专利名称：与万古霉素形成抗菌增效包合物的组分和制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及万古霉素vancomycin与β -环糊精衍生物6_[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -环糊精 Per-6-[ (phenylalanyl) -amino] -b-cyclodextrin 盐酸盐形成包合物的制备方法、化学构象分析、抗菌增效效果及其增效机理，以及这种万古霉素包合物抗菌增效的应用。
背景技术：
万古霉素是目前临床上对付耐甲氧西林金黄色葡萄球(methici 11 in-resistantStaphylococcu Saarew1S,简称MRSA)的首选药物,它属于结构较为复杂的糖肽类抗生素。万古霉素的抗菌作用机理已被证实是通过形成氢键与细菌的细胞壁NAM/NAG肽类上C-终端上的L-Lys-D-Ala-D-Ala五个点位相结合，从而抑制细菌的细胞壁的合成而达到抗菌作用。但随着抗生素的滥用，临床上万古霉素对MRSA的敏感度开有较快下降的趋势。这现象在我国尤为严重。如何保持万古霉素对MRSA的敏感度，延长它在临床上的使用周期将是抗生素耐药性问题的一种挑战。
环糊精是一类天然环低聚糖化合物，常见的有α、β及Υ-环糊精。其中β-环糊精最为常见，它是由七个a-D-葡萄糖单元经I，4-糖苷键环状连接而成。与其它环糊精一样，其分子结构中含有一个亲水性外表面和一个疏水性内空洞，表现为一个宽圆边为亲水性，和一个窄圆边则呈现疏水性。这一特性使其与许多化合物能形成内含复合物即包合物。因此，它与客体化合物即形成包合物的能力、包合物的性质及机能取决于宽圆边的亲水性及窄圆边的取代基的性能。环糊精与客体化合物并非是由分子中原子间的共价键形成包合物，而是分子间的空间作用形成的。因此包合物具有客体化合物原有的一切功能。NMR即核磁共振图谱是研究溶液中包合物的最直接和最有效的工具和方法，尤其是1H NMR即质子核磁共振图谱，通过环糊精与客体化合物形成包合物前后其结构中质子的化学位移的微小变化，准确地解析包合物的形成及其结构包括空间结构，得到客体化合物在包合物中的空间化学环境信息包括其化学结构的构象。本发明的目的是依据β -环糊精的结构特征及万古霉素抗菌活性的生化作用机理，选用b-环糊精衍生物6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -环糊精(I)作为主体化合物，与客体化合物万古霉素形成包合物的制备方法以及测定包合物的体外抗菌增效效果。利用1HNMR图谱及包合物的化学结构构象分析，并结合万古霉素抗菌活性的生化作用机理，对万古霉素与6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -环糊精(I)形成的包合物的抗菌增效机理进行阐述。
发明内容
本发明旨在提供一种能使万古霉素抗菌活性增强的包合物的制备方法。这种包合物是由一种β_环糊精衍生物6_[ (L-苯丙氨酸)-胺基]-β -环糊精(I)作为主体化合物与客体化合物万古霉素形成的。该包合物体外抗菌活性实验显示，万古霉素在形成包合物后对多种细菌菌株尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球即MRSA的抗菌活性有较强的增效效果。利用1H NMR实验，通过对包合物的化学结构构象分析，并结合万古霉素抗菌活性的原生化作用机理，阐明万古霉素与6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -环糊精(I)形成的包合物的抗菌增效机理。
本发明人从事β-环糊精衍生物制备设计及其与抗生素形成包合物的研究多年。下面就用于本发明的万古霉素与6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -环糊精盐酸盐(I)包合物的制备方法、万古霉素在形成包合物后的体外抗菌活性增效效果、包合物的1H NMR数据以及化学结构构象分析并对包合物的抗菌增效机理进行阐述。
I.万古霉素与6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β-环糊精(I)形成包合物的制 备方法
I.I.制备方法一
万古霉素和6_[(L_苯丙氨酰)-胺基]-β -环糊精(I)按组分摩尔比例O. 5 2. O分别溶于水，二者水溶液混合均匀，混合液用冷冻干燥方法干燥，即得万古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -环糊精(I)冻干粉包合物。I. 2.制备方法二
万古霉素和6_[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -环糊精(I)分别用冷冻干燥方法制成冻干粉。二者的冻干粉分别用O. 9%生理盐水或水溶解，二者溶液按组分摩尔比例O. 5 2. O混合均匀，即得万古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -环糊精(I)的溶液包合物。I. 3.制备方法三
万古霉素和6_[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -环糊精(I)分别用冷冻干燥方法制成冻干粉。二者之一的冻干粉用O. 9%生理盐水或水溶解，此溶液按组分摩尔比例O. 5 2. O溶解另一冻干粉，混合均匀，即得万古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)_胺基]_β -环糊精(I)的溶液包合物。2.万古霉素与6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β-环糊精(I)包合物的体外抗菌活性增效效果
按体外抗菌活性标准测定方法分别测试单独的万古霉素和6-[(L-苯丙氨酰)-胺基]-β_环糊精盐酸盐(I)及以本发明制备方法二制备的万古霉素和6-[(L-苯丙氨酰)-胺基]-β_环糊精盐酸盐(I)的溶液包合物对九种临床上常见的细菌菌株的抑菌活性。通过分别比较单独的万古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -环糊精盐酸盐(I)及其包合物的体外抗菌活性，表明6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -环糊精盐酸盐(I)本身并无抑菌活性，但其与万古霉素形成的包合物则使万古霉素的抗菌活性有很强的增效效果，尤其是对耐药菌株MRSA的最低抑菌浓度MIC有4 8倍的增效作用。3. 6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -环糊精盐酸盐(I)与万古霉素包合物的形成、化学构象分析及其抗菌增效机理
通过比较6_[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -环糊精盐酸盐(I)和万古霉素溶液在形成包合物前后其分子中各质子在1H NMR谱中的化学位移变化，确认其包合物的形成以及包合物的化学构象。本发明的1H NMR数据表明6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β-环糊精盐酸盐(I)和万古霉素溶液在形成包合物前后其分子中大多数质子有Λ δ O. 2 O. 6 ppm的化学位移变化，认定其包合物的形成。同时，经过室温12小时后，1H NMR显示包合物在O. 9%NaCl溶液中仍然很稳定。经对其包合物的化学构象分析，并结合万古霉素抗菌活性的原生化作用机理，6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β-环糊精(I)是通过万古霉素与细菌的细胞壁NAM/NAG肽类上C-终端上的L-Lys-D-Ala-D-Ala五个相结合点位的背面与万古霉素形成包合物，这一结构构象大大地利于万古霉素与上述五个点位相结合，从而更有利于抑制细菌的细胞壁的合成而达到抗菌增效作用。
图I是化合物I体外对万古霉素抗菌活性增效作用。图2 是1H chemical shifts for vancomycin alone and with I。
图 3 是1H Chemical shifts for I alone and with vancomycin。
图4是万古霉素与化合物I的包合物模型。
图5是万古霉素增效机理模型。
具体实施例方式 下面结合实施例描述本发明的实现方案。
实施例I:万古霉素、6_[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -环糊精盐酸盐(I)及其包合物的体外抗菌活性测试
按体外抗菌活性标准测试方法分别测试6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]_β -环糊精盐酸盐(I)、阳性对照药Linezolid、万古霉素、I :1摩尔溶度的万古霉素6-[(L_苯丙氨酰)-胺基]-β -环糊精盐酸盐(I)对九种临床上常见的细菌菌株的抑菌活性，其结果见图
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实施例2 6-[(L-苯丙氨酰)_胺基]-β-环糊精盐酸盐(I)、万古霉素以及包合物的1H NMR图谱、化学构象分析及其抗菌增效机理
6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β -环糊精盐酸盐(I)和万古霉素分别用O. 9%的生理盐重水直接配制，浓度均为O. 016摩尔，分别供1H NMR测定；化合物I与万古霉素以I :1的摩尔比例用O. 9%的生理盐重水配制，浓度均为O. 016摩尔，混合后一小时进行1H NMR测定。测定结果见图2和3。6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-β-环糊精盐酸盐(I)和万古霉素形成的包合物、包合物的化学构象分析及其抗菌增效机理分别见图4、图5。
权利要求
1.万古霉素抗菌增效包合物的制备方法一 万古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-0 -环糊精按组分摩尔比例0. 5 2. 0分别溶于水，二者水溶液混合均匀，混合液用冷冻干燥方法干燥，即得万古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-环糊精冻干粉包合物。
2.万古霉素抗菌增效包合物的制备方法二 万古霉素和6_[(L_苯丙氨酰)-胺基]-0 -环糊精分别用0. 9%生理盐水或水溶解，二者溶液按组分摩尔比例0. 5 2.0混合均匀，即得万古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-P -环糊精的溶液包合物。
3.万古霉素抗菌增效包合物的制备方法三 万古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-环糊精分别用冷冻干燥方法制成冻干粉。
4.二者之一的冻干粉用0. 9%生理盐水或水溶解，此溶液按组分摩尔比例0. 5 2. 0溶解另一冻干粉，混合均匀，即得万古霉素和6-[ (L-苯丙氨酰)-胺基]-环糊精盐酸盐的溶液包合物。
5.由上述第I至第3项制成的制剂包括供注射、口服、外用等抗菌增效的应用。
6.其它形式的万古霉素和6-[(L-苯丙氨酰)-胺基]-￠-环糊精合用用于抗菌活性增效的应用。
全文摘要
本发明旨在提供一种能使万古霉素vancomycin抗菌活性增强的包合物的组分和制备方法。这种包合物是由一种β-环糊精衍生物6-[(L-苯丙氨酰)-胺基]-β-环糊精作为主体化合物与客体化合物万古霉素形成的。该包合物体外抗菌活性实验显示，万古霉素在形成包合物后对多种细菌菌株尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球即MRSA的抗菌活性有4～8倍的最低抑菌溶度的增效效果。利用1HNMR实验，通过对包合物的化学结构构象分析，并结合万古霉素抗菌活性的原生化作用机理，阐明万古霉素与6-[(L-苯丙氨酰)-胺基]-β-环糊精形成的包合物的抗菌增效机理。
本发明这种使万古霉素抗菌活性增强的包合物可应用于对万古霉素不敏感或抑菌活性不强的病菌的抗菌治疗。也可开发成万古霉素新型增效剂，与万古霉素组成新药。
文档编号A61K9/19GK102755629SQ20121027290
公开日2012年10月31日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者邓京振 申请人:上海瑞创医药科技有限公司