。
图I五条ASODNs对EV71致CPE的抑制作用图2五条ASODN抗EV71致CPE的剂量依赖性图3利巴韦林(Ribavirin)抗EV71致CPE的剂量依赖性图4EV5对RD细胞的毒性作用图5EV5反义寡核苷酸序列的特异性验证图6EV5长度优化的初步筛选结果图7EV5长度优化的剂量依赖性筛选结果图8EV5对EV71病毒mRNA的影响(先加药后感染)图9EV5对EV71病毒mRNA的影响(先感染后加药)
图10EV5抑制EV71病毒VPl蛋白表达的影响图11EV5在小鼠体内对EV71病毒感染小鼠存活率的影响图12EV5在小鼠体内对EV71病毒感染小鼠体重的影响
具体实施例方式实施例一本实施例主要说明针对EV71病毒保守序列的抗EV71病毒寡核苷酸的设计、合成和筛选。材料与方法I.反义寡核苷酸的设计和合成检索GeneBank中的EV71编码的核酸序列数据库，进行多序列之间的比对，再选择各个亚型的保守区，利用Antisense design对这些基因进行设计，并应用Blast进行序列比对剔除与人类其它基因同源性大于70%的寡核苷酸，最终获得了理论上靶向EV71病毒自身的反义寡核苷酸。采用标准亚磷酰胺固相合成的方法在ABI3900型自动DNA合成仪上进行合成，磷酸骨架均为全硫代修饰。合成完毕后浓氨水55°C切割并脱水15小时后，经Micro Pure II反相纯化柱(Oligo Prep OP120, SAVANT)纯化，紫外定量后真空干燥，-20°C保存备用。2. RD细胞、病毒和对照药物病毒通过感染RD细胞进行扩增繁殖，然后混匀、分装并储存在_70°C备用。使用的病毒株为国际标准株EV71。RD细胞培养液为含10%胎牛血清的DMEM(GIBCO)培养液。病毒感染和细胞病变测定时使用含2%胎牛血清的维持液。阳性对照药物为利巴韦林注射液。3.反义寡核苷酸的筛选RD细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)中，于37°C、5% C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，以8000 10000个细胞/孔接种至96孔细胞培养板中，次日75 80%长满。用DMEM稀释EV1-5至U M。将长满75 80% RD细胞的含10%胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO)的96孔板换成含2%胎牛血清的维持液备用。分别把EV1-5五条反义寡核苷酸序列以4 M的浓度加入96孔板内，每个序列设三个复孔，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0. Iml的EV71的病毒稀释液3. 3yl，37°C培养2d。利用Cell Counting Kit_8 (DoJinDo 产品)方法在酶标仪(BI0-RAD 产品，型号=Model 680)上测定细胞病变程度(以0D450表示)，并以如下公式计算药物的病毒抑制率[(0D试验-OD病毒)/ (0D细胞-OD病毒)]X 100。重复试验二次，计算平均值以筛选出最佳 的反义寡核苷酸以进一步评价。4. ASODNs及阳性药利巴韦林抑制EV71病毒致细胞病变剂量依赖作用将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75 80%长满。将长满75 80% RD细胞换成含2%胎牛血清的维持液备用。把EV1-5分别设立0. 125,0. 25,0. 5、I. 0、2. 0 y M五个浓度梯度，每个序列浓度设三个复孔，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组；同样的，把利巴韦林注射液分别设立20、40、100、200、400ii M五个浓度梯度，每个浓度设三个复孔，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入100TCID50/0. Iml的EV71的病毒稀释液3. 3 iil，37°C培养2d。利用Cell Counting Kit_8 (DoJinDo产品)方法在酶标仪上测定细胞病变程度(以0D450表示)，计算药物的细胞病变抑制率。
结果I.靶向EV71病毒基因组本身反义寡核苷酸序列的设计首先在GeneBank中检索EV71编码的核酸序列数据库，进行多序列之间的比对，选择各个亚型的保守区，然后使用Soligo工具设计反义寡核苷酸。反义寡核酸的设计准则如下(1)40%彡GC%彡60%； (2)反义寡核苷酸结合自由能小于或等于-8kcal/mol ;(3)在目标序列中不存在GGGG。经Blast比对，与人的基因mRNA无同源性，最终获得了理论上靶向EV71病毒自身的反义寡核苷酸五条并对其合成(表I)。2. ASODNs的初步筛选设计的EV1-5五条反义寡核苷酸序列以4 y M的浓度进行初筛，然后利用CCK8检测方法在酶标仪上测定各自的吸光度值，结果如图I。由图中可见，EV2和EV5两条反义序列抗EV71病毒致CPE效果较好，需进一步进行验证。3. ASODNs及阳性药利巴韦林抑制EV71病毒致细胞病变剂量依赖性对上述五条反义序列进一步进行抗病毒效果的剂量依赖性验证，同时与阳性药利巴韦林进行比较，以确定反义药物的抗EV71病毒效果，结果如图2,图3。由图2可见，对五条反义序列进一步进 行剂量依赖性筛选，EV2和EV5抗病毒效果仍然较好，他们抑制EV71病毒致CPE的IC5tl分别为2. 10 uM,0. 84 u M0图3结果显示阳性药利巴韦林在浓度为200 u M时抗EV71病毒致CPE作用抑制率为38. 32 %，当浓度升高至400 u M时抑制率才达到50. 69 %，其抑制EV71病毒致CPE的IC5tl为358. 17 u M0由以上结果可见，EV5，EV2在细胞水平抑制病毒致CPE作用显著优于利巴韦林。结论针对EV71病毒保守序列设计的寡核苷酸中，EV2和EV5显示出显著的抗EV71病毒致CPE作用，作用显著强于利巴韦林阳性药，且EV5的作用优于EV2。实施例二 本实施例主要说明EV5在细胞水平抗EV71病毒致CPE及抑制EV71病毒复制的特异性、剂量依赖性，同时对EV5的长度进行了优化。材料和方法I. ODNs的毒性检测将RD细胞铺96孔细胞培养板，次日75 80%长满。将长满75 80 %的RD细胞换成含2 %胎牛血清的维持液备用。把EV5分别设立I、2. 5、5、10、20 ii M五个浓度梯度，每个浓度设立三个副孔，并设立RD细胞阴性对照组，37°C培养2d。利用CellCounting Kit-8 (DoJinDo产品)方法在酶标仪上测定细胞病变程度(以0D450表示)，观察EV5本身对细胞的影响。2. ODNs的特异性验证首先设计合成EV5的正义链与随机链，正义链经过与EV5的反义寡核苷酸反义序列的碱基互补直接得出，其随机链是利用DNA随机蛋白等的设计软件SMS2 (The Sequence Manipulation Suite 2)设计出来的，并通过与 GeneBank 联机 blast序列比对，不会干扰人类其它正常基因的表达。然后，将RD细胞铺板96孔细胞培养板，次日75 80%长满。将长满75 80%的RD细胞换成含2%胎牛血清的维持液备用。把EV5、EV5S (正义)、EV5R(随机)分别设立0. 125,0. 25,0. 5、I. 0、2. 0 y M五个浓度梯度，每个序列浓度设三个复孔，并设立病毒阳性对照组和RD细胞阴性对照组。作用60min后，每孔加入 100TCID50/0. Iml 的 EV71 的病毒稀释液 3. 3 y 1，37°C培养 2d。利用 Cell CountingKit-8 (DoJinDo产品)方法在酶标仪上测定细胞病变程度(以0D450表示)，计算药物的细胞病变抑制率，验证EV5反义的特异性。4. EV5的长度优化为了考察序列长度对序列抗EV71病毒活性的影响，对EV5序列两端进行了 2个碱基差的长度加减，合成获得相应的寡核苷酸(表2)。将不同长度的寡核苷酸以2. 0 ii M加入EV71感染RD细胞，48h后CCK8检测各序列的抗EV71病毒致细胞病变的效果。然后，对筛选出的可以较好的抑制EV71病毒致细胞病变作用的序列分别进行剂量依赖性筛选，进行比较以筛选出一条最好的序列。表2-2长度优化的反义序列
权利要求
1.与EV71病毒RNA互补的寡核苷酸，其长度是10-30个碱基。
2.根据权利要求I所述寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列结构选自下列之一 Dgtagtcggttccgctgcaga ；2)ATTCAGGGGCCGGAGGACTA；3)TGCACACCGGATGGCCAATC；4)GCCGCATTCAGGGGCCGGAG；5)GATTAGCCGCATTCAGGGGC。
3.根据权利要求2所述的寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列结构选自下列之1)ATTCAGGGGCCGGAGGACTA；2)GATTAGCCGCATTCAGGGGC。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列结构如下 GATTAGCCGCATTCAGGGGC。
5.根据权利要求4所述的寡核苷酸，其特征为所述的寡核苷酸包含了与TACAAGTTTTTTAGGGGGCA具有60%及其以上连续相同序列的任何长度寡核苷酸。
6.根据权利要求1-5所述的寡核苷酸，其特征是该反义寡核苷酸经过不同化学修饰。
7.根据权利要求6所述寡核苷酸，其化学修饰为硫代修饰、脂肪链修饰。
8.权利要求1-7中所述的任一寡核苷酸或其组合在制备治疗和预防EV71病毒感染及其相关性疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种反义寡核苷酸药物的结构和用途。具体说是人工固相合成的寡核苷酸，用于肠道病毒71型(EV71)感染引起的相关疾病的治疗。它是根据EV71病毒基因组保守序列设计的寡核苷酸，通过固相合成、切割和纯化合成上述寡核苷酸产物，产物也可与脂质体、融合肽制成复合物。该寡核苷酸及其复合物抑制EV71病毒在细胞模型和小鼠体内的复制，是治疗EV71感染及其相关疾病的新型生物工程类药物。
文档编号A61P31/14GK102776187SQ20121018709
公开日2012年11月14日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者伯晓晨, 刘娟, 李康, 杨静, 王升启, 韩明明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所