专利名称：一株海洋真菌卷枝毛霉及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株海洋真菌-卷枝毛霉(Mucor circinelloides)MNP12010102及
其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，寻找生理活性强的物质成为人类攻克疾病的主要工作之一。由于对陆生动植物的药源发现越来越稀少，海洋已成为人类开垦新药的处女地。海洋约占地球总面积71%，微生物资源丰富，种类繁多，是生物资源的巨大宝库。海洋高盐、高压、低温、寡营养等独特的环境，赋予了海洋微生物独特的代谢途径和机体防御机制，使其产生的代谢物的化学结构新颖、生理功能独特，为提取和分离天然生物活性分子提供了 新来源。海洋微生物作为抗肿瘤活性物质的新来源，受到了全世界海洋研究工作者的关注。有关具有抗肿瘤活性的海洋微生物代谢产物的研究表明，醚类、大环内酯类、萜类、生物碱类、肽类、酰胺类以及醌类化合物具有较好的抗肿瘤活性，因此成为抗癌新药研发的重点。可见，从海洋真菌的次级代谢产物中发现高活性的物质对于发现先导化合物非常的重要，对疾病的攻克也具有着重要的意义。
发明内容
本发明目的是提供一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌菌株——卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)MNP12010102及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明采用的技术方案是一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌-卷枝毛霉(Mucor circinelloides)
MNP12010102,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No M 2012298，保藏日期:2012年7月25日。所述卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102涂布或划线接种于平板培养基上生长迅速，28°C培养48h后的菌落特征如下灰白色，菌落表面疏松，呈绒毛状，极易挑起。菌体沿培养基表面蔓延伸长，有成束状的气生菌丝，气生菌丝产黑色的球形孢子，气生菌丝的高度约O. 8 I. 5cm ;所述卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102在液体培养基中，28°C培养48h后的菌体生长特征如下呈绒毛小球状生长，小球直径约O. 35、. 8cm ；所述的卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102的生理生化特性如下革兰氏染色阳性。本发明所述卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102由浙江省东海海域米集的海水中分离和筛选得到。菌株的筛选纯化方法为将采集的海水运用稀释涂布法涂于土豆平板培养基上，28 V培养至菌落数量不再增加，挑取单菌落至斜面培养基上。28°C培养2d，以菌株形态特征区别进行挑选，即得该菌株，并对该菌株进行菌种鉴定。所述的平板培养基和斜面培养基的组成相同，组成为土豆15(T350g/L，葡萄糖l(T30g/L，琼脂15 35g/L，溶剂为海水，pH7. 2 8. O。本发明经筛选获得的卷枝毛霉Mucorcircinelloides MNP12010102，涂布或划线接种在平板培养基上生长迅速，28°C培养48h后长出灰白色，表面疏松，呈绒毛状，有成束状的气生菌丝的菌体。将所述的卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102的18sRNA部分核苷酸序列与美国国立生物信息中心(National Cen ter for Biotechnology Information USA, NCBI)的基因库中的微生物18sRNA序列比对，将其命名为卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102。所述卷枝毛霉 Mucor cireineIIoidesMNP12010102 的 18s rRNA 的部分核苷酸序列如下TTTCCGGTGGGGGACCTGCGGAAGGATCCTTAAATAATCAATAATTTTGGCTTGTCCATTATTATCTATTTACTGTGAACTGTATTATTACTTGACGCTTGAGGGATGCTCCACTGCTATAAGGATAGGCGATGGGGATGTTAACCGAGTCATAGTCAAGCTTAGGCTTGGTATCCTATTATTATTTACCAAAAGAATTCAGAATTAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTATAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAACTTGCGCTCATTGGTATTCCAATGAGCACGCCTGTTTCAGTATCAAAACAAACCCTCTATCCAACATTTTTGTTGAATAGGAATACTGAGAGTCTCTTGATCTATTCTGATCTCGAACCTCTTGAAATGTACAAAGGCCTGATCTTGTTTGAATGCCTGAACTTTTTTTTAATATAAAGAGAAGCTCTTGCGGTAAACTGTGCTGGGGCCTCCCAAATAATACTCTTTTTAAATTTGATCTGAAATCo本发明还涉及所述的卷枝毛霉MNP12010102在制备抗肿瘤药物中的应用。所述抗肿瘤药物具体可为治疗神经癌、肝癌或白血病的药物。所述应用具体为所述卷枝毛霉MNP12010102提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，所述提取物为乙酸乙酯提取物，由如下方法获得卷枝毛霉MNP12010102接种至液体发酵培养基，于25 35°C条件下培养Hlld得到发酵液，发酵液经细胞破碎，离心取滤液用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩，得浸膏，即为所述乙酸乙酯提取物；所述发酵培养基组成如下麦芽提取物5 10g/L，葡萄糖5 10g/L，麦芽糖f2. 5g/L，酵母膏O. 8 2g/L，溶剂为水人工海水体积比广4 1的混合物，ρΗ7. (Γ8. O。所述人工海水每IOOml 组成为NaCl 2. 448g, Na2SO4 O. 3917g, KC10. 0664g, KBrO. 0096g, SrCl2 0. 0024g, MgCl · 6H20 0. 4981g, CaCl2 · H2OO. 1102g, NaHCO3 0. 0192g, H3BO3
0.0026g, NaF 0. 0004g，蒸馏水 100ml。所述菌株在发酵培养前，通常需要先经斜面培养活化，然后经种子培养、获得种子液再接入液体发酵培养基进行培养。所述的斜面培养基组成为土豆15(T350g/L，葡萄糖l(T30g/L，琼脂15 35g/L，溶剂为人工海水，PH7. 2 8. O。所述的液体种子培养基组成为麦芽提取物5 10g/L，葡萄糖5 10g/L，麦芽糖Γ2. 5g/L，酵母膏0. 8 2g/L，溶剂为水人工海水广4 1的混合物，pH7. 2^8. O。所述的液体发酵培养基组成为麦芽提取物5 10g/L，葡萄糖5 10g/L，麦芽糖Γ2. 5g/L，酵母膏0. 8 2g/L，溶剂为水人工海水I 4 1的混合物，pH7 8. O。具体的，所述乙酸乙酯提取物由如下方法获得(I)将海洋真菌卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102菌株接种于斜面培养基，于25 35°C培养24 48h，得到活化后的菌种；
所述的斜面培养基组成为土豆15(T350g/L，葡萄糖l(T30g/L，琼脂15 35g/L，溶剂为人工海水，pH7. 2^8. O ；(2)将步骤(I)活化培养后海洋真菌卷枝毛霉Mucor circinelloidesMNP12010102菌体接种至液体种子培养基中，于25 35°C条件下培养16 48h，得到种子液；所述液体种子培养基组成为麦芽提取物5 10g/L，葡萄糖5 10g/L，麦芽糖f2. 5g/L，酵母膏O. 8^2g/L,溶剂为水人工海水f 4 1的混合物，pH7. 2^8. O ；(3)将步骤(2)种子液以10%体积比接种至液体发酵培养基，于25 35°C条件下培养疒14d，得到发酵液；所述的液体发酵培养基组成为麦芽提取物5 10g/L，葡萄糖5 10g/L，麦芽糖f 2. 5g/L，酵母膏O. 8 2g/L，溶剂为水人工海水广4 1的混合物，pH7^8. O。(4)将步骤(3)的发酵液于4°C条件下细胞破碎、离心或者过滤，分离除去菌体，所得发酵液用乙酸乙酯萃取后收集上层萃取液，浓缩挥干制得的油状提取物总浸膏(比重为
I.25^1. 38)。本发明的有益效果主要体现在(I)本发明的海洋真菌菌株一卷枝毛霉Mucorcircinelloides MNP12010102营养要求简单、容易培养；(2)本发明海洋真菌菌株——卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102的代谢产物具有抗肿瘤活性；(3)该菌株的次级代谢产物的抗肿瘤活性高，其培养所得的发酵液总浸膏对肝癌细胞(HepG2)、神经癌细胞株PC12细胞和白血病细胞株U937细胞都有一定的抗肿瘤活性。
图I为平板培养基上卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102的菌落形态；图2为光学显微镜下卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102的菌体形态。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :菌株的筛选、纯化及鉴定( I)将自东海海域采集的海水运用稀释涂布法涂于土豆平板培养基上，28°C培养至菌落数量不再增加，挑取单菌落至斜面培养基上。28°C培养2d，以菌株形态特征区别进行挑选，即得该菌株。所述土豆平板培养基按如下组成配制土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，人工海水1000ml。(2)对筛选获得的菌株MNP12010102进行18sRNA的PCR产物核苷酸序列比对，将其命名为卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102，提交中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No M 2012298，保藏日期2012年7月25日。实施例2 :菌株的活化及大规模培养(I)将实施例I中筛选获得的菌株接种于斜面培养基，于28°C培养24 48h，得到活化后的菌株，所述斜面培养基组成为土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，人工海水1000ml。(2)将步骤(I)活化培养后的菌株接种至液体种子培养基中，于28°C、15(T250r/min振荡条件下培养24 48h，得到种子液，所述液体种子培养基按如下组成配制麦芽提取物6. Og,葡萄糖6. Og,麦芽糖I. 8g，酵母膏I. 2g,蒸懼水800ml,人工海水200ml, pH7. 5。
(3)将步骤(2)种子液以10%的体积比的接种量，移种到大规模液体发酵培养基中，于28°C、15(T250r/min振荡条件下培养7d，静置培养7d得到发酵液。所述液体发酵培养基按如下组成配制麦芽提取物6. Og,葡萄糖6. Og,麦芽糖I. Sg,酵母膏I. 2g，蒸馏水800ml，人工海水 200ml, ρΗ7· 5。实施例3 :海洋真菌卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102在抗肿瘤活性中的应用(I)将实施例2中培养所得的发酵液先于超声波细胞破碎仪中进行菌体破碎20min,然后于4°C条件下离心(9000r/min，15min)或者过滤，除去菌体，等体积乙酸乙酯进行萃取，对萃取相进行旋蒸，所得浸膏(比重约为I. 32)即为该菌株的次级代谢产物总浸膏。(2)将步骤(I)所得的发酵液总浸膏进行抗肿瘤活性测定。具体步骤如下选取三株肿瘤细胞，分别为肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12细胞)，肝癌 细胞(HepG2细胞)和组织细胞淋巴瘤细胞(U937细胞)，取对数期的细胞株制成细胞悬液，接种于96孔板中，培养48h，待测样品(总浸膏加入O. 1%DMS010 μ L溶解后，用无血清的1640细胞培养基稀释，加100 μ L至试验组中，使得最终发酵液总浸膏的浓度分别为50 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml、400 μ g/ml、800 μ g/ml,阴性对照组加等量不含样品的无血清培养基，空白对照组则为无细胞和样品的无血清培养基，依托泊苷(VP-16)作为阳性对照品，每个浓度设5个复孔，肿瘤细胞在CO2培养箱(37°C)培养48h，每孔加入5mg/ml的MTT20 μ L，继续培养4h后，小心移去上清，每孔加DMS0150 μ L，振荡lOmin，用酶标仪充分振荡使得MTT紫色产物完全溶解，测490nm的A值，根据公式抑制率=(A阴性对照组-A空白对照组)-(A样品组-A空白对照组)/(A阴性对照组-A空白对照组)即可求得抑制率。(3)用SPSS软件测得海洋真菌卷枝毛霉Mucor circinelloidesMNP12010102的提取物对PC12细胞的IC50 (ug/ml)为373. 73ug/ml，提取物对H印G2细胞的IC50 (ug/ml)为512. 21ug/ml，提取物对 U937 细胞的 IC50 (ug/ml)为 250. 46ug/ml。由所测的数据可知海洋真菌卷枝毛霉Mucor circinelloidesMNP12010102的次级代谢产物的抗肿瘤活性高，其培养所得的发酵液总浸膏对肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12细胞)，肝癌细胞(ifepG2细胞)和组织细胞淋巴瘤细胞(U937细胞)都有一定的抗肿瘤活性。
权利要求
1.卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)MNP12010102,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号:CCTCC No M 2012298，保藏日期:2012年7月25日。
2.如权利要求I所述的卷枝毛霉MNP12010102在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抗肿瘤药物为治疗神经癌、肝癌或白血病的药物。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述卷枝毛霉MNP12010102提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述提取物为乙酸乙酯提取物，由如下方法获得卷枝毛霉MNP12010102接种至液体发酵培养基，于25 35°C条件下培养Hlld得到发酵液，发酵液经细胞破碎，离心取滤液用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩，得浸膏，即为所述乙酸乙酯提取物；所述发酵培养基组成如下麦芽提取物5 10g/L，葡萄糖5 10g/L，麦芽糖Γ2. 5g/L，酵母膏O. 8 2g/L，溶剂为水人工海水体积比广4 1的混合物，ρΗ7. (Γ8. O。
全文摘要
本发明提供了一株新的抗肿瘤活性海洋真菌菌株——卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NoM2012298，保藏日期2012年7月25日。本发明的有益效果主要体现在(1)本发明的海洋真菌菌株—卷枝毛霉Mucor circinelloidesMNP12010102营养要求简单、容易培养；(2)该菌株的代谢产物具有抗肿瘤活性；(3)该菌株的次级代谢产物的抗肿瘤活性高，其培养所得的发酵液总浸膏对神经癌细胞(PC12细胞)，肝癌细胞(HepG2细胞)和白血病细胞(U937细胞)都有一定的抗肿瘤活性。
文档编号A61P35/02GK102911876SQ201210308209
公开日2013年2月6日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日
发明者王鸿, 冯宇美, 谢燕瑾 申请人:浙江工业大学