专利名称：一种预防罗非鱼链球菌病的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼用疫苗，特别涉及一种预防罗非鱼链球菌病的疫苗。
背景技术：
罗非鱼(Tilapia)为一种中小型鱼,它是世界水产业重点科研培养的淡水养殖鱼类，且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一，原产于非洲，属于丽鲷科之热带鱼类，和鲈鱼相似。罗非鱼是我国重要的出口型经济鱼类之一，其健康养殖的意义重大。但是，近年来在广东、海南、福建等罗非鱼主产区大规模的爆发罗非鱼链球菌病， 波及范围广，病害控制难，给养殖户带来了巨大的经济损失。发病鱼表现为精神、食欲很差，体色发黑，离群打转游动，部分病鱼出现晶状体混浊，眼球突出甚至脱落的现象；疾病的发病率接近40%，死亡量与气温呈现明显的正相关性，气温在35°C以上时发病鱼的死亡率可高达100%，养殖户的损失惨重，据不完全统计，2009年该病对华南地区罗非鱼养殖造成的经济损失高达7亿人民币。据调查，罗非鱼病害往年已有发生，然而往年都能以氟苯尼考等药物很快控制，但近年来的病害来势凶猛，因耐药性等原因，药物控制效果差，养殖户损失惨重。“罗非鱼”作为海南人工养殖首要鱼种，若不能有效地预防和控制疾病的发生及蔓延，海南将面临“无鱼可养”的局面。因此，安全有效的治疗方式对于拯救海南罗非鱼养殖业显得迫在眉睫，疫苗免疫不会产生耐药性，是一种安全、有效、环保的方法，引起链球病菌的病原菌有海豚链球菌、无乳链球菌、副乳房链球菌、格式乳球菌等。申请号200580013779.X，发明名称“无乳链球菌疫苗”的专利申请公开了一种疫苗，其中包含免疫有效量的分离β溶血性无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的完整灭活细胞和β溶血性无乳链球菌培养物的浓缩提取物，菌株是保藏号为NRRL Β-30608和NRRL Β-30607的无乳链球菌，根据实施例表2可以得知，将该疫苗以注射的方式免疫时，保护率为7(Γ80%，以浸泡的方式免疫时，保护率为34 35%，该专利申请公开的疫苗实质上是灭活无乳链球菌与外毒素的二联疫苗，其安全性差，接种重量为5g的罗非鱼会致死；申请号201010207289. 6，发明名称罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法的专利申请公开了一种罗非鱼二联链球菌灭活疫苗，菌种是保藏号CCTCCN0 M209279的海豚链球菌，以及保藏号为CCTCCN0 M209278的无乳链球菌，二者等比例混合制成罗非鱼二联链球菌灭活疫苗，胸腔或者腹腔注射免疫，保护率为85%左右，但用该无乳链球菌制备的单一疫苗的保护率却并不高。现有技术公开的使用无乳链球菌制备的疫苗均是二联疫苗，制备方法复杂、成本高，存在安全性问题，需要寻找更为安全、成本低的疫苗。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的疫苗和新菌株。
本发明疫苗，它是由无乳链球菌〔Streptococcus agaJaciiae)和药学上可接受的辅料或者载体制备而成。所述疫苗包含致免疫有效量的灭活的无乳链球菌以及药学上可接受的辅料或者载体。所述的无乳链球菌是保藏号为ATCC51487无乳链球菌或者保藏号为CCTCC NO M2011271的无乳链球菌WR-6。
分离株 WR-6,鉴定为无乳链球菌"m&^Streptococcus agalactiae WR-6),于 2011 年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址中国.武汉.武汉大学)，保藏号为CCTCC NO M 2011271。 所述致免疫有效量为不低于IX 106CFU/ml ;优选地，所述的致免疫有效量为lX106-lX108CFU/ml。所述辅料或者载体为水或吸附剂。所述水为生理盐水或蒸馏水，所述吸附剂是沸石或硅藻土。本发明还提供了前述疫苗在制备预防罗非鱼链球菌病的药物中的用途。其中，所述的预防罗非鱼链球菌病的药物是通过口服、注射或者浸泡的方式给药的。本发明还提供了一种联合用药物，它包含前述的疫苗以及透皮吸收促进剂且任选一种或多种药学上可接受的辅料或载体。其中，所述透皮吸收剂为氮酮，或莨菪碱。本发明最后提供了一种无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌株,它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC NO M 2011271的无乳链球菌WR-6。本发明疫苗，用福尔马林灭活无乳链球菌菌液即得，注射免疫的保护率高达90%，用10倍正常注射剂量的疫苗攻毒时，未出现异常，为临床提供了一种新的、安全、保护率高、制备方法简单、成本低廉的无乳链球菌单联疫苗，可用于预防无乳链球菌引起的链球菌病。本发明保藏号为CCTCC NO M 2011271的无乳链球菌WR-6灭活制备的单联疫苗的保护率高，临床应用前景良好。
图116S rDNA扩增结果，I :空白对照；2 :鉴定样品；M DL2000DNA maker。
具体实施例方式以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例I菌株的分离鉴定I、实验材料与方法I. I实验材料待鉴定的细菌从海南文昌的患病罗非鱼体内分离，分离培养基为BHI，培养温度为37°C，编号为 WR-6。试剂耗材16S rDNA通用扩增试剂盒(TAKARA)、BHI培养基、细菌生化微量鉴定管(杭州天和生物试剂有限公司)、Taq DNA聚合酶(TAKARA)、琼脂糖(TianGen)、DL2000DNAmaker (TianGen)。I. 2实验方法I. 2. I革兰氏染色剂观察
取过夜培养的新鲜斜面一支，用接种环挑取少量菌体，涂在滴有少量无菌生理盐水的载玻片上，进行革兰氏染色，于显微镜下观察染色结果。I. 2. 216S rDNA的扩增与分析以提取的细菌基因组DNA作为模板，使用16S rDNA通用扩增引物扩增细菌的16SrDNA全长(PCR体系及扩增程序如下)，PCR产物经DNA纯化系统纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。使用RDP数据库和NCBI Blast数据库进行16S rDNA序列比对分析，得到细菌的种属。PCR 体系
权利要求
1.一种疫苗，其特征在于它是由无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和药学上可接受的辅料或者载体制备而成。
2.根据权利要求I所述的疫苗，其特征在于所述疫苗包含致免疫有效量的灭活的无乳链球菌以及药学上可接受的辅料或者载体。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于所述无乳链球菌是保藏号为ATCC51487无乳链球菌或者保藏号为CCTCC NO M 2011271的无乳链球菌WR-6。
4.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于所述致免疫有效量为不低于IXlO6CFU/ml ο
5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于所述致免疫有效量为IX IO6^l X IO8CFU/ml ο
6.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于所述辅料或者载体为水或吸附剂。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于所述水为生理盐水或蒸馏水，所述吸附剂是沸石或硅藻土。
8.权利要求1-7任意一项所述的疫苗在制备预防罗非鱼链球菌病的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的预防罗非鱼链球菌病的药物是通过ロ服、注射或者浸泡的方式给药的。
10.ー种联合用药物，包含权利要求1-7任意一项所述的疫苗以及透皮吸收促进剂且任选ー种或多种药学上可接受的辅料或载体。
11.根据权利要求10所述的联合用药物，其特征在于所述透皮吸收剂为氮酮，或莨菪碱。
12.一种无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),其特征在于它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC NO M 2011271的无乳链球菌WR-6。
全文摘要
本发明公开了一种疫苗，它是由无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和药学上可接受的辅料或者载体制备而成；本发明公开了该疫苗在制备预防罗非鱼链球菌病的药物中的用途，以及一种联合用药物；本发明还公开了一种新的无乳链球菌菌株。本发明疫苗可有效刺激罗非鱼产生抗链球菌病的免疫力，预防罗非鱼链球菌病，保护率高，有较高的实用价值和良好的经济效益。
文档编号A61K39/09GK102847146SQ20121033726
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月12日 优先权日2011年9月15日
发明者肖丹, 汪开毓, 阳涛 申请人:通威股份有限公司