专利名称：检测磺胺类药物的试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测磺胺类药物的试剂盒，特别是检测牛奶中磺胺类药物的试剂盒。
背景技术：
磺胺类药物(Sulfonamides, SAs)是一类具有对氨基苯磺酰胺结构、用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。因具有广谱、稳定、经济、易用以及联合抗菌增效剂效果可提高数十倍的特点，常以亚治疗浓度的药物做为饲料添加剂来预防疾病的发生，提高饲料的转化率和促进动物生长，其中常用的SAs就有十几种。但不合理的使用很容易造成耐药菌增加，而且动物性食品中残留的药物可能对人们的健康造成潜在的危害，如磺胺二甲嘧啶是动物性食品中主要的残留药物，可诱发癌症，因此已引起了国内外的高度重·视。我国以及美国、欧盟等国家规定了动物性食品中总磺胺以及单个磺胺的最高残留限量(MRLs)为 O. lmg/kg，其中磺胺二甲基嘧啶(SM2)的 MRLs 为 O. 025 μ g/ml。目前，磺胺类药物残留的检测方法主要有微生物法、理化分析方法和免疫法等。微生物法简便、费用低，但操作费时且敏感性、特异性都较差，在定性定量上都存在困难，不能满足现代残留检测的需要，甚至有些检测结果还达不到最高残留限量的要求；理化法常作为确证方法用于测定动物组织中的药物残留，如气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、气-质联用(GC-MS)、液-质联用(HPLC-MS)等，这些方法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用；常用的免疫分析法主要为酶联免疫检测法和放射免疫分析法，但需要的检测费用还是较高，不适合企业低成本的检测需要。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、检测药物种类多、适合大规模推广的检测方法。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种灵敏度高、检测磺胺类药物种类多、成本低、操作简单、检测时间短的检测磺胺类药物的试剂盒。本实用新型的试剂盒，包括冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线印迹“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“ I ”。检测线和质控线平行，检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm处，质控线位于距离检测线4_7mm处，试纸条上贴有保护膜，保护膜覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线，微孔试剂条的反应孔上具有微孔塞。为了便于运输和使用，试剂盒还有固定用具及固定于其中用于盛装微孔试剂条和试纸条的试剂桶，所述试剂桶上具有密封盖。[0007]本实用新型试剂盒中的试纸条底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂盒盒体为硬纸盒；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料。本实用新型试剂盒具有如下有益效果I、灵敏度高。磺胺类药物检测试剂盒以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成 ，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。其中的磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂条中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试剂盒具有较高的特异性和灵敏度。本试剂盒对磺胺喃唳、磺胺间二甲氧喃唳、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧咕嗪、磺胺氯咕嗪、磺胺苯酰、磺胺多辛的检测灵敏度分别为60 μ g/L>50 μ g/L、30 μ g/L、20 μ g/L、50 μ g/L、10 μ g/L、80 μ g/L、80 μ g/L、70 μ g/L、30 μ g/L、50 μ g/L、70 μ g/L。2、操作简便快速。使用试剂盒检测时无需任何其它试剂，只要将待检样品溶液滴加于微孔试剂中，混匀后，将试纸标有MAX标记线的一端向下，插入微孔试剂中，室温(20-25 0C )孵育5min后观察结果。3、显示检测结果形象、直观、准确。检测试纸条以显示红色线“I”及“ Il ”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红色线“ I ”印迹表示在被检测样本液中磺胺类药物的含量高于或等于试剂盒对磺胺类药物的最低检测限，两条红色线“ Il ”印迹表示在被检测样本中磺胺类药物的含量低于试剂盒对磺胺类药物的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。4、成本低，投资少。使用本实用新型试剂盒，不需另配仪器设备及其它试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。5、易于大范围推广应用。试剂盒操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、食品企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图I为本实用新型试纸条结构示意图；图2为本实用新型试纸条俯视图；图3为本实用新型微孔试剂图；图4为本实用新型试纸条检测结果判定图；图5为本实用新型试剂桶结构示意图；图6为本实用新型固定用具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定用具的侧视图。
具体实施方式
[0021]一、磺胺类药物检测试剂盒的组装制备(I)试纸条样品吸收垫I、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸粘贴有保护膜，保护膜7覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线，检测线4包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。(2)微孔试剂条 微孔试剂条8具有微孔塞9，板孔中冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物。(3)将上述试纸条和微孔试剂条装入具有密封盖的塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于试剂盒盒体12内的固定用具11中。二、试剂盒的使用滴加待检牛奶样品溶液200μ I到微孔试剂中，混匀后，将试纸标有MAX标记线的一端向下插入微孔试剂中，室温(20-25 °C )孵育5min后观察结果。三、检测结果分析磺胺类药物在样本中的含量高于或等于试剂盒对其的最低检测限时，磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物与磺胺类药物结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4所示。阳性当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸条以显示红色线“I”，判为阳性，如图4. a所示。阴性当质控线(C)显示一条红色条带，检测线(T)同时也显示出一条红色条带，试纸条以显示红色线“ Il ”，判为阴性，如图4. b所示。无效当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效，如图4. C、4. d所示。四、检测试剂盒中用到的材料制备方法I、磺胺类药物-载体蛋白偶联物的合成与鉴定磺胺类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。(I)磺胺类药物半抗原合成a)于25ml单口瓶中加入6_氨基烟酸O. 87g,乙醇20ml, 12mol/L盐酸3. 7ml,加热回流，反应8h，TLC监测，反应完毕，减压除去溶剂，溶于饱和NaHCO3水溶液，乙酸乙酯萃取，无水NaS2O4干燥，柱层析(乙酸乙酯/石油醚，2/l，v/v)纯化；b)于 25ml 单口瓶中加入 a)所得产物 O. 89g，三乙胺(Et3N) I. 6ml, CH2Cl2 10ml，搅拌溶解后，加入催化剂4- 二甲氨基吡啶(DMAP)。缓慢滴入4-乙酰氨基苯磺酰氯的2ml 二氯甲烷溶液，TLC监测，5h，反应完毕后处理，干燥，柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1/10，v/v)；c)于25ml单口瓶中加入b)所得产物lg，2mol/LNa0H水溶液120ml，加热回流，TLC监测，反应10h，完毕，调节PH4 5，有固体析出，即为磺胺类药物半抗原。(2)免疫原的制备——磺胺类药物与牛血清白蛋白偶联物合成取12mg磺胺类药物半抗原，溶解于Iml N，N_二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶液I ;取15mg碳化二亚胺(EDC)用O. 2ml水充分溶解后于加入I中，室温下搅拌24h，得到溶液II ;称取牛血清白蛋白(BSA)40mg，使之充分溶解在3ml PBS (pH 7.2)中，将溶液II逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h ;用0.0111101/1 PBS 4°C透析3天,每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，即得到磺胺类药物免疫原；分装，于_20°C保存备用。(3)包被原的制备——磺胺类药物与卵清蛋白偶联物合成取15mg磺胺类药物半抗原用O. 8ml DMF溶解，冷却至10°C，得到溶液I ;取氯甲酸异丁酯10 μ I加入I中，10°C搅拌反应30min ;取30mg卵清蛋白用2. 2ml 50mmol/L Na2CO3溶解，10°C反应4h，然后4°C过夜；用O.Olmol/L PBS 4°C透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，即得到磺胺类药物包被原；分装，于_20°C保存备用。(4)磺胺类药物-载体蛋白偶联物的鉴定将载体蛋白、磺胺类药物半抗原、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物用pH7. 4的PBS配成O. 5mg/ml的溶液，以O.Olmol/L pH7. 4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200 SOOnm范围内扫描，得到载体蛋白、磺胺类药物半抗原、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联成功。2、磺胺类药物单克隆抗体的制备(I)动物免疫将步骤I得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μ g/只，使其产生
抗血清。(2)细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8 I (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌磺胺类药物单克隆抗体的磺胺类药物单克隆杂交瘤细胞株。(3)细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO9个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37 °C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的制备与纯化增量培养法将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0. 2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7. 4。3、羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。[0060]4、磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备用双蒸去离子水将I %氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成
O.01% (质量百分含量)，置磁力加热搅拌器上搅拌煮沸，每IOOml O. 01%氯金酸加入
2.5ml I %柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂，产品目录号BGlI-AR-01KG)，继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下,用O. 2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7. O,按每毫升胶体金溶液中加入50 100 μ g的标准向胶体金溶液中加入上述磺胺类药物单克隆抗体，继续搅 拌混匀IOminJPA 10%牛血清白蛋白(BSA)使其在胶体金溶液中的终浓度为1% (体积百分含量)，静置lOmin。12000rpm，4°C离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度为50 100 μ g/ml，置4°C备用。复溶缓冲液含牛血清白蛋白O. I % O. 3 % (体积百分含量)、吐温-80
O.05% O. 2% (质量百分含量)、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。5、将磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上向微孔试剂微孔板中加入100 μ I磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-70°C条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂。磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干量为O. 20 O. 25 μ g/ml。6、样品吸收垫的准备将样品吸收垫置于含O. 5%牛血清白蛋白(体积百分含量)、ρΗ7·2、0· lmol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37°C烘2h备用。7、反应膜的制备包被过程用磷酸缓冲液将磺胺类药物半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到IOmg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为I. 0μ g/cm2 ;用
O.Olmol/L、pH7. 4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200 μ g/ml，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为l.Oyg/cm2。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥2h，备用。
权利要求1.一种检测磺胺类药物的试剂盒，其特征在于包括冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线印迹“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“ I ”。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述检测线和质控线平行，均呈与试纸条的长相垂直的条带状。
3.如权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm处，所述质控线位于距离检测线4_7mm处。
4.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述试纸条上贴有保护膜，保护膜覆盖在样品吸收垫上，为检测端。
5.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述微孔试剂条的反应孔上具有微孔塞。
6.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料，样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸，吸水垫为吸水纸，反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。
7.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还有固定用具及固定其中用于盛装微孔试剂条和试纸条的试剂桶。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒盒体为硬纸盒，试剂桶为塑料试剂桶，固定用具是硬质支撑材料。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述试剂桶上具有密封盖。
专利摘要本实用新型提供了一种检测磺胺类药物的试剂盒，包括冻干有磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂条和试纸条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样本吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，反应膜上具有包被有磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物的检测线印迹“|”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“|”。本实用新型试剂盒具有便携性好、灵敏度高、检测时间短等特点，可以在磺胺类药物残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/577GK202631540SQ201220077309
公开日2012年12月26日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者冯才伟, 吴鹏, 崔廷婷, 崔海峰, 罗贵昆, 付军权, 赵正苗, 刘玉梅 申请人:北京勤邦生物技术有限公司