一种仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种仿天然血管中膜层结构和功能的组织工程支架及其制备方法。该支架由生物可降解高分子制备、荷载有生长因子，表面遍布平行排列的微米级沟槽、外表面又为纳米拓扑结构的多孔膜状物。制备方法如下：将载生长因子的纳米颗粒与生物降解聚合物溶液搅拌均匀后，浇铸到刻有平行排列沟槽的模具表面，冷冻二干燥去除溶剂，再进一步对支架进行表面处理后荷载生长因子，即得。本发明的组织工程支架具有的平行排列微米级沟槽结构、表面纳米拓扑结构及其所荷载的生长因子可对血管平滑肌细胞的生长和繁衍起到与天然血管中膜层细胞外基质相似的诱导与促进作用，使血管平滑肌细胞能在人工的支架上如同在天然血管的中膜层那样呈取向有序的生长和繁衍。
【专利说明】一种仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架及其制备方法。
【背景技术】
[0002]对于血管组织工程而言，生物可降解的支架起着支持并诱导细胞生长和繁衍、规定再生组织形状和大小，并最终和机体组织结合在一起的作用，与细胞和生长因子一起成为组织工程的三大要素。目前，虽然有许多采用不同材料支架的血管组织工程研究报道，但是这些支架的结构和功能与天然血管的细胞外基质相比差距甚远，且至今也未见与天然血管有相似结构和功能的组织工程血管支架的报道。
[0003]血管壁是由外膜、中膜和内膜所组成，其中的中膜是由高度取向的血管平滑肌细胞层组成，而在这些细胞层里平滑肌细胞和细胞外基质沿圆周取向排列，起着血管所呈现的结构支持作用。因此，要形成与天然血管中膜具有相似结构和功能的组织工程血管，就必须要求支架能提供类似天然血管中膜对平滑肌细胞所提供的仿生结构和微环境，使血管平滑肌细胞和细胞外基质在这样的支架上沿圆周取向排列，早期能够保持合成表型，使细胞快速生长和繁衍；而后期能使合成表型的细胞向收缩表型转换，从而使血管具有生理活性和阻止新内膜的形成。
[0004]目前一般采用的仿生方法就是先制备表面呈不同取向角度排列结构的二维支架，然后再将其卷绕成多层的管状结构，以此得到不同圆形层内具有不同斜度螺旋结构的管形支架。但目前研究报道的均 是具有单一微米取向结构或纳米结构表面拓扑形貌的聚内酯二维支架。这种单一的表面拓扑形貌支架对于控制血管平滑肌细胞的粘附、生长、空间组织和功能并不很理想。
[0005]此外，理想的支架应具备与天然组织相似的能分泌生长因子的功能。所以如果将与中膜再生相关生长因子一起荷载到具有多重表面拓扑形貌的多孔聚内酯类支架上，使它们按一定的时间和浓度释放以调控血管平滑肌细胞的增殖和分化，就有望成为具有天然血管壁中血管平滑肌细胞的生物化学和物理信号微环境功能的仿生血管支架。
[0006]由于聚乙交酯(PLA)、聚丙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)以及它们的共聚物等聚内酯聚合物具有良好的生物相容性、良好的机械性能和可调的降解速率已获得我国和美国等国家FDA的认证，成为可以应用于制备植入体内的医疗制品。因此用聚内酯类生物降解高分子作为组织工程化血管支架的基材可以兼具安全性和有效性，具有应用前景。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架及其制备方法。
[0008]本发明所提供的组织工程支架是按照包括下述步骤的方法制备得到的:
[0009]I)制备载生长因子A的纳米颗粒和载生长因子B的纳米颗粒；或制备同时载生长因子A和B的纳米颗粒；所述纳米颗粒为可降解纳米颗粒；
[0010]2)配制生物可降解聚合物的溶液，并向所述溶液中加入步骤I)制备的载生长因子A的纳米颗粒和载生长因子B的纳米颗粒或同时载生长因子A和B的纳米颗粒，搅拌均匀后浇铸到刻有平行排列沟槽的模具中，冷冻干燥去除溶剂，得到荷载生长因子A和B且表面具有平行排列的沟槽的膜状多孔支架；
[0011]3)对所述膜状多孔支架进行表面处理，使支架表面具有纳米拓扑结构；
[0012]4)在步骤3)处理后的膜状多孔支架上荷载生长因子C，得到同时荷载生长因子A\B\C、表面既具平行排列微米级沟槽结构、又具纳米拓扑结构的多孔结构的膜状物，即所述仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架。
[0013]上述方法，步骤I)中载生长因子纳米颗粒的制备方法具体如下:将纳米颗粒浸泡在生长因子A和/或B溶液中一段时间后，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载生长因子的纳米颗粒，载生长因子A和/或B的纳米颗粒中生长因子A或B的质量含量为0.005-2.0%。
[0014]所述纳米颗粒具体可选自下述任意一种:明胶纳米颗粒、胶原纳米颗粒和二氧化娃纳米颗粒。
[0015]所述明胶纳米颗粒和胶原纳米颗粒的粒径均为400-1000纳米。其由乳液-冷凝法制备，采用的乳化温度为35-45°C，搅拌速率为4-6千转/分钟，乳化时间为2-10分钟。
[0016]所述二氧化硅纳米颗粒的粒径为30-300纳米，其由溶胶-凝胶法制备得到。
[0017]步骤2)中生物可降解聚合物与载生长因子的纳米颗粒质量比为0.8-20。
[0018]本发明中所述生`长因子A、生长因子B、生长因子C不相同但均为可促进血管中膜再生的生长因子。具体可选自下述任意一种:bFGF、TOGF-BB和TGF-β I。
[0019]生长因子溶液的浓度可为50ng/ml-500y g/ml，浸泡时间为5-300分钟。
[0020]上述方法，步骤2)中所述生物可降解聚合物为聚内酯。具体可选自下述任意一种单体形成的均聚物和至少两种单体形成的共聚物中的任意一种:乙交酯(GA)、L-乳酸(LLA)、DL-乳酸(DLLA)和己内酯(CL)。
[0021]所述生物可降解聚合物的溶液的浓度可为2.0-9.0g/100ml。
[0022]所述生物可降解聚合物的溶液中的溶剂是由第一溶剂和第二溶剂组成的混合溶剂；其中，第一溶剂选自下述至少一种:二氧六环、苯和四氢呋喃，第二溶剂选自下述至少一种:丙酮、三氯甲烷、乙醇和水；所述混合溶剂中所述第二溶剂的体积含量为2.0-10.0%。
[0023]步骤2)中所述刻有平行排列沟槽的模具中沟槽的宽为10-200微米，沟槽深为2-50微米，相邻沟槽的间距为2-30微米。
[0024]上述方法，步骤3)中对所述膜状多孔支架进行表面处理的方法可选自下述至少一种:等离子体处理法、水解处理法和等离子体处理-生物大分子锚定法。
[0025]等离子体处理-生物大分子锚定法是先对支架进行等离子体处理，然后再在支架上锚定胶原、阳离子化明胶或层粘连蛋白等生物大分子的方法。
[0026]所述等离子体处理-生物大分子锚定法中所采用的生物大分子选自下述任意一种:胶原、阳离子化明胶和层粘连蛋白。
[0027]在步骤3)处理后的膜状多孔支架上荷载生长因子C的方法可采用等离子体处理-生长因子锚定法或大分子自组装法。[0028]本发明所制备的仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架中生长因子A、生长因子B和生长因子C的质量含量为0.001-0.5%。
[0029]所述支架表面平行排列沟槽的宽为10-200微米，沟槽深为2-50微米，相邻沟槽的间距为2-30微米。所述支架为膜状多孔支架，其厚度为50-1000微米。
[0030]本发明与现有技术相比具有如下有益效果:
[0031 ] 1、本发明同时模拟天然血管中膜组织的结构与功能，构建兼具多孔结构、平行排列微米级沟槽结构和纳米表面拓扑结构多重表面拓扑形貌，并且能够在一定时间以一定的浓度释放出多种保持生物活性的生长因子，符合血管组织工程要求的支架。
[0032]2、本发明的组织工程支架由合成的可生物降解的聚内酯聚合物制备，聚内酯具有良好的生物相容性、良好的机械性能和可调的降解速率，实现了支架的力学性能、降解时间的可控性。
[0033]3、本发明在支架上以不同的方法同时荷载多种生长因子，使各种生长因子以一定的浓度和时间保持活性释放。
【具体实施方式】
[0034]下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
[0035]下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0036]本发明提供的仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架的制备方法，步骤如下:1)载生长因子纳米颗粒的制备:将纳米粒子浸泡在生长因子A和/或B溶液中一段时间后，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载生长因子的纳米颗粒。
[0037]制备纳米粒的材料为明胶、胶原或二氧化硅。
[0038]明胶纳米粒子、胶原纳米粒子由乳液-冷凝法制备，粒径为400-1000纳米。采用的乳化温度为40°C，搅拌速率为4-6千转/分钟，乳化时间为2-10分钟。
[0039]二氧化硅纳米粒子由溶胶-凝胶法制备，粒径为30-300纳米。
[0040]所述生长因子A、 生长因子B和生长因子C各不相同，均可选自下述任意一种:bFGF、PDGF-BB 和 TGF- β I。
[0041]生长因子溶液的浓度可为50ng/ml-500 μ g/ml，浸泡时间为5-300分钟。
[0042]2)仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架制备:配制一定浓度的生物可降解聚合物溶液，与载生长因子A和B纳米颗粒搅拌均匀后浇铸到刻有平行排列沟槽的模具表面，通过冷冻行燥去除溶剂，进一步对支架进行表面处理后，再将支架浸泡在生长因子C溶液中一段时间后，冷冻干燥得到具有仿天然血管中膜结构与功能的组织工程支架。
[0043]所述生物可降解聚合物为生物可降解的聚内酯，具体可以为聚乙交酯(PGA)、聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、聚己内酯(PCL)，以及它们的共聚物。
[0044]所述聚合物溶液的浓度为2.0-9.0% (w/v)，溶剂则是由第一溶剂和第二溶剂组成的混合溶剂，其中第一溶剂为二氧六环、苯、四氢呋喃或它们的混合物、第二溶剂为丙酮、三氯甲烷、乙醇或水；混合溶剂中第二溶剂的含量为2.0-10.0% (v/v)。
[0045]所述表面处理的方法选自下述至少一种:等离子体处理技术、水解处理技术，或等离子体处理-生物大分子锚定技术。[0046]所述等离子体处理-生物大分子锚定表面处理技术中所采用的生物大分子具体是胶原、阳离子化明胶或层粘连蛋白。
[0047]在这种仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架上培养的牛大动脉平滑肌细胞，沿着沟槽方向生长，在早期能够保持细胞的合成表型，使细胞快速生长和繁衍，而后期能使合成表型的细胞向收缩表型转换，从而使再生的血管具有生理活性和阻止新内膜的形成。
[0048]在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。下列实施例旨在进一步描述本发明方法的各个方面。
[0049]实施例1、制备仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架
[0050]第一步:载生长因子bFGF明胶颗粒的制备:5ml的质量浓度为10%明胶水溶液滴加入175ml的橄榄油中，40°C和5千转/分钟下搅拌10分钟，然后将乳液冷却至室温，持续搅拌30分钟，加入100ml丙酮，在5千转/分钟下继续搅拌lh，生成颗粒分别用丙酮和4°C异丙醇洗涤后，离心收集。将得到的颗粒放入包含0.1%吐温60的2%戊二醛溶液中，4°C交联12小时。然后将颗粒放入100ml包含0.1 %吐温60的IOmM氨基酸溶液中，37°C下搅拌30分钟。用质量浓度0.1 %吐温60溶液洗涤后，离心冷冻干燥，得到粒径为0.6-20微米的明胶颗粒。选取IOOmg粒径为600-1000纳米明胶颗粒浸泡在500 μ I浓度为200 μ g/ml的bFGF溶液中2小时，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载bFGF的明胶颗粒，负载在IOOmg明胶颗粒上的bFGF为85.81 μ g。
[0051]第二步:载生长因子TGF-β I 二氧化硅纳米颗粒制备:将200mg的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) ,96ml的水和0.7ml的2M浓度的NaOH水溶液在80°C下混合，保持30min，然后加入0.6ml的正硅酸乙酯(TEOS)，80°C下600转/分搅拌下维持2小时，停止加热并恢复至室温，离心收集生成的二氧化硅粒子，甲醇洗涤。将上述获得的二氧化硅粒子，加入由25mL甲醇和ImL浓盐酸(质量浓度37% )组成的溶液中，加热回流10h，停止加热并恢复至室温。离心收集，甲醇洗涤，得到的二氧化硅的平均粒径为160nm。取IOOmg 二氧化硅浸泡在500 μ I浓度为180 μ g/ml的TGF- β I溶液中2小时，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载TGF- β I的二氧化硅纳米颗粒，负载在IOOmg 二氧化硅颗粒上的TGF- β I为81.60 μ g。
[0052]第三步:将PLGA(L-LA/GA = 70/30，mol/mol)(数均分子量为12万)配制成质量浓度为5%的二氧六环溶液640 μ 1，并加入30 μ I水混合均匀，加入载bFGF的纳米明胶颗粒8mg和载TGF-β I的二氧化硅纳米粒子8mg，搅拌均匀，浇铸到大小为3 X 3cm2表面具有平行排列沟槽的聚二甲基硅氧烷(PDMS)上，沟宽为50微米，沟槽深度5微米，槽间距为5微米。冷冻干燥使溶剂挥发，得到表面具有平行排列的微米级沟槽的多孔膜，膜厚度为100微米。
[0053]第四步:在0.25M NaOH/乙醇(V/V = 1/1)混合溶剂中，20°C下，浸泡薄膜2小时，用水洗涤并冷冻干燥后，得到表面既具平行排列的微米级沟槽、又具纳米拓扑结构的多孔膜状物。
[0054]第五步:在功率为50W，氧气氛下等离子体处理10分钟，然后浸泡在2ml浓度为30 μ g/ml的TOGF-BB中，I小时后取出薄膜并用水洗涤三遍，得到仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架，即实验样(47mg)。实验样中bFGF、TGF-β I及TOGF-BB的含量分别为 6.87 μ g、6.48 μ g 和 33.60 μ g。[0055]对照样I的制备:将PLGA(L-LA/GA = 70/30，mol/mol)(数均分子量为12万)配制成浓度为5%三氯甲烷溶液640μ 1，浇铸到光滑的大小为3X3cm2四氟乙烯槽中，室温下使溶剂挥发，得到表面光滑无孔的致密结构膜，作为对照样I。
[0056]对照样2的制备:将PLGA(L-LA/GA = 70/30，mol/mol)(数均分子量为12万)配制成浓度为5%二氧六环溶液640 μ 1，并加入30 μ I水混合均匀，浇铸到3X3cm2PDMS表面具有平行排列沟槽的PDMS上，沟宽为50微米，沟槽深度5微米，槽间距为5微米上，冷冻干燥使溶剂挥发，然后在0.25M NaOH/乙醇(V/V = 1/1)混合溶剂中，20°C下，浸泡薄膜2小时，用水洗涤并在室温下干燥后，在功率为50W，氧气氛下等离子体处理10分钟，得到表面既具平行排列的微米级沟槽、又具纳米拓扑结构的多孔膜状物，作为对照样2。
[0057]释放实验:支架(实验样)浸泡在包含I %牛血清蛋白的磷酸缓冲液(pH 7.4)里，每隔一定时间后收集释放介质，采用ELISA方法测定其中的生长因子的量。实验结果显示:荷载在仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上的三种生长因子均能持续释放，bFGF能持续释放21天，释放量为79% JGF-β I能持续释放28天，释放量为81% ；PDGF-BB能持续释放5天 ，释放量为85%。
[0058]体外细胞培养:将牛大动脉平滑肌细胞分别种植到对照样1、对照样2和实验样上。实验结果显示:在对照样I上，平滑肌细胞和细胞外基质呈无规组织形态；牛大动脉平滑肌细胞在实验样上培养3天后，细胞增殖明显大于在两种对照样上的增殖，细胞沿着沟槽方向取向生长，而且平滑肌细胞骨架蛋白也沿着沟槽方向取向分布和聚集。培养15天后，牛大动脉平滑肌细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)和hl-calponin等分化标志蛋白表达在实验样上最强。此研究结果表明在这种仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上，培养血管平滑肌细胞在早期能够保持细胞的合成表型，使细胞快速生长和繁衍，而后期能使合成表型的细胞向收缩表型转换，从而使再生的血管具有生理活性和阻止新内膜的形成。
[0059]实施例2、制备仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架
[0060]第一步:按照实施例1的方法制备载生长因子bFGF明胶颗粒。
[0061]第二步:按照实施例1的方法制备载生长因子TGF-β I 二氧化硅纳米颗粒。
[0062]第三步:将PGLC (GA/L-LA/CL = 63/27/10，mol/mol/mol)(数均分子量为 8 万)，配制成浓度为6%四氢呋喃溶液630 μ 1，并加入40 μ I三氯甲烷混合均匀，加入载bFGF的纳米明胶颗粒8mg、和TGF-β I的二氧化娃纳米粒子8mg,搅拌均匀,烧铸到大小为3X3cm2表面具有平行排列沟槽的PDMS上，沟宽为80微米，沟槽深度5微米，槽间距为10微米。冷冻干燥使溶剂挥发，得到表面具有平行排列的微米级沟槽的多孔膜，膜厚度为80微米。
[0063]第四步:在功率为50W，氧气氛下等离子体处理10分钟，再浸泡在2ml浓度为30 μ g/ml的TOGF-BB中，I小时后取出薄膜并用水洗涤三遍，得到仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架，即实验样(50mg)。实验样中bFGF、TGF-β I及TOGF-BB的含量分别为 6.87 μ g、6.48 μ g 和 33.60 μ g。
[0064]对照样I 的制备:将 PGLC(GA/L-LA/CL = 63/27/10,mol/mol/mol)(数均分子量为8万)配制成浓度为6%三氯甲烷630 μ 1，浇铸到光滑的大小为3X3cm2四氟乙烯槽中，室温下使溶剂挥发，得到表面光滑无孔的致密结构膜，作为对照样I。
[0065]对照样2的制备:将PGLC(GA/L-LA/CL = 63/27/10)(摩尔比，数均分子量为8万)配制成浓度为6%四氢呋喃溶液630 μ 1，并加入40 μ I三氯甲烷混合均匀，浇铸到3 X 3cm2PDMS表面具有平行排列沟槽的PDMS上，沟宽为80微米，沟槽深度5微米，槽间距为10微米，冷冻干燥使溶剂挥发，然后在功率为50W，氧气氛下等离子体处理10分钟，得到表面既具平行排列的微米级沟槽、又具纳米拓扑结构的多孔膜状物，作为对照样2。
[0066]释放实验:支架浸泡在包含I %牛血清蛋白的磷酸缓冲液(pH 7.4)里，每隔一定时间后收集释放介质，采用ELISA方法测定其中的生长因子的量。实验结果显示:荷载在仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上的三种生长因子均能持续释放，bFGF能持续释放23天，释放量为76%;TGF-13 I能持续释放30天，释放量为72%;PDGF_BB能持续释放7天，释放量为75%。
[0067]体外细胞培养:将牛大动脉平滑肌细胞分别种植到对照样1、对照样2和实验样上。实验结果显示:在对照样I上，平滑肌细胞和细胞外基质呈无规组织形态；培养3天后，牛大动脉平滑肌细胞在实验样上的增殖明显大于在两种对照样上的增殖，并且细胞沿着沟槽方向取向生长，而且平滑肌细胞骨架蛋白也沿着沟槽方向取向分布和聚集。培养15天后，牛大动脉平滑肌细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)和hl-calponin等分化标志蛋白表达在实验样上最强。此研究结果表明在这种仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上，培养血管平滑肌细胞在早期能够保持细胞的合成表型，使细胞快速生长和繁衍，而后期能使合成表型的细胞向收缩表型转换，从而使再生的血管具有生理活性和阻止新内膜的形成。实施例3、制备仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架
[0068]第一步:载生长因子bFGF胶原颗粒的制备:5ml的质量浓度为12%胶原溶液(溶剂为0.1N的乙酸水溶液)滴加入185ml的橄榄油中，40°C和5千转/分钟下搅拌10分钟，然后将乳液冷却至室温，持续搅拌30分钟，加入100ml丙酮，在5千转/分钟下继续搅拌lh。生成颗粒分别用丙酮和4°C异丙醇洗涤后，离心收集。将得到的颗粒放入包含0.1%吐温60的2%戊二醛溶液中，4°C交联12小时。然后将颗粒放入100ml包含0.1%吐温60的IOmM氨基酸溶液中，37°C下搅拌30分钟。用0.1%吐温60溶液洗涤后，离心冷冻干燥，得到粒径为0.4-6微米的胶原颗粒。选取IOOmg粒径为400-1000纳米胶原颗粒浸泡在500 μ I浓度为200 μ g/ml的bFGF溶液中2小时，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载bFGF的胶原颗粒，负载在IOOmg胶原颗粒上的bFGF为87.73 μ g。
[0069]第二步:载生长因子TGF-β I 二氧化硅纳米颗粒制备:将200mg的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) ,96ml的水和0.7ml的2M浓度的NaOH水溶液在80°C下混合，保持30min，然后加入0.6ml的正硅酸乙酯(TEOS)，80°C下2千转/分搅拌下维持2小时，停止加热并恢复至室温，离心收集生成的介孔二氧化硅粒子，甲醇洗涤。将上述获得的粒子，加入由25mL甲醇和ImL浓盐酸(质量浓度37%)组成的溶液中，加热回流10h，停止加热并恢复至室温。离心收集，甲醇洗涤，得到的二氧化硅的平均粒径为50nm。取IOOmg 二氧化硅浸泡在500 μ I浓度为180 μ g/ml的TGF- β I溶液中2小时，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载TGF- β I的二氧化硅纳米颗粒,负载在IOOmg 二氧化硅颗粒上的TGF-β I为85.61 μ g。
[0070]第三步:将PGC(GA/CL = 50/50，mol/mol)(数均分子量为5万)配制成浓度为8%苯溶液640 μ 1，并加入30 μ I水混合均匀，加入载bFGF的纳米胶原颗粒5mg、和载TGF- β I的二氧化硅纳米粒子5mg，搅拌均匀，浇铸到大小为3 X 3cm2，表面具有平行排列沟槽的PDMS上，沟宽为50微米，沟槽深度5微米，槽间距为5微米。冷冻干燥使溶剂挥发，得到表面具有平行排列的微米级沟槽的多孔膜状物，膜厚度为110微米。
[0071]第四步:在功率为20W，氨气氛下等离子体处理10分钟，然后浸泡在2ml浓度为
0.1 %的胶原溶液中(溶解胶原的溶剂为0.1N的乙酸水溶液)，其中胶原溶液中包含60 μ g的TOGF-BB，I小时后取出薄膜并用水洗涤三遍，得到仿天然血管中膜结构与功能的组织工程支架，即实验样(53mg)。实验样中bFGF、TGF-β I及TOGF-BB的含量分别为4.39 μ g、
4.28μ g 和 30.26 μ go
[0072]对照样I的制备:将PGC (GA/CL = 50/50，mol/mol)(数均分子量为5万)配制成浓度为8%三氯甲烷溶液640μ 1，浇铸到光滑的大小为3X3cm2四氟乙烯槽中，室温下使溶剂挥发，得到表面光滑无孔的致密结构膜，作为对照样I。
[0073]对照样2的制备:将PGC(GA/CL = 50/50，mol/mol)(数均分子量为5万)配制成浓度为8%苯溶液640 μ 1，并加入30 μ I水混合均匀，浇铸到3X3cm2 PDMS表面具有平行排列沟槽的PDMS上，沟宽为50微米，沟槽深度5微米，槽间距为5微米，冷冻干燥使溶剂挥发，然后在功率为20W，氨气氛下等离子体处理10分钟，然后浸泡在2ml浓度为0.1%胶原溶液中，I小时后取出洗涤后，得到表面既具平行排列的微米级沟槽、又具纳米拓扑结构的多孔膜状物，作为对照样2。
[0074]释放实验:支架浸泡在包含I %牛血清蛋白的磷酸缓冲液(pH 7.4)里，每隔一定时间后收集释放介质，采用ELISA方法测定其中的生长因子的量。实验结果显示:荷载在仿天然血管中膜层结构与功 能的血管组织工程支架上的三种生长因子均能持续释放，bFGF能持续释放18天，释放量为86%;TGF-13 I能持续释放25天，释放量为82%;PDGF_BB能持续释放8天,释放量为85%。
[0075]体外细胞培养:将牛大动脉平滑肌细胞分别种植到对照样1、对照样2和实验样上。实验结果显示:在对照样I上，平滑肌细胞和细胞外基质呈无规组织形态；培养3天后，牛大动脉平滑肌细胞在实验样上的增殖明显大于在两种对照样上的增殖，细胞沿着沟槽方向取向生长，而且平滑肌细胞骨架蛋白也沿着沟槽方向取向分布和聚集。培养15天后，牛大动脉平滑肌细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)和hl-calponin等分化标志蛋白表达在实验样上最强。此研究结果表明在这种仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上，培养血管平滑肌细胞在早期能够保持细胞的合成表型，使细胞快速生长和繁衍，而后期能使合成表型的细胞向收缩表型转换，从而使再生的血管具有生理活性和阻止新内膜的形成。
[0076]实施例4、制备仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架
[0077]第一步:载生长因子TGF-β I明胶颗粒的制备:按照实施例1的方法制备明胶颗粒。选取IOOmg粒径为600-1000纳米明胶颗粒浸泡在500 μ I浓度为400 μ g/ml的TGF- β I溶液中2小时，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载TGF-β I的明胶颗粒，负载在IOOmg明胶颗粒上的 TGF- β I 为 159.34 μ g。
[0078]第二步:载生长因子I3DGF-BB 二氧化硅纳米颗粒制备:按照实施例3的方法制备二氧化硅纳米颗粒。取平均粒径为50nm的IOOmg 二氧化硅浸泡在500 μ I浓度为300 μ g/ml的TOGF-BB溶液中2小时，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载I3DGF-BB的二氧化硅纳米颗粒，负载在IOOmg 二氧化硅颗粒上的I3DGF-BB为106.53 μ g。[0079]第三步:将PLGA(L-LA/GA = 30/70，mol/mol)(数均分子量为15万)溶解在苯和四氢呋喃的混合溶剂(体积比为1:1)中，配制成浓度为3%溶液640 μ 1，并加入30 μ I水混合均匀，加入载TGF- β I的明胶纳米颗粒5mg、和载TOGF-BB的二氧化硅纳米粒子5mg，搅拌均匀，浇铸到大小为3X 3cm2，表面具有平行排列沟槽的PDMS上，沟宽为50微米，沟槽深度5微米，槽间距为5微米。冷冻干燥使溶剂挥发，得到表面具有平行排列的微米级沟槽的多孔膜状物，膜厚度为70微米。
[0080]第四步:在功率为20W，二氧化碳气氛下等离子体处理20分钟，然后浸泡在2ml浓度为50 μ g/ml的bFGF中，I小时后取出薄膜并用水洗涤三遍，得到仿天然血管中膜结构与功能的血管组织工程支架，即实验样(25mg)。实验样中bFGF、TGF-β I及TOGF-BB的含量分别为 56.30 μ g、5.33 μ g 和 30.26 μ g。
[0081]对照样I的制备:将PLGA(L-LA/GA = 30/70，mol/mol)(数均分子量为15万)溶解在氯仿中，配制成浓度为3%的氯仿溶液640μ 1，并浇铸到光滑的大小为3X3cm2四氟乙烯槽中，室温下使溶剂挥发，得到表面光滑无孔的致密结构膜，作为对照样I。
[0082]对照样2的制备:将PLGA (L-LA/GA = 30/70，mol/mol)(数均分子量为15万)溶解在苯和四氢呋喃的混合溶剂(体积比为1:1)中，配制成浓度为3%溶液640 μ 1，并加Λ 30 μ I水混合均匀，浇铸到大小为3 X 3cm2，表面具有平行排列沟槽的PDMS上，沟宽为50微米，沟槽深度5微米，槽间距为5微米。冷冻干燥使溶剂挥发，然后在功率为20W，二氧化碳气氛下等离子体处理20分钟，得到表面既具平行排列的微米级沟槽、又具纳米拓扑结构的多孔膜状物，作为对照样2。
[0083]释放实验:支架浸泡在包含I %牛血清蛋白的磷酸缓冲液(pH 7.4)里，每隔一定时间后收集释放介质，采用ELISA方法测定其中的生长因子的量。实验结果显示:荷载在仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上的三种生长因子均能持续释放，bFGF能持续释放7天，释放量为72% J GF-β I能持续释放27天，释放量为79% ；PDGF-BB能持续释放20天，释放量为85%。
[0084]体外细胞培养:将牛大动脉平滑肌细胞分别种植到对照样1、对照样2和实验样上。实验结果显示:在对照样I上，平滑肌细胞和细胞外基质呈无规组织形态；培养3天后，牛大动脉平滑肌细胞在实验样上的增殖明显大于在两种对照样上的增殖，细胞沿着沟槽方向取向生长，而且平滑肌细胞骨架蛋白也沿着沟槽方向取向分布和聚集。培养15天后，牛大动脉平滑肌细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)和hl-calponin等分化标志蛋白表达在实验样上最强。此研究结果表明在这种仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上，培养血管平滑肌细胞在早期能够保持细胞的合成表型，使细胞快速生长和繁衍，而后期能使合成表型的细胞向收缩表型转换，从而使再生的血管具有生理活性和阻止新内膜的形成。
【权利要求】
1.一种制备仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架的方法，包括下述步骤:1)制备载生长因子A的纳米颗粒和载生长因子B的纳米颗粒；或制备同时载生长因子A和生长因子B的纳米颗粒；所述纳米颗粒为可降解纳米颗粒； 2)配制生物可降解聚合物的溶液，并向所述溶液中加入步骤I)制备的载生长因子A的纳米颗粒和载生长因子B的纳米颗粒或同时载生长因子A和生长因子B的纳米颗粒，搅拌均匀后浇铸到刻有平行排列沟槽的模具中，冷冻干燥去除溶剂，得到荷载生长因子A和B且表面具有平行排列的沟槽的膜状多孔支架； 3)对所述膜状多孔支架进行表面处理，使其表面具有纳米拓扑结构； 4)在步骤3)处理后的膜状多孔支架上荷载生长因子C，得到所述仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架； 其中，所述生长因子A、生长因子B、生长因子C各不相同，但均为可促进血管中膜再生的生长因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤I)中所述纳米颗粒选自下述任意一种:明胶纳米颗粒、胶原纳米颗粒和二氧化娃纳米颗粒； 所述明胶纳米颗粒和胶原纳米颗粒的粒径均为400-1000纳米；所述二氧化硅纳米颗粒的粒径为30-300纳米。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述生长因子A、生长因子B、生长因子C均选自下述任意一种:bFGF、PDGF-BB和TGF- β I。
4.根据权利要求1-3中`任一项所述的方法，其特征在于:步骤2)中所述生物可降解聚合物为聚内酯，所述聚内酯具体选自下述任意一种单体形成的均聚物和至少两种单体形成的共聚物中的任意一种:乙交酯、L-乳酸、DL-乳酸和己内酯； 步骤2)中所述生物可降解聚合物的质量与载生长因子A的纳米颗粒和载生长因子B的纳米颗粒质量之和的比为0.8-20，所述生物可降解聚合物与同时载生长因子A和生长因子B的纳米颗粒的质量比为0.8-20。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于:步骤2)中所述生物可降解聚合物的溶液的浓度为2.0-9.0g/100ml ； 所述生物可降解聚合物的溶液中的溶剂是由第一溶剂和第二溶剂组成的混合溶剂；其中，第一溶剂选自下述至少一种:二氧六环、苯和四氢呋喃，第二溶剂选自下述至少一种:丙酮、三氯甲烷、乙醇和水；所述混合溶剂中所述第二溶剂的体积含量为2.0-10.0%。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于:步骤2)中所述刻有平行排列沟槽的模具中沟槽的宽为10-200微米，沟槽深为2-50微米，相邻沟槽的间距为2-30微米。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于:步骤3)中对所述膜状多孔支架进行表面处理的方法选自下述至少一种:等离子体处理法、水解处理法和等离子体处理-生物大分子锚定法； 所述等离子体处理-生物大分子锚定法中所采用的生物大分子选自下述任意一种:胶原、阳离子化明胶和层粘连蛋白。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于:在步骤3)处理后的膜状多孔支架上荷载生长因子C的方法为等离子体处理-生长因子锚定法或大分子自组装法。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于:所述仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架中生长因子A、生长因子B和生长因子C的质量含量为0.001-0.5%。
10.权利要求1-9中任一项所述方法制备得到的仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架 。
【文档编号】A61L27/54GK103656758SQ201210363899
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月26日 优先权日:2012年9月26日
【发明者】沈红, 吴德成, 杨飞, 王身国 申请人:中国科学院化学研究所