一种短肽激素与重组假单胞菌外毒素a的重组融合蛋白及应用的制作方法
【专利摘要】本发明为一种短肽激素与重组假单胞菌外毒素A的重组融合蛋白及应用，涉及与促性腺激素释放激素融合的重组假单胞菌外毒素A功能片段的构建，以及所述重组细胞毒性融合蛋白作为抗肿瘤剂，在抑制类固醇激素刺激的肿瘤的发生和发育中的应用。
【专利说明】—种短肽激素与重组假单胞菌外毒素A的重组融合蛋白及应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明总地涉及具有靶细胞特异性细胞毒性的融合蛋白质。更具体地说，本发明涉及与促性腺激素释放激素融合的重组假单胞菌外毒素A功能片段(PE39)的构建，以及所说的重组细胞毒性融合蛋白作为抗肿瘤剂，在抑制类固醇激素刺激的肿瘤的发生和发育中的应用。
【背景技术】
[0003]目前研究较多且较深入的细胞毒性剂是假单胞菌外毒素A(PEA)(参见美国专利4，545，985) oPEA是由613个氨基酸组成的单链多肽。对PE分子的X射线晶体学研究和突变分析显示，PE分子包括三个与产生细胞毒性相关的结构区域:负责与敏感细胞结合的氨基末端细胞受体结合区(I区);负责毒素分子向细胞溶胶内转位的中间转位区〔II区);以及负责失活蛋白质并最终导致细胞死亡的羧基末端酶促活性区(III区)。其中I区包括介导细胞结合的Ia区(氨基酸1-252)和目前尚未明确其功能的Ib区(氨基酸365-399)。使用重组DNA技术修饰PE分子，以制备PE分子中有一个或多个氨基酸缺失或取代的各种修饰的PE片段，例如，一般将删去了 PE分子中Ia区，只含有酶促和转位区，分子量约为40KDa的PE-蛋白质称为PE40。现已发现删除PE的Ia区和部分II区(359-365位氨基酸)，即PE39毒素分子，该分子仍保留其特异性细胞毒性，但降低了非特异性毒性(Mol Microbiol.1999 Mar; 31 (5):1385-93 ;美国专利4,892,827 )。将PE40分子的羧基端REDLK置换成KDEL,其活性可提高6~10倍(US Patent 560 2095, Recombinant pseudomonas exotoxinwith increased activity)。本发明为了得到活性更高的并可以规模化分离纯化及切割的靶向融合蛋白，针对靶向融合蛋白GnRH-PE40KDEL蛋白及核酸序列进行了如下改构:
1.将GnRH-PE40KDEL 的 359-365 位氨基酸进行了缺失(即为 GnRH_PE39KDEL)(PR0TEINSEQ ID N0:1)；
2.针对于大肠杆菌和铜绿假单胞菌密码子偏好性的差异，重新设计优化适合大肠杆菌的密码子，通过人工合成的方法合成全长核酸序列湖?5Ζ (NUCLEAR SEQ IDNO:1)。使用改造后的pET-His作为重组蛋白的表达载体；
3.为纯化目的蛋白使用组氨酸标签(6XHis)，同时减小了重组蛋白的分子量；
4.为去除载体中的标签序列，设计了不同的蛋白酶切位点:
A.Factor Xa 蛋白酶酶切位点 Ile-Glu/Asp-Gly-Arg ▼ (PROTEIN SEQ ID NO: 2，3;NUCLEAR SEQ ID N0:2,3)；
B.Thrombin 蛋白酶酶切位点 Leu-Val-Pro-Arg-▼-Gly-Ser (PROTEIN SEQ ID NO:4 ；NUCLEAR SEQ ID N0:4)；
C.HRV 3c 和 PreScission 蛋白酶酶切位点 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln- ▼ -Gly-Pro(PROTEIN SEQ ID NO:5 ；NUCLEAR SEQ ID N0:5)；
5.在4.中所述的碱基序列末端均加入终止密码子TGA。
[0004]6.针对于真核生物和原核生物的密码子偏好性的不同，依据相同的氨基酸序列， 借助基因工程碱基合成的方法，重新设计具有适应于大肠杆菌密码子偏好性、无发卡结构且可以在大肠杆菌中高表达的工程菌菌株。
[0005]最终我们得到了高活性的靶向融合蛋白GnRH-PE39KDEL(PROTEIN SEQ ID N0:1), 在肿瘤治疗方面有很高的应用价值。
[0006]传统的肿瘤治疗方法是使用化学药物直接杀伤体内的肿瘤细胞。然而，大多数抗肿瘤药物在杀伤肿瘤的同时还杀伤正常细胞。为了提高抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性， 自20世纪70年代后期以来，人们就试图将某些抗肿瘤药物或本来缺乏靶向选择性的毒素 (包括细菌或动植物来源的毒素)化学偶联到适当的导向分子或称识别分子上，以制备杂交的具有耙特异性的抗肿瘤剂。随着分子生物学技术的发展，进而建立了以DNA重组技术制备这样的融合蛋白质的方法。
[0007]在肿瘤的发生和发育过程中，许多肿瘤细胞都在其表面上过量表达生长因子受体蛋白质，例如表皮生长因子受体(EGF-R)和转化生长因子a受体(TGFa-R)。因此，可将某些细胞毒性剂(如假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素、霍乱毒素、葡萄球菌内毒素及蓖麻毒素等)连接到作为导向剂的EGF、TGF-a或bFGF分子上，以产生兼有肿瘤细胞导向功能和细胞毒活性的杂交分子。这些杂交分子借助其对靶肿瘤细胞导向能力将整个分子引向靶细胞并通过其毒素部分杀伤靶细胞。
【发明内容】
[0008]本专利涉及了一种GnRH-PE衍生物及工业化生产的可行性方案。通过结合文献和已有试验基础，结合GnRH-PE蛋白三位结构和蛋白序列特点，本发明人运用基因工程方法对GnRH-PE进行改造优化，通过大量筛选获得了可以大量稳定表达重组蛋白的工业菌株， 同时在活性和稳定性方面适于工业化生产的GnRH-PE衍生物。
[0009]本专利中的GnRH-PE衍生物包括:将GnRH_PE40KDEL的359-365位氨基酸进行了缺失(即为GnRH-PE39KDEL);适合大肠杆菌高效转录的核酸序列；高效、稳定、可溶表达重组蛋白的工业化大肠杆菌菌株；可以应用于生产的经济、高效的蛋白酶切位点。
[0010]本发明中`，涉及的GnRH-PE39KDEL核酸序列(如NUCLEAR SEQ ID NO:1所示)为根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的通过基因合成的方法获得，对应的氨基酸序列如PROTEIN SEQ ID NO:1所示，在实验中也验证了此碱基序列在大肠杆菌中可以非常高效、完整的翻译重组蛋白，且此蛋白在大肠杆菌表达中是可溶性表达。
[0011]本发明的一个案例中，Factor Xa_GnRH_PE39KDEL纯品的获得方法如下:
1.载体构建
根据合成的NUCLEAR SEQ ID NO:1，选取大肠杆菌偏好密码子设计位于全长序列N端和 C端的含有特异性酶切位点的PCR引物。同时在N端酶切位点的C端，即PROTEIN SEQ ID NO:1 的 N 端加入 Factor Xa 蛋白酶酶切位点 Ile-Glu/Asp-Gly-Arg▼(如 PROTEIN SEQ ID NO:2)，其核酸序列如NUCLEAR SEQ ID N0:2所示.通过PCR的方法，使用高保真的酶获得含有酶切位点的全长片段；将全长片段和表达载体分别进行双酶切和纯化后，使用T4连接酶进行连接；通过热激转化的方法转入疋coliBL21(DE3)plysS中；抗性筛选单克隆，酶切检测后进行全长测序。保存正确连接的单克隆菌株。
[0012]2.高效表达菌株的筛选
选取不同的单克隆菌落分别摇菌隔夜制备种子液后，按照5%接种量分别接入新的LB培养基中，待OD到达0.8时，加入IPTG诱导，5小时候收集后收集菌液，分别稀释至OD=L O后离心，弃上清后加入上样缓冲液。按照SDS-PAGE的操作进行。分析结果，得到高表达的大肠杆菌菌株。并与-80度保存。[0013]3.可溶性诱导条件的优化
通过改变起始诱导的菌液浓度，诱导时的温度、含氧量及IPTG浓度，最终获得完全可溶重组蛋白表达方案。此过程也证明NUCLEAR SEQ ID NO:1序列在大肠杆菌中具有良好的翻译效果，并且在保持高表达量的前提下保证了可溶性的特性。而可溶性的高表达为工业化的生产提供了优良的工程菌载体。
[0014]4.重组蛋白的纯化
IPTG诱导重组蛋白表达后，使用连续流离心方法收集菌液，加入破碎缓冲液后超声波破碎，高速离心后取上清，使用AKTA纯化系统和镍柱纯化目的蛋白，重组蛋白纯度达96%以上，在此过程中的重组蛋白分子量大小经SDS-PAGE电泳分析显示:表达产物为完整的氨基酸序列，未检测到蛋白翻译提前终止的情况。
[0015]5.重组蛋白外源载体标签序列的切除
目的蛋白经脱盐后，按照Factor Xa标准操作说明对蛋白进行酶切反应，反应时间为16小时，且未有非特异性的切割发生
6.重组靶向抗肿瘤蛋白的纯化
酶切后的蛋白使用苯甲咪唑柱去除Factor Xa，使用镍柱去除含有组氨酸标签的小肽、未切割的重组蛋白及其它杂带，蛋白纯度大于99%。
[0016]7.蛋白氨基酸序列的检测
使用飞行时间质谱(Q-tof)方法检测。蛋白样品经意蛋白酶消解后经冻干、复溶后，使用快速分离液相-6520型四极杆飞行时间质谱(RRLC-Q-T0F，安捷伦公司)对样品进行检测分析，检测到的肽段在数据库中与T0XA_PSEAE匹配，匹配肽段如PROTEIN SEQ ID NO:5所示，得分为532。证明工程菌正确的表达了 PROTEIN SEQ ID NO:1的序列。
[0017]8.成品蛋白活性检测
使用MTT法检测重组蛋白抗肿瘤活性。首先对Hela细胞进行消化和收集，将细胞用RPMI 1640培养液稀释成2 X IO4个/毫升的细胞悬液，接种于96孔板，200ul/孔，5%C02，37°C孵育18小时。细胞贴壁后，对照加入IOOul培养液。样品先用RPMI 1640培养液稀释成lOOul/mL，作为起始孔，然后按每孔与上孔2倍的关系稀释样品，各加入稀释的样品每孔lOOul，37°C，培养48小时，每孔加入150ul DMSO (二甲基亚砜)，置摇床上低速振荡IOmin,用MTT法染色，用酶标仪570nm进行测定并计算IC5tl值。
[0018]本发明另一方面涉及以其含有本发明所述的GnRH-PE39KDEL为重组蛋白，在N端融合多种经济型及特异性蛋白酶切位点。由于酶切位点的加入，在纯化过程中切除组氨酸标签，降低重组蛋白的免疫原活性，同时充分暴露出信号肽GnRH，使其最大活性的发挥靶向攻击癌细胞的生物学功能。
[0019]最终我们得到了高活性的靶向融合蛋白GnRH-PE39KDEL(PROTEIN SEQ ID N0:1), 在肿瘤治疗方面有很高的应用价值。
[0020]针对于大肠杆菌和铜绿假单胞菌密码子偏好性的差异，重新设计优化适合大肠杆菌的密码子，通过人工合成的方法合成全长核酸序列GnRH-PE39KDEL (NUCLEAR SEQ ID NO:1)。使用改造后的pET-His作为重组蛋白的表达载体:1.为纯化目的蛋白使用组氨酸标签(6XHis)，同时减小了重组蛋白的分子量；2.在组氨酸标签的N端加入SET(solubility enhancement tag)序列，促进蛋白的可溶性，即保持高表达的产量的同时，使得蛋白具有天然活性构象。
[0021]3.为去除载体中的标签序列，设计了另外两种蛋白酶切位点:
A.Thrombin 蛋白酶酶切位点 Leu-Val-Pro-Arg-T-Gly-Ser (PROTEIN SEQ ID NO:4 ； NUCLEAR SEQ ID N0:4)；
B.HRV 3c 和 PreScission 蛋白酶酶切位点 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-▼-Gly-Pro (PROTEIN SEQ ID NO:5 ；NUCLEAR SEQ ID N0:5)；
本发明还涉及到一种药物组合物，其含有本发明所述的多种切割后纯化的 GnRH-PE39KDEL,以及任选的药物上可接受的佐剂。在本发明知，术语“药物上可接受的”意味着制药领域公认的且符合《国家药典》规范可用于人体的物质。术语“佐剂”指缓冲剂、 盐离子、佐剂或用于容纳或施用治疗剂的介质。
[0022]本发明中用于通过注射(例如通过推注或连续输液)施用的组合物。用于注射的配方可以以含有额外防腐剂的单位剂量形式存在。组合物可以采取诸如油性或水性介质中的悬浮液、溶液、或乳状液等形式，而且可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂、和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适介质(例如无菌、无热原水)溶解。在某些实施方案中，水性介质包括但不限于氯化钠注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液；水易混介质包括但不限于乙醇、聚乙二醇、和聚丙二醇；氨基酸类；糖类包括但不限于蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、海藻糖；以及非水性介质包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蘧酸异丙酯、和苯曱酸苯曱酯、甘油。
[0023]本发明的再一方面，涉及比较不同蛋白酶切割的GnRH_PE39KDEL对于癌细胞株的抑制效果比较。
【专利附图】
【附图说明】
图1是重组蛋白GnRH-PE39KDEL外源序列切除后蛋白电泳图。
图2是不同外源序列切割方法获得的重组蛋白肿瘤细胞株抑制试验结果。
[0024]四、结果实例
实验一:
根据大肠杆菌偏爱密码子的原则，通过全基因合成的方法结合获得PROTEIN SEQ ID NO:1所对应的基因序列NUCLEAR SEQ ID NO:1，然后通过PCR方法得到PROTEIN SEQ ID NO:2所对应的基因序列NUCLEAR SEQ ID NO:1。将目的基因连接入表达载体后再将重組质粒转导入到宿主菌中，经过表达、发酵得到目的菌体，然后通过超声波破菌后，离心取上清， 通过镍柱纯化得到纯度大于99%的靶向融合蛋白纯品。
[0025]其中使用的螯合例子可以是:Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、Ca2+或Fe2+。[0026]为了提高初步蛋白分离的纯度，在上柱缓冲液中可以加入如下但不限于已列出的试剂:还原剂 DTE、DTT> > TCEP> reduced glutathione ；变性剂 urea、guanidinehydrochloride ;去垢剂 Triton X-100、Tween 20、NP-40、cholate、CHAPS ；添加剂imidazole、ethanol、glycerol、Na2S04、NaClEDTA、citrate ;缓冲液 sodium phosphate、Tris-HCl>Tris-acetate、HEPES>MOPS、sodium acetate。
[0027]实验二:
依据Factor Xa操作方法对Factor Xa_GnRH_PE39KDEL (如下图中A)进行切割，去除表达纯化标签得到GnRH-PE39KDEL(Factor Xa)(如下图中B)。然后使用浓度为12%的SDS-PAGE进行电泳分析，结果如图1所示。
[0028]参照上述8.成品蛋白活性检测中的方法比较Factor Xa-GnRH_PE39KDEL、GnRH-PE39KDEL (Factor Xa)、GnRH_PE39KDEL (Thrombin)、GnRH_PE39KDEL (HRV 3C)、GnRH-PE39KDEL (Met)以及包涵体复性GnRH_PE39KDEL活性差别，使用肺癌细胞株A549检测重组蛋白对癌细胞的抑制效果。OD 570nm结果如图2，计算后的IC5tl如下表:
【权利要求】
1.一种短肽激素与重组假单胞菌外毒素A的融合重组蛋白，特征在于其中所说的短肽类激素部分作为导向剂，可与其表面具有相应激素受体或其他配体的性腺激素反应性或非反应性肿瘤细胞特异地结合，并且当内化到这些肿瘤细胞中之后，所说的重组假单胞菌外毒素A功能片段部分作为细胞毒性剂可有效地杀伤这些肿瘤靶细胞。
2.在短肽激素前引入蛋白酶切位点。
3.使用可溶性表达载体，高表达重组蛋白。
4.根据权利要求1的嵌合毒素，其中所说的假单胞菌外毒素是PE39KDEL。
5.根据权利要求1的嵌合毒素，其中所说的短肽类激素是GnRH。
6.根据权利要求1的嵌合毒素，其中所说的蛋白酶酶切位点为FactorXa特意识别氨基酸序列:根据权利要求1的嵌合毒素，其中所说的载体为PET-His载体，蛋白纯化标签为 6XHis。
7.含有根据权利要求1-5中任何一项的嵌合毒素及一种或多种医药上可接受的赋形剂的药物组合物。
8.根据权利要求6的药物组合物其特征在于用于制备治疗性腺激素反应性或非反应性肿瘤的药物。
【文档编号】A61K38/16GK103509119SQ201210219604
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2012年6月29日
【发明者】郭凯, 杨合同, 扈进冬, 陈凯, 周红姿 申请人:山东省科学院生物研究所