专利名称：黄酒在抗动脉粥样硬化方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种黄酒的应用，具体是指黄酒在抗动脉粥样硬化方面的应用。
背景技术：
目前我国冠心病的发病率和死亡率(平均为62.5/10万人)均呈上升趋势，并已超过癌症成为第一大致死原因。预计未来10年，我国冠心病的发病率将继续呈现快速增长趋势。统计数据证实，毎年死于冠心病的人数估计超过100万，住院费用超过8亿5千万元人民币。特别是急性心肌梗死(AMI)和不稳定型心绞痛(UAP)是冠心病的重要类型，成为影响我国人群生存质量的重要因素。由于其致死率高，并能导致大量病人丧失普通劳动的能力，而且治疗费用昂贵，在増加病人痛苦的同时，亦大大增加了国家医疗费用的开支。目前高同型半胱氨酸血症(HCY)已被确定为冠心病的独立危险因素之一。与传统的危险因素相比，高同型半胱氨酸血症更能预测冠心病的发生及预后。此外，新近国外大量研究表明，基质金属蛋白酶(MMP)与动脉粥样硬化的发生发展密切相关；HCY可影响MMP表达，导致MMP引起细胞外基质重构，诱发动脉粥样硬化的发生发展。国外的大量研究已经证明，适量饮用红葡萄酒能够有效地预防冠心病的发生发展。红葡萄酒所含的多酚化合物对心血管保护的主要作用机制通过抑制氧化血低密度脂蛋白(LDL-C)，延长冠心病形成的潜伏时间，井能减少硫代巴比妥酸反应物(TBARS)的形成。黄酒是我国民族特产，与啤酒、葡萄酒并称“世界三大古酒”，千百年来，人们认识到黄酒具有一定的保健治疗效果，但其具体的功能、机制仍然是“千古之谜”。最新的分析表明绍兴黄酒具有酚类、低聚糖、肽类和功能性氨基酸等成分，这些成分与红葡萄酒极为相似。但关于黄酒在抗动脉粥样硬化的应用，目前国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄酒在抗动脉粥样硬化方面的应用。实现本发明目的采取的技术方案如下
黄酒在抗动脉粥样硬化方面的应用，分两期服用黄酒，初期时，黄酒的ロ服量为100-200ml/天，服用至动脉粥样斑块消退；維持期吋，间断饮用，饮用比例依次減少，減少率为上次饮用量的10-30%。所述的黄酒浓度为12-19% (体积比)。所述的酌减药量为间断饮用，间断饮用为每次饮用的时间间隔为24_48h。本发明的作用机理如下
冠心病的发病与高同型半胱氨酸血症(HCY)明显相关，冠状动脉病变程度也与同型半胱氨酸水平有关，与传统的危险因素相比，高同型半胱氨酸血症(HCY)更能预测冠心病的发病。而申请者前期基础研究表明，血管平滑肌细胞的迁移和増殖促进动脉粥样硬化斑块的形成，而血管平滑肌细胞的迁移和増殖与基质金属蛋白酶_2 (MMP-2)所致的细胞外基质重构有关，而同型半胱氨酸可以影响基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)的表达。低度黄酒可以降低血浆中同型半胱氨酸的含量，同型半胱氨酸含量的降低影响MMP-2的细胞外基质重构，从而，血管平滑肌细胞的迁移和增殖随之减轻，动脉粥样硬化斑块面积减小，防治冠心病的发病，达到治疗的效果。本发明的有益效果如下
I.本发明中黄酒在抗动脉粥样硬化的应用，绍兴黄酒对血浆HCY及MMP-2表达具有显著影响，因HCY可对冠心病发病起到预测作用，因而本发明填补了冠心病发病机制中的一项空白，为医学界的原始创新。基础实验也证实，饮用绍兴黄酒能逆转HCY诱导的MMP-2和动脉粥样硬化，对冠心病一级预防起到积极作用，为降低血浆HCY水平，预防冠心病发生，提供有效的科学依据，降低冠心病发病率，有利于提高我国人民的健康水平，也节省了大量医疗开支。
2.服用黄酒简便易行，不论男女，均可服用，既能保持身体健康，长期服用也不会有毒副作用。本发明中黄酒为绍兴黄酒(帝聚糖绍兴黄酒)，符合GB/T 13662——2008中的传统型半干黄酒黄酒。
图I为本发明黄酒在抗动脉粥样硬化方面的应用在细胞水平上的应用流程 图2为本发明黄酒在抗动脉粥样硬化方面的应用在动物水平上的应用流程 图3为本发明应用到细胞水平吋，同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞MMP-2的作用(**，/*<0. 01 vs. Hcy Oumol/1; #, /*<0. 05 vs. Hcy 50umol/l; ##, P<S). 01 vs. Hcy 50umol/I; $, /*<0. 05 vs. Hcy 100umol/l; $$, P<, 0. 01 vs. Hcy 100umol/l)；
图4为本发明应用到动物水平吋，分别经过24小吋、48小吋、72小时处理后，血管平滑肌细胞中 MMP-2 水平的变化(林，/XO. 01 vs. 24h; #，P<Q. 05 vs. 48h; ##，P<Q. 01 vs.48h; compared with Hcy: $$, /*<0. 01 vs. 24h; &&, /*〈0.01 vs. 48h; ++，P<S). 01 vs.72h.)；
图5为不同浓度黄酒对血管平滑肌Hcy (500umol/L)诱导的MMP-2表达的影响(24h)，(*，/*<0. 05 vs. yellow wine 0ml)；
图6为本发明应用到动物水平时，不同浓度黄酒分别经过12小吋、24小吋、48小时不同处理时间后，血管平滑肌细胞中MMP-2水平的变化(*，/X0. 05 vs. 12h; #，Ρ<0. 01vs. 12h; #，P<Q. 05 vs. 24h; ##，P<Q. 01 vs. 24h.)；
图7为不同试剂处理后，实验小鼠的主动脉弓处的粥样硬化斑块 图8为不同试剂处理后，实验小鼠的主动脉弓处的粥样硬化面积柱状图001 KS
control, x 土s, n=6. mPKO. 001 vs ethanol, y 土s, n=6.)；
图9为不同试剂处理后，实验小鼠的主动脉窦部HE和MMP-2免疫组化染色比较(a、e、i为对照组处理，b、f为こ醇处理，c、g为红酒处理，d、h为黄酒处理；a、b、c、d为主动脉窦部HE染色比较，e、f、g、h为免疫组化染色)；
图10为不同试剂处理后，实验小鼠的主动脉弓粥样硬化斑块处MMP-2 / proMMP-2的活性(** KO. 001 相对对照组，x 土S，n=6. #V<0. 001 こ醇处理，x 土s，n=6)。图中标号(A)、明胶酶谱分析法；(B)、免疫印迹法；
具体实施例方式本实施例中使用的试剂如下
无续Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基购自GIBCO(Grand Island, NY)公司，胎牛血清购自 Filtron Pty 公司(Tokyo, Japan)。D_L_ 同型半胱氨酸由 Nacalai Tesqu Inc.(Kyoto, Japan)提供。兔抗MMP — 2抗体(NeoMarkers' antibody line,Ab_7,RB-1537-P0)购自 Lab Vision Co. (ffestinghouse Drive - Fremont, CA, USA),其余试剂均为分析纯(AR)。I. I本发明在细胞水平上的应用
大鼠主动脉平滑肌细胞取自六周龄的雄性SD大鼠的胸主动脉。以IXlO4 3X104/ml的密度接种于含10%胎牛血清的DMEM培养，置于37°C、含5% CO2的培养箱中，在细胞生长充盈75% (体积比)培养皿时，用不含胎牛血清的培养基换液，然后对细胞进行不同的处理。加入不同浓度的Hcy，使其终浓度分别为50、100、500、1000umol/L ；分别将Iml浓度为12%、16%、19% (体积比)的黄酒加入500umol/L Hcy诱导组分别作用12、24、48h。收集培养液，2000r/min常温离心10 min，去除细胞碎片后，运用Bio-Rad法检测蛋白含量。将样品上样于含lmg/1白明胶的7. 5%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳；待溴酚蓝到达凝胶底部，室温条件下将该凝胶用洗涤缓冲液(pH=7. 5，50 mmol/1 Tris-Cl, 15 mmol/1 CaCl2,I μ mol/1 ZnCl2, and 2. 5wt%三硝基甲苯X — 100，pH=7. 5)漂洗30min，然后继续用洗涤缓冲液(50 mmol/1 Tris - Cl, 15 mmol/1 CaCl2,1 μ mol/1 ZnCl2,1% Triton X_100)37 °C温箱摇床平摇过夜。然后用0. lwt%考马斯亮蓝R-250对凝胶进行染色I h，脱色液(10%冰こ酸，45%甲酸溶液)脱色40 min,蓝色背景下白色区域即为白明胶酶，并应用密度扫描对白明胶酶进行定量测试。收集分别经上述不同时间处理的样品，用蛋白酶抑制剂PMSF(甲苯硫酰氟化物0. Immol/1)和亮肽素(10 μ g/ml)处理。这些样品先2000 X g离心IOmin,并经7. 5wt%十二烧基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(此通常称为SDS — PAGE)分离后，将样品转移到聚ニこ烯ニ氟化物膜(通常称为PVDF膜)上(Immobilon P，MiIIipore公司，孔径为0. 22 μ m，在室温下用含有0. 1%的吐温20 (即聚山梨酯20)和5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液封闭ー小时，然后用抗MMP-2单克隆抗体4°C冰箱中温育过夜)；次日用含0. 1%的吐温20的PBS冲洗5 min，共3次，加入含辣根过氧化物酶标记的羊抗兔ニ抗的相同缓冲液中在室温下轻摇Ih，最后经洗涤后扫描成像。其中，在细胞生长成熟时，可见细胞出现峰谷样生长方式，且胞质中富含肌丝。应用单克隆抗体HHF35 (能特异性识别肌动蛋白)经免疫组化法证实为血管平滑肌细胞。同型半胱胺酸含量为6.25-12.5μπι01/1时为生理性的，同型半胱胺酸含量>25 μ mol/1为病理性的。I. 2本发明在动物水平上的应用(O喂养小鼠实验用6周龄雄性LDL (低密度脂蛋白)受体基因缺陷小鼠(遗传背景C57BL/ 6J 10代后)，于室温25±2°C，同一天内照明和关灯各12小时，在SPF(Specific pathogen Free,无特定病原体)级环境喂养；标准饲料适应性喂养I周，给予高脂+高蛋氨酸(标准饲料+10wt%油脂+1. 25wt%胆固醇+lwt%蛋氨酸)喂养，并随机分为4组黄酒组(绍兴黄酒集团产，酒精度12%);红葡萄酒组(Maison Reserve Nicolas,Languedoc-Roussi I Ion, France,酒精度12%);酒精组(绍兴黄酒集团产,酒精度12%);对照组采用单纯饮水(水的标准为纯净水，符合GB/T 6682),每组12只。其中黄酒、红葡萄酒和酒精分别以体积比为I :3加入小鼠饮水中，稀释后酒精度均为3% (体积比)。(2)血样采取和检测按上述方式喂养小鼠14周后，禁食12h，用こ醚麻醉处死小鼠,立即经心脏右心房取血；血液标本经4000r / min离心IOmin后分离血清，于_80°C无菌保存至检测；采用全自动生化分析仪(Abbott Aeroset TM，USA)检测TC、TG和HDL-C水平，采用竞争酶联免疫法(Bayer ADVIA Centaur, Germany)检测血液中同型半胱氨酸的浓 度。(3)主动脉粥样硬化斑块面积的測定步骤(2)中血样采集后经左心室预冷PBS(含O. 05%吐温20，pH=7. 4的磷酸盐缓冲液)冲洗，从近段主动脉约Imm处离断血管，用10%(体积比)福尔马林固定24小时后，用石蜡包埋(每组6个样品);清除胸腹主动脉附属脂肪组织后，纵向分离血管至肾动脉，10% (体积比)福尔马林固定24小时后，用70% (体积比)酒精漂洗30秒，苏丹IV染色15min，80% (体积比)酒精处理20分钟，流水(纯净水)冲洗I小时；在XTZ-E体视显微镜上拍，并用Image-pro plus6. O图像分析系统分析动脉粥样硬化面积。(4)主动脉窦部粥样硬化面积的測定及免疫组化检测MMP-2的表达石蜡包埋小鼠心脏，从小鼠心脏底部以厚度为20Mm/张连续切片至出现主动脉瓣的圆形动脉组织后，以厚度为4Mm/张连续切片至瓣上约200Mm处，每隔5张切片留取I张进行常规HE染色及MMP-2免疫组化检测(I抗为兔抗IgG，l 50, Sigma Aldrich公司，产品号M4065 ;检测系统为 Dako REAL EnVision ，产品号:K5007)。MMP-2免疫组化方法为对连续切片留取的样品进行常规脱蜡，梯度酒精水化，消除内源性过氧化物酶，高温高压抗原修复厚，采用ニ步法(滴加ー抗4°C冰箱孵育过夜，PBS冲洗5min X 3。滴加辣根过氧化物酶标记的ニ抗，37°C孵育30min，PBS冲洗5min X 3。DAB反应染色30秒-I分钟，自来水终止反应。苏木素复染I min，PBS冲洗5min返蓝。常规脱水，透明，封片)进行免疫组化检测，并采用LEICA DL3000拍照及Image Pro-Plus 6.0软件进行分析。明胶酶谱法測定MMP-2在主动脉弓动脉粥样硬化处的活性剪碎主动脉弓，将少量组织块置于I 2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。加500ul单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中，进行匀浆裂解。然后置于冰上。3分钟后重复碾I分钟再置于冰上，反复碾多次使组织尽量碾碎。裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至I. 5ml离心管中，然后在4°C下12000rpm离心5min，取上清分装于O. 5ml离心管中并置于一80°C冰箱保存备用。裂解后提取主动脉弓处蛋白2(^g (各组，n=6)。在含O. lwt%明胶的10被％聚丙烯酰胺凝胶片上电泳，待溴酚蓝到达凝胶底部，在室温下用含2. 5wt% TritonX-IOO洗涤缓冲液平摇洗涤30 minX2后，在37で摇床平摇孵育缓冲液(pH=8. 8,50mmol/LTris-HCl，5mmol/L CaCl2,0. 02wt% NaN3)中孵育 42 小时。然后凝胶染色 2 小时(含 O. lwt%考马斯亮兰R-250溶液，10wt%冰こ酸，45wt%甲醇溶液，45wt%去离子水)，脱色(10wt%冰こ酸，45wt%甲醇溶液，45wt%去离子水)直到蓝色背景下出现白色条带，即为MMP-2，用双蒸水冲洗并终止脱色；采用凝胶成像系统进行拍照，Quantity 0ne4. 4软件定量分析。本发明中，双蒸水指经过两次蒸馏的水。I. 3黄酒在人体临床试验的抗动脉粥样硬化方面的应用 A、研究对象纳入标准选取经B超证实存在颈动脉硬化(软斑或硬斑)或冠脉CT提示冠状动脉硬化，且平素有饮用黄酒习惯的患者30例作为研究组；同时选取B超或冠脉CT提示动脉硬化、平素不饮用黄酒的患者30例作为对照组，两组研究者年龄、性別、吸烟构成比相似，均无其他高血压或糖尿病等慢性疾病。B、具体服用方式两组研究者均接受严格低脂饮食，黄酒组要求患者毎日晩餐前饮用帝聚糖绍兴黄酒100ml，饮用6个月，6月后两组患者复查颈动脉B超或冠脉CT (与6月前所做检查相对应)，将颈动脉硬斑面积减小、颈动脉软斑变为硬斑、冠脉硬化程度减轻定义为阳性结果，否则为阴性，比较两组患者阳性患者构成比，并做统计学比较。C、结果比较黄酒组6月后阳性例数8例(阳性率为26. 7%)，对照组I例(阳性率为3. 3%) (P〈0.05)。提示，适当剂量长期饮用黄酒，可使动脉硬化斑块消退，显著改善患者动脉硬化程度。表I黄酒在抗动脉粥样硬化方面的临床应用观察
权利要求
1.黄酒在抗动脉粥样硬化方面的应用，其特征在于分两期服用黄酒，初期时，黄酒的口服量为100-200ml/天，服用至动脉粥样斑块消退；维持期时，间断饮用，饮用比例依次减少，减少率为10-30%。
2.根据权利要求I所述的黄酒在抗动脉粥样硬化方面的应用，其特征在于所述的黄酒浓度为12-19%。
3.根据权利要求I所述的黄酒在抗动脉粥样硬化方面的应用，其特征在于所述的间断饮用为每次饮用的时间间隔为24-48h。
全文摘要
本发明公布了一种黄酒在抗动脉粥样硬化方面的应用，属于治疗局部缺血或动脉粥样硬化疾病的养生滋养保健品。分两期服用黄酒，初期时，黄酒的口服量为100-200ml/天，口服时间为餐前，服用至动脉粥样斑块消退；维持期时，间断饮用，饮用比例依次减少，减少率为上一次饮用量的10-30%，其中，间断饮用为每次饮用的时间间隔为24-48h，其中，黄酒浓度为12-19%(体积比)。采用本发明，可对冠心病一级预防起到积极作用，为降低血浆HCY水平，预防冠心病发生，提供有效的科学依据，降低了冠心病发病率，有利于提高我国人民的健康水平，也节省了大量医疗开支。
文档编号A61P9/10GK102813641SQ201210308499
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者郭航远, 彭放, 邢杨波, 池菊芳, 裘宇芳, 刘龙斌, 许富康, 杨芳芳, 唐伟良 申请人:绍兴市人民医院