专利名称：一种抗真菌作用的艾蒿根茎发酵物及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗真菌作用的艾蒿根茎发酵物及其制备工艺，属于治疗真菌感染疾病药物的技术领域。
背景技术：
艾蒿Artemisia vulgaris L.,也称艾叶草,为菊科蒿属多年生野生草本植物。艾蒿为我国传统中药，以叶入药。艾蒿具有温经止血、散寒止痛、调经安胎、除湿止痒、通经活络等功效艾叶具有抗菌、增强网状上皮细胞的吞噬、平喘、抗过敏性休克、镇咳、祛痰、利胆等作用。艾蒿是一种具有药、食两用等多功能植物，分布于全国各地，药源丰富，毒性低，价廉，具有广泛的开发利用价值。艾蒿虽然在民间习用已有几千年历史，但应用方法绝大 多数是艾叶水煎或溶剂提取(多为乙醇)物或常常与其他中药配伍来治疗疾病。艾叶水煎剂或乙醇提取物抗真菌作用有少量文献报道，且抗真菌作用量较大。应用于抗真菌更多的是与其它中药组成复方制剂。艾蒿不仅叶中含有活性成分，大量废弃的根茎也含有较多的有效成分，但绝大多数用其叶入药或用叶提取药用成分，将大量的根茎弃掉，而且传统的提取方法不能将有效成分充分提取出来，因此，不能充分利用艾蒿的功效作用，也浪费了宝贵的艾蒿中药资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗真菌作用的艾蒿根茎发酵物及其制备工艺，工艺流程简单、成本低廉、应用方便，效果好，解决背景技术中存在的上述问题。本发明的目的是这样实现的一种抗真菌作用的艾蒿根茎发酵物制备工艺，包含如下工艺步骤
①将干燥的艾蒿根茎粉碎成粉末；
②酵母菌活化增殖培养，取高压灭菌后的增菌液体培养基于无菌容器内，无菌环境下加安琪干酵母5-10克/100ml，置35-37°C恒温培养箱培养5_7 h ；
③将活化增值的酵母菌液加入质量体积分数为40—60%的艾蒿根茎粉末、6%蛋白胨、6%葡萄糖，混合均匀后继续发酵；
④发酵条件为培养温度30—37°C，培养时间72— 96小时；
⑤发酵结束后，将发酵物加入无水乙醇，使乙醇终浓度达到60-80%，在提取器中70°C萃取3-5h，将提取液1500-2500转/分离心15-25分钟；取上清液在旋转蒸发仪上回收乙醇，回收乙醇后的剩余液70°C水浴成膏状，之后再80°C烤箱烤干，即得到艾蒿根茎发酵物。所述的艾蒿根茎发酵物提取率为5-10%，即100克艾蒿根茎发酵后用乙醇提取获得5-10克艾蒿根茎发酵物，每克艾蒿根茎发酵物相当含艾蒿根茎10-20g。所述的增菌液体培养基比例为蛋白胨40 g、酵母浸粉20 g、葡萄糖40 g，置于1000 ml蒸馏水中。—种抗真菌作用的艾蒿根茎发酵物，将艾蒿干燥根茎粉碎物作为原料，以安琪酵母菌为发酵菌种，同时加入酵母菌生长必须的蛋白胨、葡萄糖营养成分，提取艾蒿根茎发酵物，所述艾蒿根茎发酵物为发酵品的乙醇提取物，干燥后每克相当于含艾蒿根茎10 — 20克。艾蒿根茎发酵物根据需要制成不同剂型，作为抗真菌药物，用于人体的全身、局部真菌感染的治疗与畜禽全身、局部 真菌感染疾病治疗。将所述艾蒿根茎发酵物研磨粉末后，可制成片剂、胶囊或颗粒剂等剂型，用于口服治疗全身真菌感染疾病；也可以制成霜剂、软膏、洗剂或喷雾剂，治疗皮肤、粘膜等真菌感染。用艾蒿根茎发酵物治疗动物体内不同途径真菌感染模型，观察其动物体内外感染真菌的治疗效果，同时观察了其毒性。结果表明艾蒿根茎发酵物对感染真菌的实验动物有很好的治疗效果，并未发现任何毒副作用；体外直接抗真菌实验，结果表明对临床分离的致病及耐药真菌菌株有良好的抑制或杀灭效果，其抗真菌浓度明显低于常规的艾叶水煎剂和乙醇提取物。本发明为临床或牲蓄抗真菌药物提供一种新的选择，具有成本低廉、应用方便、效益闻等特点。本发明的积极效果是(1)艾蒿根茎资源丰富艾蒿是一种具有药、食两用等多功能植物，分布于全国各地，药源丰富，毒性低，价廉。但艾蒿多以叶入药，大量的根茎被废弃掉，因此艾蒿根茎资源丰富、经济、易得。(2)艾蒿根茎发酵药用价值高本发明应用微生物发酵艾蒿根茎，微生物有着非常强大的分解转化物质的能力，并能产生丰富的次生代谢产物，通过微生物的生长代谢和生命活动来炮制中药，可以比一般的物理或化学的炮制手段更大幅度地获得有效药用成分，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症。另一方面本发明用乙醇将一些有效成分进一步萃取出来，为艾蒿资源的充分利用和新用途提供科学依据；(3)制备工艺简单本方法工艺流程简单，不需要特殊仪器和设备，成本低，生产周期短，适合于工业化生产；(4)应用方便，效果明显该制剂用量小、效价比高、储存及应用均方便。并能明显增加真菌感染实验动物的治疗效果；(5)减少污染，增加经济效益艾叶用于药用成分，但艾蒿根茎往往被废弃堆放或被焚烧，既污染环境也浪费了很好的资源，对其进行充分利用，不仅可以解决污染问题，还可带来一定的经济效益，具有广阔的前景。
具体实施例方式以下通过实施例，对本发明作进一步说明。一种抗真菌作用的艾蒿根茎发酵物制备工艺，包含如下工艺步骤
①将干燥的艾蒿根茎粉碎成粉末；
②酵母菌活化增殖培养，取高压灭菌后的增菌液体培养基于无菌容器内，无菌环境下加安琪干酵母5-10克/100ml，置35-37°C恒温培养箱培养5_7 h ；
③将活化增值的酵母菌液加入质量体积分数为40—60%的艾蒿根茎粉末、6%蛋白胨、6%葡萄糖，混合均匀后继续发酵；
④发酵条件为培养温度30—37°C，培养时间72— 96小时；
⑤发酵结束后，将发酵物加入无水乙醇，使乙醇终浓度达到60-80%，在提取器中70°C萃取3-5h，将提取液1500-2500转/分，离心15-25分钟；取上清液在旋转蒸发仪上回收乙醇，回收乙醇后的剩余液70°C水浴成膏状，之后再80°C烤箱烤干，即得到艾蒿根茎发酵物。在实施例中，本发明按上述制备工艺将艾蒿根茎进行发酵，在规定的范围内进行了几个方案的制备，并对其提取的艾蒿根茎发酵物进行了体外和体内动物实验，均得到一致的有益结果。实施例一
①酵母菌活化增殖培养增菌液体培养基酵母菌=IOOml :5g，35°C恒温培养箱培养7h ;②活化酵母菌与艾蒿根茎粉末比例活化酵母菌液艾蒿根茎粉末=IOOml 40g ;③发酵条件为 温度30°C，时间96小时；④发酵物提取方法发酵物加入无水乙醇，使乙醇浓度达到60%，70°C萃取3h，提取液1500转/分离心25min。上清液回收乙醇，回收乙醇后的剩余液70°C水浴成膏状，80°C烤箱烤干，即得到艾蒿根茎发酵物。实施例二
①酵母菌活化增殖培养增菌液体培养基酵母菌=IOOml :8g，36°C恒温培养箱培养6h ;②活化酵母菌与艾蒿根茎粉末比例活化酵母菌液艾蒿根茎粉末=IOOml 50g ;③发酵条件为 温度34°C，时间84小时；④发酵物提取方法发酵物加入无水乙醇，使乙醇浓度达到70%，70°C萃取4h，提取液2000转/分离心20min。上清液回收乙醇，回收乙醇后的剩余液70°C水浴成膏状，80°C烤箱烤干，即得到艾蒿根茎发酵物。实施例三
①酵母菌活化增殖培养增菌液体培养基酵母菌=IOOml :10g，37°C恒温培养箱培养5h ;②活化酵母菌与艾蒿根茎粉末比例活化酵母菌液艾蒿根茎粉末=IOOml 60g ;③发酵条件为 温度37°C，时间72小时；④发酵物提取方法发酵物加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80%，70°C萃取5h，提取液2500转/分离心15min。上清液回收乙醇，回收乙醇后的剩余液70°C水浴成膏状，80°C烤箱烤干，即得到艾蒿根茎发酵物。将实施例一、二、三得到的艾蒿根茎发酵物研磨成粉末，分别制成胶囊、片剂、颗粒口服用于动物体内实验，制成霜剂、软膏、洗剂外用进行皮肤粘膜抗真菌实验。体外抗真菌实验
采用试管法和平皿法观察艾蒿根茎发酵提取物(试样)对白色念珠菌和羊毛状小孢子菌体外抗真菌作用，并以艾叶水煎剂和乙醇提取物为对照，测定最小抑真菌浓度(MIC)和最小杀真菌浓度(MBC);结果见表I。表I结果显示，试样对白色念珠菌的抑制作用和杀灭作用明显强于艾叶水煎剂和乙醇提取物；试样对羊毛状小孢子菌的抑制作用和杀灭作用也明显强于艾叶水煎剂和乙醇提取物。其最低抑真菌浓度MIC和杀真菌浓度MBC均明显低于艾叶水煎剂和乙醇提取物。表I.试样对白色念珠菌和羊毛状小孢子菌的MIC和MBC
药物白色念珠菌(ug/ml)_ 羊毛状小孢子菌(Ug/ml)
I_ MIC_MBC[ IIC_HBC
实施例_ (胶棄) 7.312515.62515.62531.25
.实施例二(片剤)7'812515.62515.625氾.比—
实施例三(颗粒)7-812515.62515.62531-25
+…^500.00250.00
艾叶水拟剤125.00500I
I--j--1-----------------1--1
250.00125.00I
艾叶乙廳提取物 62. 50_ ___ 250,00 [2.体内口服抗真菌实验
实验选用SPF级健康昆明小鼠，雌雄各半。首先用环磷酰胺造成小鼠免疫功能低下，之后用白色念珠菌IOVml个菌液尾静脉注射(0. 2ml/只)，注射真菌同时小鼠灌胃试样各剂型，按60、30、15mg/kg三个剂量组，每组20只，每天灌胃一次，连续7天，观察各组小鼠死亡情况。结果见表2。表2试样对白色念珠菌感染小白鼠死亡率(％)的影响(n=20)
权利要求
1.一种抗真菌作用的艾蒿根茎发酵物制备工艺，其特征在于包含如下工艺步骤 ①将干燥的艾蒿根茎粉碎成粉末； ②酵母菌活化增殖培养，取高压灭菌后的增菌液体培养基于无菌容器内，无菌环境下加安琪干酵母5-10克/100ml，置35-37°C恒温培养箱培养5_7 h ； ③将活化增值的酵母菌液加入质量体积分数为40—60%的艾蒿根茎粉末、6%蛋白胨、6%葡萄糖，混合均匀后继续发酵； ④发酵条件为培养温度30—37°C，培养时间72— 96小时； ⑤发酵结束后，将发酵物加入无水乙醇，使乙醇终浓度达到60-80%，在提取器中70°C萃取3-5h，将提取液1500-2500转/分离心15-25分钟；取上清液在旋转蒸发仪上回收乙 醇，回收乙醇后的剩余液70°C水浴成膏状，之后再80°C烤箱烤干，即得到艾蒿根茎发酵物。
2.根据权利要求I所述之一种抗真菌作用的艾蒿根茎发酵物制备工艺，其特征在于所述的艾蒿根茎发酵物提取率为5-10%，即100克艾蒿根茎发酵后用乙醇提取获得5-10克艾蒿根茎发酵物，每克艾蒿根茎发酵物相当含艾蒿根茎10_20g。
3.根据权利要求I或2所述之一种抗真菌作用的艾蒿根茎发酵物制备工艺，其特征在于所述的增菌液体培养基比例为蛋白胨40 g、酵母浸粉20 g、葡萄糖40 g，置于1000 ml蒸馏水中。
4.一种抗真菌作用的艾蒿根茎发酵物，其特征在于将艾蒿干燥根茎粉碎物作为原料，以安琪酵母菌为发酵菌种，同时加入酵母菌生长必须的蛋白胨、葡萄糖营养成分，提取艾蒿根茎发酵物，所述艾蒿根茎发酵物为发酵品的乙醇提取物，干燥后每克相当于含艾蒿根茎10—20 克。
5.根据权利要求4所述之一种抗真菌作用的艾蒿根茎发酵物，其特征在于所述艾蒿根茎发酵物作为抗真菌药物，用于人体的全身、局部真菌感染的治疗与畜禽全身、局部真菌感染疾病治疗。
6.根据权利要求5所述之一种抗真菌作用的艾蒿根茎发酵物，其特征在于所述艾蒿根茎发酵物研磨粉末后，制成片剂、胶囊或颗粒剂剂型，用于口服治疗全身真菌感染疾病；制成霜剂、软膏、洗剂或喷雾剂，治疗皮肤、粘膜等真菌感染。
全文摘要
本发明涉及一种抗真菌作用的艾蒿根茎发酵物及其制备工艺，属于治疗真菌感染疾病技术领域。技术方案是将艾蒿干燥根茎粉碎物作为原料，以安琪酵母菌为发酵菌种，同时加入酵母菌生长必须的蛋白胨、葡萄糖营养成分，提取艾蒿根茎发酵物，所述艾蒿根茎发酵物为发酵品的乙醇提取物，干燥后每克相当于含艾蒿根茎10—20克。试验结果表明艾蒿根茎发酵物对感染真菌的实验动物有很好的治疗效果，并未发现任何毒副作用；对临床分离的致病及耐药真菌菌株有良好的抑制或杀灭效果，其抗真菌浓度明显低于常规的艾叶水煎剂和乙醇提取物。本发明为临床或牲蓄抗真菌药物提供一种新的选择，具有成本低廉、应用方便、效益高等特点。
文档编号A61P31/10GK102727550SQ20121023618
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者姜妍, 安春娜, 王志路, 白静, 胡雷, 赵志宇, 郑永强, 郭兰, 韩淑英 申请人:河北联合大学