专利名称：松果菊苷的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及松果菊苷的新用途，具体涉及在制备神经生长因子受体激动剂中的用途。
背景技术：
神经营养因子主要包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)和神经营养因子-4/5(NT-4/5)。神经营养因子在神经元的生长、分化和存活中起着重要的作用，它们主要通过结合并激活Trk受体和p75NTR受体发挥功能。其中，P75NTR受体属于肿瘤坏死因子受体家族，而Trk受体是跨膜酪氨酸激酶受体家族成员，包括TrkA、TrkB和TrkC。NGF主要与TrkA相结合，BDNF和NT-4/5主要与TrkB相结合，而NT-3则主要与TrkC相结合。神经营养因子与Trk受体结合后激活受体，促进受体形成同二 聚体，并磷酸化自身受体位于胞浆内的酪氨酸残基，从而进一步激活下游分子通路。这些细 胞通路被激活可以诱发多种生物学效应，包括抑制神经元凋亡、促进神经元的存活和分化、促进细胞骨架的改变以及轴突的延伸。在神经营养因子中，研究最多的是NGF和BDNF的神经保护作用，尤其是这两个因子在神经退行性疾病治疗中的应用前景得到了国内外的广泛关注。研究提示，阿尔茨海默病(AD)病人的记忆衰退及认知障碍与中枢胆碱能神经元进行性凋亡密切相关，而NGF和BDNF系统功能减退可能是导致这些神经元凋亡的重要原因。在AD病人和动物模型中都发现，基底神经节及中枢胆碱能神经元投射区的NGF和BDNF表达均下降，进而分别导致TrkA、TrkB受体的活性下降、合成减少，诱发神经元凋亡。相反地，通过转基因技术过表达NGF或BDNF都可以明显改善啮齿类和灵长类AD动物模型中基底神经节胆碱能神经元的功能，促进其突起生长，阻止凋亡，并减轻记忆衰退等症状。另外，在其他神经退行性疾病中，NGF和BDNF系统功能同样受损，进而加重相应脑区的神经元损伤。而在大鼠和灵长类H)模型中，通过转基因技术过表达NGF或BDNF或直接脑内注射外源重组神经营养因子能够保护中脑多巴胺能神经元；以上干预措施还可以促进HD动物模型中纹状体投射神经元的存活。由于神经组织具有难于再生和不能利用糖酵解提供能量等特点，神经系统、特别是中枢神经系统的疾病往往难于治疗，直到目前我们仍缺乏有效治疗神经退行性疾病的措施。神经营养因子一度被认为是有前途的治疗神经退行性疾病的措施之一，但重组的神经营养因子口服易降解，静脉注射后难于透过血脑屏障，起不到神经保护的作用，难以直接用于治疗神经退行性病。在很多疾病模型中通过转基因的方法使损伤脑区神经生长因子过表达，显示了良好的神经保护作用，但转基因技术目前还无法应用于人类。因此，现阶段大量国内外研究都致力于寻找或合成具有神经营养作用的稳定的小分子活性化合物，以期用于临床治疗神经退行性疾病。由于要在数目浩大的天然化合物中筛选出合适的活性分子，其工作量极为繁重，故目前的主要手段是人工合成神经营养因子的类似物。然而，合成的很多小分子多肽虽具有神经营养作用，却同样存在不稳定易降解和血脑屏障通透性低等问题；因受体选择性差以及可能的毒性未知等原因，合成的具有Trk受体激动作用的非肽类小分子化合物是否能应用于临床还存在疑问。中药是我国宝贵的历史遗产，中药治病属于经验用药，历经几千年反复实践，证实疗效显著且副作用较小，但目前很多机制靶标尚不明确。本申请选择临床已证实对神经退行性疾病有明显治疗效果的常用中药肉苁蓉，鉴定其提取物中的主要活性分子松果菊苷是否具有Trk受体激活作用，及该作用在其神经保护效应中的地位。该提取物活性强，较稳定不易降解，膜通透性强，可以自由穿越血脑屏障，具有成为药物的潜在价值。
发明内容
本发明的目的是提供中药肉苁蓉提取物中的主要活性小分子松果菊苷在制药方面的用途。为了达到上述目的，本发明提供了松果菊苷在制备神经生长因子受体激动剂中的用途。 进一步地，所述的神经生长因子受体为Trk受体。更进一步地,所述的Trk受体为TrkA和TrkB受体中的至少一种。本发明还提供了松果菊苷在制备神经保护药物中的用途。本发明还提供了松果菊苷在制备治疗动脉栓塞药物中的用途。本发明还提供了松果菊苷在制备治疗帕金森病药物中的用途。本发明证实了松果菊苷具有Trk受体激动作用，明确了其神经保护作用的机制以指导临床用药，具体如下(I)、细胞学实验证明，天然小分子活性化合物松果菊苷对神经细胞损伤有选择性特异保护作用，松果菊苷可以激活TrkA/B受体，通过Trk受体特异性抑制剂抑制受体激活能够逆转松果菊苷的神经保护作用。(2)、细胞学实验证实，虽然松果菊苷对非神经细胞损伤没有保护作用，当转染非神经细胞株，使其过表达人的TrkA/B受体后，松果菊苷能够激活受体，产生保护效应，该效应可以被Trk受体特异性抑制剂逆转。(3)、细胞学实验证实，当转染非神经细胞株，使其过表达胞外结合功能域缺失突变的TrkA/B受体后，松果菊苷的保护效应消失，说明松果菊苷是通过直接与TrkA/B受体结合激活受体活性，而不是通过胞内其他激酶激活TrkA/B受体的活性，证实松果菊苷是TrkA/B受体的激动剂。(4)、在多种动物中枢神经系统的损伤模型上进一步证明，静脉给与松果菊苷能产生显著神经保护效应，同时长期静脉给药没有产生明显的肝、肾毒性。本发明的有益效果在于发现了松果菊苷作为神经生长因子受体激动剂的新用途。
图I为松果菊苷的结构示意图；图2为松果菊苷预处理对Hela、CH0、PC12和原代培养大鼠皮层神经元细胞凋亡影响结果图；图3为松果菊苷和K252a预处理对大鼠皮层神经元TrkA/B受体活性和细胞凋亡影响结果图。图3A-B为松果菊苷和K252a预处理对大鼠皮层神经元中TrkA/B受体活性影响结果图；图3C为松果菊苷和K252a预处理对大鼠皮层神经元中神经元凋亡影响结果图；图4为Hela细胞过表达人源的全长TrkA或TrkB受体后，松果菊苷和K252a预处理对TrkA/B受体活性和Hela细胞凋亡影响结果图。图4A-B为Hela细胞过表达人源的全长TrkA或TrkB受体2d后，松果菊苷和K252a预处理对Hela细胞中TrkA/B受体活性影响结果图；图4C为Hela细胞过表达人源的全长TrkA或TrkB受体2d和4d后，TrkA/B的表达结果图；图4D-F为Hela细胞过表达人源的全长TrkA或TrkB受体2d后，松果菊苷和K252a预处理对Hela细胞凋亡影响结果图；图5为Hela细胞过表达人源的截断TrkA或TrkB受体后，松果菊苷和K252a预处理对TrkA/B受体活性和Hela细胞凋亡影响结果图。图5A-B为Hela细胞过表达人源的胞外结合功能域缺失突变的TrkA或TrkB受体2d后，松果菊苷和K252a预处理对Hela细胞中TrkA/B受体活性影响结果图；图5C为Hela细胞过表达人源的胞外结合功能域缺失突变 的TrkA或TrkB受体2d和4d后，TrkA/B的表达结果图；图OT-F为Hela细胞过表达人源的胞外结合功能域缺失突变的TrkA或TrkB受体2d后，松果菊苷和K252a预处理对Hela细胞凋亡影响结果图；图6A为大鼠大脑中动脉栓塞模型后的大脑冠状切片TTC染色结果图；图6B为大鼠大脑中动脉栓塞模型后大脑皮层的western blot测定结果图。图7为MPTP帕金森模型小鼠的中脑切片酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色结果图。图8为松果菊苷持续静脉给药0、3、6、12月后，大鼠肝肾功能的检测结果图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例来具体说明本发明。实施例第一步松果菊苷能通过激活TrkA/B受体选择性减轻神经细胞的损伤选用四种不同类型的细胞，Hela, CHO、PC12和原代培养大鼠皮层神经元，通过线粒体呼吸链抑制剂NaN3诱导细胞损伤，并在此基础上观察松果菊苷的保护作用，具体步骤为I、细胞培养I)细胞系的培养Hela(CCL-2. 2)、CH0(CCL_61)和 PC12 (CRL-1721)细胞都购自ATCC0 Hela和CHO细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养(Gibco公司)，PC12细胞则用含10%马血清、5%胎牛血清的DMEM培养液培养，细胞传代后长至80%融合时换液，进行下述的给药处理。2)大鼠皮层神经元的原代培养取孕17天左右的SD大鼠的健康胎鼠，取脑并分离皮层，剪碎后消化吹打，经筛网过滤，离心收集神经元细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，以1x107ml的密度种于细胞培养板上。4h后更换为神经元培养液(含B27的Neurobasal溶液，Gibco公司)，继续培养。3d后换液,一周后进行下述的给药处理。2、松果菊苷对神经细胞的选择性保护作用I)给药处理试验分组对照组(Ctrl)、NaN3组(NaN3)、松果菊苷低剂量组(E5+NaN3)、中剂量组(E10+NaN3)、高剂量组(E20+NaN3)。Hela、CHO 和 PC12 细胞的 NaN3组通过2mM的NaN3处理细胞24h诱导损伤；大鼠皮层神经元对NaN3损伤相对敏感，则用
O.2mM的NaN3处理神经元24h诱导损伤。松果菊苷低(5mg/L)、中(10mg/L)、高(20mg/L)剂量组都先用松果菊苷预处理各种细胞2h，更换新的培液后，再予NaN3单独处理24h。对照组不给药处理。NaN3购自Sigma公司；松果菊苷购自中国药品生物制品检定所。2)细胞凋亡的测定在NaN3给药处理12和24h后，分别收集以上各组的细胞，通过BD公司的Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒染色后，用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。实验数据以平均值土标准差(X土S)表示，用GraphPad Prism统计软件进行单因素方差分析。结果如图2所示，在NaN3诱导的四种细胞(Hela、CHO、PC12和原代培养大鼠皮层神经元)损伤模型中，松果菊苷预处理能显著降低PC12和大鼠皮层神经元的凋亡率，其保护作用呈剂量相关；然而，松果菊苷对Hela和CHO细胞损伤没有明显作用。提示松果 菊苷预处理能选择性保护神经细胞，而且剂量为10mg/L时就已能够提供最大保护效应。3、松果菊苷对大鼠皮层神经元中TrkA/B受体活性的影响 I)给药处理实验分组对照组(Ctrl)、NaN3组(NaN3，Na)、松果菊苷损伤组(E+NaN3，E+Na)、松果菊苷对照组(E)、K252a组(K+E+NaN3，K+E+Na)。大鼠皮层神经元通过
O.2mM的NaN3处理神经元24h诱导损伤；松果菊苷损伤组先用10mg/L松果菊苷预处理细胞2h,更换新的培液后，再予NaN3单独处理24h ;松果菊苷对照组用10mg/L松果菊苷预处理细胞2h，更换新的培液；K252a组先用I μ M的K252a和10mg/L松果菊苷同时预处理细胞2h,更换新的培液后，再予NaN3单独处理24h ;对照组不给药处理。K252a购自Sigma公司。2) Western blot检测蛋白水平的变化在NaN3给药处理12和24h后，收集以上各组的细胞，用 RIPA 裂解液(含有 150mM NaCl, I % NP-40,50mM Tris, pH 8.0，1% 脱氧胆酸钠，0. 1% SDS)冰上裂解细胞，12，OOOg离心20min收集上清。用BAC试剂盒(碧云天公司)测蛋白浓度后，通过8% SDS凝胶电泳、转膜、脱脂牛奶封闭后，一抗孵育过夜(pTrkA(9141)、TrkA(2505)、TrkB(4603)抗体均购自 Cell signaling 公司，pTrkB 抗体(NBP1-03516)购自 Novus 公司，β -actin 抗体(A3854)购自 Sigma 公司)。PVDF 膜(BioRad公司)经TBST漂洗后，孵育HRP标记的二抗山羊抗兔IgG(AP307P，Chemicon公司)。最后用ECL显色试剂盒(Santa Cruz公司)反应曝光,通过quantity one图像分析系统检测蛋白条带积分光密度。结果如图3A-B所示，NaN3损伤能抑制TrkA/B受体磷酸化,松果菊苷预处理不仅可以逆转该效应，还能进一步激活TrkA/B受体，显著增加受体磷酸化，而Trk受体的特异性抑制剂K252a能阻止松果菊苷激活TrkA/B受体。提示松果菊苷可能通过激活TrkA/B受体选择性减轻神经细胞损伤。3)细胞凋亡的测定在NaN3给药处理12和24h后，分别收集以上各组的细胞，按上述方法检测细胞凋亡的变化。结果如图3C所示，K252a阻止松果菊苷激活TrkA/B受体的同时还能逆转松果菊苷抑制神经元损伤的效应。证实松果菊苷是通过激活TrkA/B受体减轻神经元损伤的。第二步非神经细胞瞬时过表达人源的全长TrkA/B受体后，松果菊苷能通过激活Trk受体减轻细胞损伤
既然松果菊苷预处理对非神经细胞损伤没有明显作用，我们进一步在Hela细胞中瞬时过表达人源的全长TrkA/B受体，并观察在此基础上给予松果菊苷能否产生保护效应。具体步骤如下l)Hela细胞的培养及传代=Hela细胞的来源及培养同上所述，传代后过夜准备转染。
2)质粒制备通过分子克隆方法将人来源的TrkA/B全长cDNA装入pcDNA3. O表达质粒中。3)瞬时转染先将I μ g的质粒与100 μ I Opti-MEM溶液(Gibco公司)混勻，再与4μ I的FuGENE HD转染试剂(Roche公司)混合均匀，室温放置半小时后加入细胞中，6h后换成正常的细胞培液。4) Western blot验证TrkA/B过表达转染2d和4d后，收集Hela细胞,用上述同样的方法裂解细胞、提取蛋白、电泳、转膜、封闭后，孵育TrkA/B、β-actin抗体和二抗(来源同上)，曝光、拍照并分析数据。结果如图4C所示,转染2d和4d后，western blot检测显示Hela细胞中TrkA/B大量表达。于是在转染2d后，开始给药处理。5)给药处理实验分组对照组(Ctrl)、NaN3组(NaN3，Na)、松果菊苷损伤组(E+NaN3，E+Na)、松果菊苷对照组(E)、K252a组(K+E+NaN3，K+E+Na)。给药处理同上述大鼠皮层神经元的给药剂量和方式。6)细胞凋亡的测定在NaN3给药处理12和24h后，分别收集以上各组的细胞，通过上述方法检测细胞凋亡。7) Westernblot检测蛋白水平的变化在NaN3给药处理12和24h后，收集以上各组的细胞，用上述同样的方法裂解细胞、提取蛋白、电泳、转膜、封闭后，孵育PTrkA/B、TrkA/B、β-actin抗体和二抗(来源同上)，曝光、拍照并分析数据。结果如图4所示，松果菊苷预处理可以激活TrkA/B受体(图4A_B)，并明显抑制瞬时过表达TrkA/B受体的Hela细胞凋亡(图4D-F)。而同时给与K252a和松果菊苷预处理时，K252a能够完全逆转松果菊苷激活TrkA/B受体(图4A-B)及抑制细胞损伤(图4D-F)的效应。说明TrkA和TrkB受体都参与介导松果菊苷的神经保护作用。第三步非神经细胞瞬时过表达人源的截断突变TrkA/B受体后，松果菊苷不能激活截断突变的Trk受体，也不能抑制细胞损伤为证实松果菊苷是通过直接与TrkA/B受体相结合而激活受体，本发明构建了人源的胞外配体结合功能域缺失突变的TrkA/B表达质粒，瞬时转染Hela细胞，并观察在此基础上给予松果菊苷能否产生保护效应。具体步骤如下l)Hela细胞的培养及传代同上所述。2)质粒制备通过Toyobo公司的突变试剂盒将上述含有人来源的TrkA/B全长cDNA的pcDNA3. O表达质粒进行突变，得到受体胞外配体结合功能域缺失突变的TrkA/B表达质粒。3)瞬时转染和western blot验证TrkA/B过表达步骤都同上所述。结果如图5C所示,转染2d和4d后，western blot检测显示Hela细胞中截断突变的TrkA/B大量表达。同样地，我们在转染2d后，开始给药处理。
4)实验分组和给药处理都同上所述。5)细胞凋亡的测定同上所述。6) Western blot检测蛋白水平的变化同上所述。结果如图5所示，松果菊苷预处理不能激活截断突变的TrkA/B受体(图5A_B)，也不能抑制过表达截断突变TrkA/B受体的Hela细胞凋亡(图 _F)。提示松果菊苷是通过直接与TrkA/B受体结合激活受体活性,而不是通过激活胞内其他激酶进而激活TrkA/B受体活性的，证实松果菊苷是TrkA/B受体的直接激动剂。第四步在体给与松果菊苷同样可以激活TrkA/B受体，产生神经保护效应在动物中枢神经系统的损伤模型上进一步验证，静脉给与松果菊苷能否减轻神经元损伤、产生显著神经保护效应，同时检测治疗剂量的松果菊苷长期给药会否产生明显的 肝、肾毒性。具体步骤为I、大鼠大脑中动脉栓塞模型的建立健康SD大鼠，雄性，体重230 250g，购自中科院实验动物中心。动物随机分组对照组(Ctrl),缺血组(ischemia, I),松果菊苷缺血组(E+ischemia, E+I), K252a组(K+E+ischemia,K+E+I),松果菊苷对照组(E),每组14只。缺血组在大鼠左侧颈内、颈外动脉分叉处附近将线栓经颈内动脉入颅，监测血流至线栓堵住左侧大脑中动脉分支开口，持续缺血Ih后拔出线栓恢复灌流。同时对照组进行同样的手术处理，但不插入线栓。松果菊苷缺血组每天定时按40mg/(kg体重)连续静脉注射松果菊苷2周后，进行与缺血组相同的手术处理，并继续静脉注射松果菊苷5d ;松果菊苷对照组按同样剂量静脉给药但不予手术。K252a组给与同样剂量的松果菊苷和Κ252&(5μπι01/(1^体重)/d)同时静脉注射2周后，进行与缺血组相同的手术处理，并继续给药5d。每组同时给药，给药完成后再进行以下实验。2、TTC染色将各组一半的大鼠麻醉后直接取脑，通过模具行冠状切片，并浸入TTC染液(Sigma公司)中避光染色20min，取出漂洗后，排列拍照。如图6A所示，在大鼠大脑中动脉栓塞模型中，静脉给药松果菊苷能明显减小皮层和纹状体区梗死灶的面积，同时给与Trk抑制剂K252a能逆转松果菊苷的神经保护效应。3、Western blot检测蛋白水平的变化将各组另一半的大鼠麻醉后直接处死，取脑并分离左、右皮层，通过玻璃匀浆器冰上匀浆，再用RIPA裂解液充分裂解细胞，接着用上述同样的方法离心提取蛋白、电泳、转膜、封闭后，孵育pTrkA/B、TrkA/B、β-actin抗体和二抗(来源同上)，曝光、拍照并分析数据。如图6B所示，松果菊苷静脉给药能激活大鼠皮层神经元的TrkA/B受体，通过K252a阻止TrkA/B受体激活可以逆转松果菊苷的神经保护效应。说明在体给与松果菊苷同样是通过激活TrkA/B受体产生神经保护效应的。4、小鼠MPTP帕金森模型的建立健康C57BL小鼠，雄性，体重20 25g，购自中科院实验动物中心。动物随机分组对照组(control)，MPTP 组，松果菊苷组(E+MPTP)，K252a 组(K+E+MPTP)，每组 7 只。MPTP组每日定时按30mg/ (kg体重)腹腔注射MPTP (Sigma公司)，连续注射5d。对照组同时给与等量的生理盐水腹腔注射。松果菊苷组在连续静脉注射松果菊苷(40mg/(kg体重)/d)2周后，开始腹腔注射MPTP (30mg/ (kg体重)/d)，并继续静脉注射松果菊苷2周。K252a组给与同样剂量的松果菊苷和K252a(5 μ mol/(kg体重)/d)同时静脉注射2周后，开始腹腔注射MPTP，并继续静脉给药2周。每组同时给药，给药完成后再进行以下实验。5、小鼠的灌注、取脑及冰冻切片小鼠用10%水合氯醛麻醉；经心灌注生理盐水100ml，再灌注固定液即含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(O. lmol/L,pH 7. 2) 250ml，30min灌注完毕。取出整脑，在上述固定液内浸泡6h。经梯度蔗糖脱水后，冰冻冠状切片。6、酪氨酸羟化酶免疫组化染色挑取黑质平面的连续冠状切片，进行酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组化染色，以鉴定多巴胺能神经元。步骤如下用O. OlM PBS溶液(pH = 7. 4)漂洗脑片3次，再用含O. 2%TritonX-100和10%小牛血清的O. OlM PBS溶液封闭I小时后，兔抗大鼠TH抗体
(Chemicon,AB152) 一抗孵育过夜，用O. OlM PBS溶液漂洗脑片3次，HRP标记的二抗山羊抗兔IgG (AP307P, Chemicon公司)孵育I小时,通过DAB试剂盒(中杉金桥)显色，显微镜下观察。如图7所示，在小鼠MPTP帕金森模型中，静脉给药松果菊苷能显著减少中脑多巴胺能神经元的死亡，同时给与Trk抑制剂K252a可以逆转松果菊苷的神经保护效应，提示松果菊苷可以对多种神经元损伤产生保护作用。7、肝肾功能的测定健康SD大鼠，雄性，体重230 250g，购自中科院实验动物中心。动物随机分组对照组(Ctrl)，松果菊苷组(E)，每组7只。松果菊苷组按上述治疗剂量40mg/ (kg体重)/d持续静脉给药0、3、6、12月后，自大鼠尾静脉采血，血样经4000rpm离心2min分离血清。通过丙氨酸氨基转移酶(GPT)试剂盒及天门冬氨酸氨基转移酶(GOT)试剂盒测定血清中GPT和GOT的含量以反映肝功能；通过肌酐(Cr)试剂盒和尿素氮(BUN)试剂盒测定血清中Cr和BUN的含量以反映肾功能。以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。如图8所示，治疗剂量的松果菊苷持续静脉给药12个月对大鼠的肝功能(GPT、GOT)和肾功能(Cr、BUN)都没有显著影响，说明治疗剂量的松果菊苷在体长期静脉给药没有明显的肝、肾毒性。
权利要求
1.松果菊苷在制备神经生长因子受体激动剂中的用途。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的神经生长因子受体为Trk受体。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的Trk受体为TrkA和TrkB受体中的至少一种。
4.松果菊苷在制备神经保护药物中的用途。
5.松果菊苷在制备治疗动脉栓塞药物中的用途。
6.松果菊苷在制备治疗帕金森病药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了松果菊苷的新用途。天然小分子活性化合物松果菊苷对神经细胞损伤有选择性特异保护作用，松果菊苷可以激活TrkA/B受体，通过Trk受体特异性抑制剂抑制受体激活能够逆转松果菊苷的神经保护作用。静脉给与松果菊苷能产生显著神经保护效应，同时长期静脉给药没有产生明显的肝、肾毒性。
文档编号A61P25/16GK102861041SQ20121037790
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者李文伟, 朱敏, 吕传真 申请人:复旦大学附属中山医院