J亚群禽白血病病毒的肽核酸及其应用的制作方法

专利名称：J亚群禽白血病病毒的肽核酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种J亚群禽白血病病毒的肽核酸及其应用。
背景技术：
禽白血病是由禽白血病病毒(avian lekosis virus, ALV)引起的以造血细胞恶性增生为主的一类传染病,包括淋巴细胞性白血病,成红细胞性白血病,成髓细胞白血病和髓细胞样白血病，对养禽业危害最大的是禽淋巴细胞性白血病(lymphoid leukosis, LL)。根据病毒囊膜特性、病毒中和实验、宿 主范围和基因组的分子生物学特性，现已将该病毒分类成10个亚群A J亚群，其包括了除网状内皮组织增殖病病毒以外引起禽类肿瘤性疾病的所有逆转录病毒。其中A、B、C、D为外源性病毒，E、F、G、H、I为内源性病毒。A、B亚群是商业蛋鸡(来航鸡)最为常见的外源性病毒亚群，而C、D亚群感染率极低，几乎很难检测到；E亚群包括普遍存在的低致病性和无致病性的内源性病毒。J亚群于1988年，由Payne等同事首次从商品代肉用鸡中分离得到，J亚群是一外源性白血病病毒，其与内源性E亚群的重组体，可以通过水平和垂直传播在鸡群中广泛散播，所有肉用型品系的鸡对ALV-J都易感，但感染鸡的肿瘤发病率却有显著差异，蛋鸡虽可感染ALV-J，但自然感染时很少引起肿瘤；随着养鸡生产规模的不断增大，疑似淋巴性白血病J亚群(ALV — J)的发生更为广泛，使发病鸡群死淘率高，给养鸡生产场带来严重的经济损失。该病1998年在世界范围内暴发，给世界养禽业造成了沉重打击。1999年，杜岩等在国内首次从商品代肉鸡中分离并检测到ALV-J病毒。2000年以后，J亚群白血病在我国鸡群中全面暴发，并呈现出宿主范围扩展，其垂直和水平传播引起临床和亚临床感染而造成较大的经济损失。禽白血病导致的经济损失主要有两个方面。一是引起肿瘤，导致鸡的死亡。二是产生非肿瘤性疾病，造成免疫抑制造成的亚临床感染，表现为鸡的消瘦和贫血，耐受性病毒血症，免疫抑制等，由此严重影响养鸡生产。ALV-J感染可造成鸡多重感染，在个体病鸡中可同时检出几种不同的病毒，如网状内皮增生症病毒(REV)、传染性法氏囊病毒、鸡传染性贫血病毒等。在实际生产过程中，人们通常只关注肿瘤形成对生产的影响，往往忽略其亚临床感染。免疫抑制可包括淋巴器官萎缩或发育不全、高血症丙球蛋白增多、促有丝分裂剂诱导的胚细胞形成减少以及抗体应答降低。因此，ALV对养禽业造成的损失主要是由于其前期非肿瘤性疾病(免疫抑制)引发的，而后期由于肿瘤造成的死亡只是免疫抑制从量变到质变的一个表面现象。病鸡临床症状主要表现为食欲不振，进行性消瘦；羽毛异常，患病鸡精神状态差；部分鸡的腹部胀大，可触摸到肿大的肝脏；鸡冠及肉髯苍白，有些鸡冠萎缩；有的头部、背部、胸部、腿部及翅膀可见I 3 Cm大小的血疱，呈褐紫色，质地柔软，有一定的弹性，与周围皮肤界限清楚，血疱破裂后流血不止，血疱周边的羽毛被大片血迹污染。免疫抑制是指由于受到各种因素(如营养、疾病、应激等)的影响，使得机体对抗原应答能力低下甚至缺失的现象。其中由病毒引起的免疫抑制尤为严重从而形成免疫抑制。ALV-J引起成年肉鸡骨髓细胞瘤，导致很高的死亡率，还能使繁殖力下降(由于影响种公鸡的发育)。由于种母鸡的死亡和繁殖力下降，使得孵化用蛋减少，造成肉鸡饲养业的严重损失。ALV除了可引起原发感染引起鸡的死亡，更重要的是损害免疫器官，如对鸡胸腺、法氏囊等主要免疫器官可造成严重损伤，使免疫器官功能降低，使得机体的抗病力下降，最终导致并发症和继发感染。另外，ALV-J造成免疫抑制的解除很困难，使鸡群对疫苗免疫不产生应答或应答能力下降，造成免疫失败，引起烈性传染病暴发。病毒粒子直径80 100 nm，由外部的囊膜和内部的电子致密的核衣壳构成，核心结构由二倍体RNA和核衣壳、反转录酶、整合酶、蛋白酶组成，呈正二十面体。病毒囊膜上有放射状突起，直径约为8 nm。ALV基因组全长约7. 2 kb，可直接作为mRNA。ALV结构基因从5’端至3’端顺序为gag-pol-env,分别编码病毒结构蛋白、RNA依赖的DNA聚合酶(反转录酶)和囊膜糖蛋白。gag基因编码病毒内部非糖基化结构蛋白，包括基质蛋白、蛋白酶、衣壳和核衣壳。在ALV亚群间，这些病毒蛋白十分保守，具有高度的同源性，即所谓的群特异性抗原或GSA。pol基因编码病毒的反转录酶和整合酶，以完成作为细胞基因信息表达前的病毒至前病毒以及前病毒DNA整合进细胞染色体的过程。env基因编码病 毒囊膜糖基化蛋白。包括膜表面糖蛋白亚单位(SU) gp85和跨膜糖蛋白亚单位(TM) gp37。SU是由gp85基因编码的，它含有病毒一受体决定簇，决定禽白血病的亚群特异性；TM负责将病毒转入细胞。结构基因两侧的长末端序列(long terminal repeats, LTR ),与病毒RNA的复制和翻译有关。急性转化型ALV还带有病毒性肿瘤基因(^oncogene)。该病毒含有5种结构蛋白即病毒群特异性抗原衣壳蛋白P27，病毒基膜蛋白P19，参与RNA加工与包装的核衣壳蛋白P12，参与蛋白前体剪切的天冬氨酸酶P15，功能不详的P10。内源性病毒RAV-O株中存在P27的变异体即P27°。反义核酸(antisense nucleic acid)是一段与祀基因(mRNA或DNA)的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反义核酸通过碱基配对方式特异性的与病毒靶基因结合形成杂交分子，从而在复制、转录和翻译水平调节靶基因的表达，或诱导RNase H识别并切割mRNA，进而使其功能丧失。反义核酸包括反义RNA (antisense RNA)和反义DNA (antisense DNA),具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力强等特点。反义核酸作为一种新的抗病毒、抗肿瘤药物，掀起了一场药理学领域的革命，即新的药物受体mRNA通过新受体结合方式(Watson-Crick杂交)、引发新的药物受体结合后反应(I) RNase H介导的祀RNA的降解；(2)抑制DNA的复制和转录及转录后的加工和翻译等。可以说反义寡核苷酸(ODNs)疗法比传统的药物治疗手段有更高的特异性。从二十世纪70年代末到现在，在这三十年的时间中，反义核酸药物已走出实验室，进入了实际临床应用。特别是第一个反义核酸药物Fomivirsen通过FDA批准上市后,人们对反义疗法尤为关注。反义核酸作用原理基于碱基配对原则，可通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与对相关基因表达的调控。其作用方式可能有①反义RNA与病毒mRNA结合形成互补双链阻断核糖体与病毒mRNA的结合，从而抑制了病毒mRNA翻译成蛋白质的过程。②反义DNA能与祀基因形成一种三链核酸(triple helix nucleic acid),它通过作用于控制基因转录的转录子、增强子和启动子区，对基因的转录进行调控。③反义核酸与病毒mRNA的结合可阻挡mRNA向细胞质的运输。④反义核酸与病毒mRNA结合后使得mRNA更加易被核酸酶识别降解，从而大大缩短mRNA的半衰期。上述四种作用途径都可表现为对病毒基因表达的抑制或调控，且这种调控是高度特异性的。反义核酸是通过碱基互补配对的原理来识别所打靶的基因，从理论来分析，研究人员以动物细胞为例，其染色体大约有几十亿对碱基，如果4个碱基(A、G、C和T)的数目大致相同，并在整个基因中随机分布，那么按照统计学原理，大于17个碱基的反义核酸与非靶基因杂交的可能性不大，所以长度超过17个碱基的反义核酸分子与靶基因的结合可以说是唯一的，从而使反义核酸具有高度的特异性。研究表明，在细胞内部一个拷贝的基因会产生200-300条mRNA，翻译出10万个具有生物活性的蛋白质分子。传统药物主要作用于有生物功能的蛋白分子的某结构域上的几个作用位点，事实上蛋白的结构是非常复杂的，且在生物体内，活性蛋白的空间结构又是千
变万化的，以传统药物有限的几种作用位点来控制靶分子的动态的和整体的功能很难达到理想的效果，因而不难看出传统药物的局限性。由mRNA可翻译出几十到几百个蛋白，反义核酸在mRNA水平对靶基因直接进行调控，这个步骤相当于将传统药物作用放大了数十到数百倍，可见反义核酸的调控是极其经济合理的。毒理学研究表明，反义核酸在体内具有很低的毒性，尽管其在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。与传统药物相比，反义核酸药物具有特异性强，效率高和毒副作用低等优点，在抑制肿瘤生长和抗病毒复制等方面显现出了良好的应用价值。目前已有多个药物进入美国和欧洲市场，另还有30多种反义核酸药物正在进行临床前期的研究或开发后进入了 I、II和III期实验。由于动物体内存在大量的核酸外切酶，反义核酸若不经过化学修饰，很快就被降解，失去活性。目前对反义核酸的化学修饰有很多方法，常见的有硫代修饰反义核酸及2’-甲氧基修饰反义核酸等。且目前硫代修饰药物的研究最为全面，它可有效抵抗核酸酶的降解，同时可促进核酸酶Rase H的活性，目前这种修饰方法已成功用于临床的反义核酸药物。但这些还只是第一代反义核酸的修饰方法，随着技术的发展与进步，新的修饰途径与方法被开发出来，使得反义核酸的研究进入了第二、三代，其中肽核酸的修饰最为引人关注。肽核酸(peptidenucleic acids, PNAs),是一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA类似物，可序列特异的靶向作用于DNA的大沟槽，其骨架的结构单元为N(2-氨基乙基)-甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接于主骨架的氨基N上。为反义核酸的第二代产品。

发明内容
本发明的目的是提供一种
本发明所提供的肽核酸，选自如下任一种或任几种肽核酸
a)其核酸序列为序列表中的序列I 5， - AGACUAAGGCAAAAAUC腳U-3，；
b)其核酸序列为序列表中的序列2 5， - ACGACUUAUUGAAAAACUCUC-3，；
c)其核酸序列为序列表中的序列3 5，- UAUAACC⑶CU⑶A⑶UGGAC-3，；d)其核酸序列为序列表中的序列4 5， - ACAUAUUUGAUUAUCUCUCCU-3，。其中，所述肽核酸可以为经壳聚糖修饰的肽核酸。本发明的肽核酸用于制备抗J亚群禽白血病病毒的药物。本发明的肽核酸制剂，其活性成分为所述的肽核酸。其中，所述制剂为结肠溶控释微囊制剂、注射用冻干制剂或口服用水溶性颗粒剂。
本发明的肽核酸制剂还含有可药用载体或赋形剂。本发明的肽核酸制剂的稳定性分析
高温流通蒸汽高温105°C，20分钟灭菌不影响其生物活性。极端温度50°C存放6个月不影响其生物活性。室温存放24个月不影响其生物活性。低温-20°C存放48个月不影响其生物活性。本发明的肽核酸无毒副作用，无耐药性，能特异性直接抑制ALV-J复制，抗病毒效果好，无药残等食品安全问题。
具体实施例方式J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒(aivan leukosis subgroup J, ALV-J )引起的一种主要发生于鸡的传染病，其主要引起鸡的造血细胞恶性增生，该病近年来在我国鸡群中病毒阳性率呈快速上升趋势，并呈现出宿主范围扩展，其垂直和水平传播引起临床和亚临床感染而造成较大的经济损失。到目前为止，对该病尚无有效的防控措施，开发预防和治疗ALV-J感染的新技术显得尤为迫切，另ALV-J侵害鸡的免疫系统，使感染后鸡群的免疫力低下，引发免疫抑制，一旦感染容易继发其它传染病。到目前为止，尚未成功开发出可以预防该病的有效疫苗，本发明率先将肽核酸技术与反义核酸技术结合起来，并应用于预防和治疗ALV-J病毒感染引发的相关疾病。为此，本发明采用了以下技术方案
ALV-J毒株NS-X11株，来自楠森兽医诊断技术研究中心实验室。CEF细胞常规方法制备的鸡胚成纤维细胞(CEF)。DF-I细胞来自楠森兽医诊断技术研究中心实验室。 针对抗ALV-J的肽核酸体外抗病毒效果分析
从GenBank数据库检索出ALV-J的基因组，用生物学软件进行序列分析，综合考虑序列的保守性，G+C%含量，碱基分布特点，然后从中挑选出合适的区域设计反义核酸，最后所确定的针对病毒的gp85和P27基因的反义核酸序列如下。 gp85
gp85-l :5，- AGACUAAGGCAAAAAUCUGUU-3，；gp85-2 :5， _ UAAAUCGGUGUUGUUAUCGCA-3，；gp85-3 :5， - ACGACUUAUUGAAAAACUCUC-3，；
P27
P27-1 :5，- AUAACUCUCAUUAGAUUCGUA-3，；
P 27-2 :5， - UAUAACCGUCUGUAGUUGGAC-3，；P27-3 :5， - ACAUAUUUGAUUAUCUCUCCU-3，。人工合成如下肽核酸，肽核酸的序列如下 gp85
gp85-l :5，- AGACUAAGGCAAAAAUCUGUU-3，；gp85-2 :5， _ UAAAUCGGUGUUGUUAUCGCA-3，；gp85-3 :5， - ACGACUUAUUGAAAAACUCUC-3，；
P27
P27-1 :5，- AUAACUCUCAUUAGAUUCGUA-3，；
P 27-2 :5， - UAUAACCGUCUGUAGUUGGAC-3，；
P27-3 :5， - ACAUAUUUGAUUAUCUCUCCU-3，。壳聚糖-肽核酸以壳聚糖修饰肽核酸，修饰方法为本领域中已知的多种方法具体如下述文献
Luessen H Lj de Ieeuw B Jj Lang emeyer Mj et al . Mucoadhesive polymers inperoral peptide drug delivery. 0 . carbomer and chitosan impro ve t he abso rption of the pept ide drug buser elin in vivo [ J] . Pha rm Res, 1996，13 ( 11) : I668- I 172.
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釆用ALV-J病毒特异性定量RT-PCR检测肽核酸对病毒靶基因的抑制程度，同时运用病毒毒价测定实验检测抗病毒的滴度。Day I:
铺板消化前期准备的DF-I细胞，离心收集，细胞计数，用完全培养基(DMEM+5%胎牛血清+青链霉素)将细胞浓度调到3 6X IO5个/ml，铺24孔板，于37°C二氧化碳培养箱中进行培养18-24小时。Day 2:
显微镜观察细胞的密度，待细胞长满孔板面积的7(Γ80%时，且细胞状态良好。吸去培养液，每孔加入300μ1待筛选药物(即肽核酸)，每个药物10个孔。温育I小时后，加入ΙΟΟμΙALV-J (感染比为O. 01)，吸附2小时后，用营养液洗去未吸附的病毒后，再加入含4%FBS的DMEM培养基，在37°C和5%C02环境中继续培养，感染后定时观察细胞病变。感染后72h，将感染细胞进行反复冻融以释放病毒，以此为样本进行病毒检测。实验过程中还设不加病毒和肽核酸的正常细胞对照组，加病毒、不加肽核酸阳性对照组和加肽核酸药物、不加病毒的阴性对照组。Day 3~5:
观察药物对细胞的保护效应，并对结果进行评判。Real-time PCR 定量检测
收集上述各处理组中的上清液，用病毒总RNA提取试剂盒提取病毒RNA。对获得的病毒RNA首先进行反转录成cDNA，然后运用针对的引物分别检测ALV-J处理组中的病毒含量。定量扩增后的结果，运用统计学软件计算出各处理组中病毒滴度，抑制效果以PNA组与空白对照组差异的倍数。本发明参考Huang等提供的引物，采用real-time PCR定量检测ALV-J。ALV-J特异性检测引物
引物 I: 5’ - TCAGGACCAAGGGCTTAC -3’ ；
引物 2: 5，- CTGCCGCTATAACCGTCTG -3，。
β -actin为内参
Actin-F 5’ - TCCCTGTATGCCTCTGGTC -3’ ；
Actin-R 5，- TCTCTCTCGGCTGTGGTGG -3，。
反应体系(25 μ I)
权利要求
1.一种肽核酸，选自如下任一种或任几种肽核酸 a)其核酸序列为序列表中的序列I 5， - AGACUAAGGCAAAAAUC腳U-3，； b)其核酸序列为序列表中的序列2 5， - ACGACUUAUUGAAAAACUCUC-3，； c)其核酸序列为序列表中的序列3 5，- UAUAACC⑶CU⑶A⑶UGGAC-3，； d)其核酸序列为序列表中的序列4 5， - ACAUAUUUGAUUAUCUCUCCU-3，。
2.根据权利要求I所述的肽核酸，其特征在于，所述肽核酸为经壳聚糖修饰的肽核酸。
3.权利要求I或2所述的肽核酸在制备用于抗J亚群禽白血病病毒的药物中的应用。
4.一种肽核酸制剂，其活性成分为权利要求1-2中任一所述的肽核酸。
5.根据权利要求4所述的肽核酸制剂，其特征在于，所述制剂为结肠溶控释微囊制剂、注射用冻干制剂或口服用水溶性颗粒剂。
6.根据权利要求4或5所述的肽核酸制剂，其特征在于，还含有可药用载体或赋形剂。
全文摘要
本发明涉及一种J亚群禽白血病病毒的肽核酸及其应用。该肽核酸选自如下任一种或任几种肽核酸a)其核酸序列为序列表中的序列1；b)其核酸序列为序列表中的序列2；c)其核酸序列为序列表中的序列3；d)其核酸序列为序列表中的序列4。本发明的肽核酸无毒副作用，无耐药性，能特异性直接抑制ALV-J复制，抗病毒效果好，无药残等食品安全问题。
文档编号A61P31/14GK102876675SQ20121020506
公开日2013年1月16日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者韩健宝, 徐步, 范建华 申请人:韩健宝