专利名称：4-羟基水杨酰苯胺在制备防治乙型肝炎的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及4-轻基水杨酰苯胺在制备以核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotidereductase, RR)为祀标的防治乙型肝炎的药物中的应用。
背景技术：
慢性肝炎是威胁全球人类健康的严重传染性疾病之一。全世界约有20多亿人曾感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV),每年由于HBV感染而死亡的人数达100万。HBV感染不仅是引起慢性乙型肝炎、而且是引起原发性肝癌的重要生物学因素。中国、东南亚及非洲是HBV感染的高发区，原发性肝癌的发生率显著高于美洲中部和南部等HBV感染的低发区。慢性乙型肝炎现有的治疗主要有干扰素、核苷类药物、胸腺素，但这些药物长期应用会出现较严重的毒副作用或产生耐药，且价格昂贵。因此，寻找新型、有效的抗HBV药物是急需解决的问题。
核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase, RR)是细胞DNA合成限速酶。其功能是催化核糖核苷酸(NDPs)中核糖上C2位的羟基还原成氢，生成脱氧核糖核苷酸CdNDPs)0在细胞内，dNDPs经激酶作用生成三磷酸脱氧核苷(dNTPs)，为DNA合成提供原料。RR酶由2个相同的大亚基(α 2)和两个相同的小亚基(β 2)组成四聚体(α2β 2)。Rl(在人RR又称为Ml)代表α2部分，R2 (在人RR又称为M2)代表β 2部分，哺乳动物中还有另一 RR小亚基p53R2(在人RR又称为M2B)。已经证明，RR高表达，或由此造成的细胞内dNTPs库混乱，与肿瘤发生发展密切相关。而且，RR酶的高表达增加肿瘤治疗中的化疗抵抗。目前祀向针对RR酶治疗相关肿瘤已逐渐成为热点与重点。HBV基因组为双链、部分环状的DNA，由长链和短链组成。HBV侵入机体后，在肝细胞内进行复制，在其复制过程中病毒前基因组RNA逆转录成为DNA并复制子代病毒DNA。HBV DNA合成需要以dNTPs为底物。HBV通常在静止肝脏细胞中复制较快，但静止肝脏细胞中的dNTPs含量较低，正常情况下无法满足HBV的复制。最近研究表明，HBV之所以能够在静止肝脏细胞中复制，是因其HBx蛋白能够阻断R2抑制性调节因子Xl (Rfxl)的作用，在静止肝细胞中选择性激活R2基因表达，从而激活RR酶活性而使细胞能够生成大量dNTPs，供HBV在静止肝细胞中的自身复制需要，引起肝炎。4-轻基水杨酰苯胺,其结构式为
Zh r=\_
HN.........................................................\\CM该化合物的分子式为C13H11NO3,白色粉末状，分子量为229. 24，CAS编号为526-18-1。该化合物的通用名为柳胺酚片，目前用于肝胆病用药，作用机制与去氢胆酸相似，能增加肝血流量，改善肝功能，可使胆汁中水分显著增加。利胆作用较去氢胆酸强，能使Oddi括约肌松弛。此外尚有降低血胆固醇作用。
发明内容
本发明的目的在于提供4-羟基水杨酰苯胺的新用途，即4-羟基水杨酰苯胺在制备以核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase,RR)为祀标的防治乙型肝炎的药物中的应用。本发明采用的技术方案是4-轻基水杨酰苯胺在制备以核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase,RR) 为靶标的防治乙型肝炎的药物中的应用。 本申请人经实验研究发现，该化合物能有效抑制RR酶的活性，并且其能作为RR酶抑制剂，具有抑制肿瘤细胞生长的能力，可发展为肝炎和肿瘤的预防及治疗药物。具体的，所述4-羟基水杨酰苯胺用于制备抑制乙型肝炎病毒复制的药物。本发明化合物对RR酶的半数有效抑制浓度(IC5tl)的测定结果见图1，对H印G2. 2. 15细胞的IC10、IC25及IC50的测定见表2，对H印G2. 2. 15细胞上清液中HBsAg的影响的测定见表3，对H印G2. 2. 15细胞中HBV-DNA的影响见表4。该化合物可添加药物可接受的载体，制成常规的剂型如片剂、颗粒剂、针剂等。本发明的有益效果主要体现在(I)本发明对已知药物4-羟基水杨酰苯胺发掘了新的医疗用途，开拓了多个新的应用领域。(2)本发明发现4-羟基水杨酰苯胺是RR酶的抑制剂。(3)与RR祀向抑制药物轻基脲(Hydroxyurea, HU)比较,4-轻基水杨酰苯胺的RR酶抑制活性高10倍以上。(4) 4-羟基水杨酰苯胺的ICltl剂量对H印G2. 2. 15细胞表达HBsAg、以及HBV DNA复制具有明显抑制作用。4-羟基水杨酰苯胺抑制HBsAg表达作用明显较高于HU和拉米夫定(Lamivudine，3-TC);抑制HBV-DNA拷贝数明显高于HU、略低于3-TC。证明本发明的疗效
显著，药理作用强。(5) HBV常发生变异而产生耐药性，已有3-TC耐药的报道。4_羟基水杨酰苯胺抑制HBV的机制与3-TC不同，可供临床治疗选择使用。(6) 4-羟基水杨酰苯胺对多种肿瘤细胞具有较高的杀伤活性。(7)4-羟基水杨酰苯胺具有抑制HBV复制和肝癌细胞增殖的双重作用，因此与HU和3-TC比较，对肝癌的治疗和预防具有重要应用价值。(8)4-羟基水杨酰苯胺是保肝老药，安全性高，预示着其在肝炎和癌症领域有很好的药用前景。
图I为RR酶活性抑制实验结果。纵坐标为RR酶相对活性，是指每种化合物处理组相对于溶剂对照组RR酶活性(100%)作图(η=3，χ±§);羟基脲(HU)；图2为4-羟基水杨酰苯胺、羟基脲(HU)及拉米夫定(3-TC)对H印G2. 2. 15细胞的抑制曲线；图3为HBsAg标准品标准曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :药物的重组RR酶抑制活性I、实验材料(I)主要试剂轻基脲(Hydroxyurea, HU, Sigma), 4-轻基水杨酰苯胺(上海泰坦化学有限公司)。
(2 )主要仪器高效液相仪(日本岛津LC-10ATVP )，液体闪烁计数仪(BackmanLS6500)。2、实验方法( I)重组RR酶活性测定样品制备I)准备反应样品大肠杆菌体外表达纯化的重组人RR酶大亚基Ml(序列参见SEQID NO. I)和小亚基M2蛋白(序列参见SEQ ID NO. 2)(蛋白用量为RR酶活性达到65 95%)，加双蒸水调节体积为80 μ 1，加入不同浓度的测试化合物10 μ I ;混匀，室温孵育3(T60min ；2)每管加入反应缓冲液至体积100 μ I (终浓度50mM HEPES, pH 7. 2,6mM DTT,4mM magnesium acetate, 2mM ΑΤΡ,Ο. 05mM CDP, IOOmM KC1，0. 125 μ M[3H]CDP) ;37°C孵育20 30min ;沸水灭活IOmin ；3)加入 5 μ I 20mg/mL Η)Ε,37· 孵育 30min 60min ;沸水灭活 IOmin ;16000rpm 离心15min,取上清。(2) HPLC 测定I)色谱条件流动相磷酸二氢铵，PH3-5 ;流速lmL/min。色谱柱C18柱。2)样品测定将上述上清进样20yL ;收集HPLC分离样品50 μ L/管，每管加入4mL闪烁液。置于闪烁计数仪中测定样品的DPM和CPM。(3)计算RR酶活性(％)=实验组产物C^DP的CPM/空白对照组的CPMX 100%。3、实验结果以RR酶代表性抑制药物羟基脲(Hydroxyurea，HU)为阳性对照药物，将体外表达纯化的RR大、小亚基蛋白重组成RR全酶，测定药物的RR靶向抑制作用，结果见图I。结果表明，HU对重组RR酶活性的抑制作用呈剂量依赖性，与药物浓度呈正相关，计算其IC5tl为96. 55 μ M (RR酶活性50%抑制时的药物浓度)。4-羟基水杨酰苯胺对重组RR酶活性抑制作用明显高于HU，并呈剂量依赖性，计算其IC5tl为8. 23 μ Μ,抑制活性约为HU10倍。实施例2 :药物实验剂量的确定I.实验材料(I)细胞株!fepG2. 2. 15细胞(稳定转染HBV基因，可以稳定进行HBV基因组复制和表达)(浙江大学传染病研究所惠赠)。(2)主要试剂DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，羟基脲(Hydroxyurea, HU, Sigma), 4-轻基水杨酰苯胺(上海泰坦化学有限公司)，拉米夫定(Lamivudine, 3-TC,日本东京仁成工业株式会社)；Cell Counting Kit_8试剂盒(CCK8,日本株式会社同仁化学研究所)。(3)主要仪器二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma公司)，全自动酶标仪(Bio-TEK, Elx800)。2.实验方法(I)细胞培养细胞培养于DMEM高糖培养基(添加10%胎牛血清的DMEM培养基，pH 7. 2)，添加400yg/ml的G418，2mmol/L谷氨酰胺，置于细胞培养箱中在37°C、5%C02环境下培养。待细胞生长到70°/Γ80%时，用含有EDTA的胰酶消化传代。(2) CCK8试剂盒测定各药物对IfepG2· 2. 15细胞杀伤力 将4-羟基水杨酰苯胺用去除G418的DMEM培养基配制成125，175，250，350，500，700 μ M共6个浓度梯度，3-TC也同样配制成625，1250，2500，5000，10000，20000 μ M的浓度梯度，HU 则配制成 250，500，1000，2000，4000，8000，12000 μ M 的浓度梯度。H印G2. 2. 15 细胞浓度4Χ IO4个/mL,加入96孔培养板100 μ L/孔，置CO2孵箱37°C培养24h后，细胞贴壁且生长良好，吸除培养液，加入以上不同浓度不同药物的含药培养基IOOyL/孔，每个浓度3个复孔。连续培养72h，培养结束前2h，每孔加入CCK8试剂10 μ L，于CO2孵箱中继续培养。2h后自动酶标仪490nm检测各孔OD值。计算细胞存活率细胞抑制率(％)=[1_(实验孔OD均值/对照孔OD均值)]X 100%。拟合函数求出抑制细胞生长达50%时药物浓度(IC50)o3.实验结果分别以RR抑制药物HU、抗HBV药物3-TC为阳性对照药物，应用MTT法(CCK8 )测定药物的对H印G2. 2. 15的细胞毒性，计算各药物抑制H印G2. 2. 15细胞的IC1(I、IC25及IC5tl(图2，表2)。为检测药物低细胞毒性剂量时对HBV的抑制作用，后续相关实验选用抑制细胞生长为10%及25%时的药物浓度即ICltl和IC25两个剂量；同时阳性对照药3-TC及HU也设置IC10和IC25两个剂量，以保证不同药物作用的可比性。表2 :实验药物对H印G2. 2. 15的细胞毒性作用
权利要求
1.4_轻基水杨酰苯胺在制备以核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase,RR)为靶标的防治乙型肝炎的药物中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述4-羟基水杨酰苯胺用于制备抑制乙型肝炎病毒复制的药物。
全文摘要
本发明提供了4-羟基水杨酰苯胺在制药领域中的新用途。该化合物是核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase，RR)的抑制剂，通过抑制RR酶活性，阻断乙型肝炎病毒(HBV)复制所需dNTPs的合成，从而达到抑制HBV复制、治疗肝炎尤其是乙型肝炎的目的。可用于预防和治疗乙型肝炎，具有重要应用前景。
文档编号A61P1/16GK102920688SQ20121033716
公开日2013年2月13日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者邵吉民, 朱维良, 徐志建, 刘霞, 陈新焕 申请人:浙江大学, 中国科学院上海药物研究所