治疗猪呼吸道疾病综合征的制作方法

专利名称：治疗猪呼吸道疾病综合征的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含猪2型圆环病毒(PCV2)抗原的免疫原性组合物用于预防及治疗动物、尤其猪的猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的用途。
背景技术：
猪2型圆环病毒(PCV2)为小型(直径为17nm-22nm) 二十面体无包膜DNA病毒，其含有单链环状基因组。PCV2与猪I型圆环病毒(PCVl)共有大约80%之序列一致性。然而，与通常为非致病性之PCVl不同，猪感染PCV2近来已与多种疾病综合症(其共同称作猪圆环病毒疾病(PCVD)(亦称作猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)))相关(Allan等人，2006，IPVSCongress)。通常认为离乳后多系统消耗性综合症(Postweaning MultisystemicWasting Syndrome ；PMWS)为 PCVD 之主要临床表现(Harding 等人，1997，Swine HealthProd; 5:201-203 !Kennedy 等人，2000，J Comp Pathol; 122:9-24)。PMWS侵袭介于 5-18 周龄之猪。PMWS之临床特征在于消瘦、皮肤苍白、生长迟滞、呼吸窘迫、腹泻、黄疸及黄胆。在一些受感染之猪中，将显而易见所有症状之组合，而其它受感染之猪将仅具有所述症状中之一或两者(Muirhead，2002，Vet. Rec. ; 150:456)。在尸检期间，显微镜可见及肉眼可见之病灶亦出现于多个组织及器官上，其中淋巴器官为最常见之病灶部位(Allan及Ellis，2000; JVet. Diagn. Invest.，12:3-14)。已观测到PCV2核酸或抗原之量与显微镜可见淋巴病灶严重性之间的较强相关性。感染PCV2之猪之死亡率可达80%。目前对PCV2参与除PMWS之外的猪疾病中的程度尚不甚了解(Chae，VeterinaryJ.，2005;169:326-336)。存在若干种在文献中报导之潜在相关病状，其包括猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪皮肤病及肾病综合症(TONS)、繁殖障碍、肉芽肿性肠炎及潜在先天性震颤(CT-AII)及周产期心肌炎(Chae, Veterinary J.，2005; 169:326-336)。其中，由于 PRDC之一般高流行性、高发病率(在感染农场为30%-70%)及死亡率(在感染农场为4%-6%)，认为其在欧洲具有最大经济影响(Kim等人，Veterinary J.，2003; 166:251-256)。罹患PRDC的猪的肺炎是由于病毒性病原体和细菌性病原体组合所致，所述病原体如 PRRSV、猪流感病毒(Swine influenza virus ;SIV)、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pIeuropneumoniae)及多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)。尽管病因学涉及多种病原体且在各农场之间不同,但PRRSV及猪肺炎支原体为两种最常见的从表现PRDC的PCV2阳性猪分离到的病原体(Kim等人，Veterinary J.，2003; 166:251-256)。仍未知 PCV2 是否在 PRDC 之病因或 PRDC 之临床迹象(clinical sign)之表现、严重性或延长中起任何作用。与其它病毒性病原体相比，在罹患PRDC之猪之肺病灶中一致诊断出PCV2。前瞻性研究已证明由共同感染PCV2及PRRSV产生之肺炎及通常系统性疾病比与单独感染任一病原体相关之疾病更严重。因此可假定在PCV2与其它病原体之间存在明显协同效应，其已在该领域中之呼吸道疾病病例中观测到(Ellis等人，VeterinaryMicrobiol.，2004;98:159-163)。然而，仍未知PCV2(若存在于罹患PRDC之猪中)是否对猪之PRDC之临床迹象具有任何影响。由于在肥育(fattening)结束时具有高达100%血清反应阳性之PCV2动物普遍存在，类似地PCV2可对PRDC之疾病表现完全无影响，但仅为不相关共感染病原体。尽管PMWS通常侵袭幼猪(通常介于5与12周龄之间)，但PRDC主要可见于生长至肥育猪(通常约为16至22周龄)中。发病率在30%-70%范围内，其中平均死亡率为 4%-6%(Kim 等人，Veterinary J. , 2003; 166:251-256) PRDC 之临床迹象为难以用抗生 素疗法治愈之长期且异常严重之咳嗽及呼吸困难(dyspnea)、生长缓慢、饲料效率(feedefficiency)降低、昏睡(lethargy)、厌食(anorexia)及在肥育中期至后期死亡率显著增加。显微镜可见病灶PRDC之特点为具有支气管周及细支气管周纤维化之支气管性间质性肺炎。巨噬细胞之浸润显著增厚肺泡隔(Chae，Veterinary J.，2005; 169:326-336)。基于DNA疫苗之治疗PCV2感染之方法描述于美国专利第6，703，023号中。在WO03/049703中描述嵌合活疫苗的制备，该嵌合活疫苗包含PCV-I骨架，且该骨架中有基因被致病性PCV2病毒株的免疫原性基因置换。W099/18214已提供若干种PCV2病毒株及用于制备PVC2灭活疫苗的方法。但未曾报导功效资料。WO 06/072065已报导有效的基于0RF-2的亚单位疫苗。任一种上述疫苗都意欲用于3周龄以上的猪的疫苗接种/治疗。任何所述疫苗均未描述用于免疫预防或治疗罹患PRDC之猪、尤其罹患PRDC之PCV2阳性猪。此外，尚无人描述所述疫苗赋予抗PCV2感染的保护性免疫力，或降低、减轻已具有抗PCV2抗体(优选具有母体抗PC2抗体)的猪中与其相关之任何临床症状的严重性，或治愈与其相关之任何临床症状。


图I :按周数分组的各个组之间体重增加程度的差异。图2 :研究过程中体重差异(IVP-CP)及平均病毒负载量(log 10)的变化。

发明内容
本发明涉及下述各项。I. PCV2抗原或含PCV2抗原的免疫原性组合物的制药用途，所述药物是用于预防及治疗动物的猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或任何与PRDC相关的临床迹象的药物。2.项I的用途，所述药物以治疗有效量施用需要此治疗之动物。3.项I或2的用途，其中与PRDC相关的临床迹象选自由咳嗽及呼吸困难、生长缓慢、饲料效率降低、昏睡、厌食和/或在肥育中期至后期死亡率显著增加组成的组。4.项3的用途，其中该咳嗽及呼吸困难是难以用抗生素疗法治愈的咳嗽及呼吸困难。5.项1-4之一的用途，其中该PRDC与PCV2感染相关。6.项5的用途，其中该PRDC由PCV2造成。7.项6的用途，其中该 PRDC进一步与下列病原体的感染相关和/或由下列病原体的感染造成PRRSV、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、猪流感病毒(Swine influenza virus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)、猪链球菌(Streptococcus suis)和 / 或多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)。8.项1-7之一的用途，其中该动物属于PCV2阳性的畜群。9.项1-8之一的用途，其中该动物属于PCV2及一或多种选自下组的其它病原体阳性的畜群PRRSV、猪肺炎支原体、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、猪鼻支原体、猪链球菌和/或多杀巴斯德氏菌。10.项1-9之一的用途，其中该动物属于PCV2阳性农场的动物。11.项1-10之一的用途，其中该动物属于PCV2及一或多种选自下组的其它病原体阳性的农场PRRSV、猪肺炎支原体、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、猪鼻支原体、猪链球菌和/或多杀巴斯德氏菌。12.项1-11之一的用途，其中该PCV2抗原是与PCV2的0RF-2具有至少80%同源性的多肽。13.项1-12之一的用途，其中该PCV-2抗原是由重组杆状病毒表达的PCV2 0RF-2。14.项 1-13 之一的用途，其中该 PCV2 抗原为 Illgel vac⑧ CircoFLEX 。15.项1-14之一的用途，其中该动物为猪。16.预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象的方法，包括对需要此种治疗的动物施用治疗有效量的PCV2抗原或含PCV2抗原的免疫原性组合物。17.项16的方法，其中与PRDC相关之临床迹象系选自由咳嗽及呼吸困难、生长缓慢、饲料效率降低、昏睡、厌食和/或在肥育中期至后期死亡率显著增加组成的组。18.项17的方法，其中该咳嗽及呼吸困难是难以用抗生素疗法治愈的咳嗽及呼吸困。19.项16至18之一的方法，其中该PRDC与PCV2感染相关。20.项19的方法，其中该PRDC由PCV2造成。21.项20的方法，其中该PRDC进一步与下列病原体的感染相关和/或由下列病原体的感染造成PRRSV、猪肺炎支原体、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、胸膜肺炎放线杆菌、猪鼻支原体、猪链球菌和/或多杀巴斯德氏菌。22.项16至21之一的方法，其中该动物属于PCV2阳性的畜群。23.项16至22之一的方法，其中该动物属于PCV2及一或多种选自下组的其它病原体阳性的畜群PRRSV、猪肺炎支原体、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、猪鼻支原体、猪链球菌和/或多杀巴斯德氏菌。24.项16至23之一的方法，其中该动物属于PCV2阳性的农场。25.项16至24之一的方法，其中该动物属于PCV2及一或多种选自下组的其它病原体阳性的农场PRRSV、猪肺炎支原体、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、猪鼻支原体、猪链球菌和/或多杀巴斯德氏菌。26.项16至25之一的方法，其中该PCV2抗原是与PCV2 0RF-2具有至少80%同源性的多肽。27.项16至26之一的方法，其中该PCV-2抗原是由重组杆状病毒表达的PCV20RF-2。28.项 16 至 27 之一的方法，其中该 PCV2 抗原为ingelvac CircoFLEX 。29.项16至28之一的方法，其中该动物为猪。PRDC之特征在于多种临床迹象，其包括难以用抗生素疗法治愈之长期且异常严重之咳嗽及呼吸困难、生长缓慢、饲料效率降低、昏睡、厌食及在肥育中期至后期死亡率显著增加。这些临床迹象与多种不同病原体有关。迄今未知是否PCV2参与PRDC及(若参与时) PCV2参与PRDC的程度。已意外发现在各种病原体中，PCV2亦在PRDC之临床迹象之表现、严重性及延长中起重要作用。因此在各种病原体中，PCV2是猪PRDC的其中一种病原体。一般而言，一种病原体对如PRDC之多病因疾病(等于多因素疾病)之影响不可预测。病原体可无影响，但亦转移、抑制、替代、覆盖或加强其它病原体对多因素疾病(如PRDC)之临床迹象之表现、严重性及延长的影响。举例而言，若存在至少一种其它病原体，则多因素疾病(如PRDC)之一种病原体之减少或消除可对彼疾病之临床征兆无影响，但亦可显著减少彼疾病之临床症状，即使在任何其它病原体存在下亦如此。所涉及之病原体之数目愈多，则仅一种病原体之减少或消除对疾病之表现持续时间、严重性或延长之正面影响的期望愈低。如今已意外发现藉由用PCV2抗原免疫预防或治疗受威胁或受感染动物可减轻或降低猪之PRDC临床迹象之表现、严重性及延长。详言之，在感染PCV2以及已知造成猪之PRDC或与其相关之病原体(诸如PRRSV、猪肺炎支原体、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、猪鼻支原体和/或多杀巴斯德氏菌)之猪中，PRDC之临床迹象或与其相关之临床迹象之严重性及延长可强烈减轻及降低。换言之，用PCV2抗原来免疫预防及治疗罹患PRDC之猪对猪之整体健康、肥育期间之体重增加及猪肥育中期至晚期之死亡率具有正面影响，尤其因为已知所述因素(整体健康、体重增加、死亡率)受PRRSV、猪肺炎支原体、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、猪鼻支原体和/或多杀巴斯德氏菌负面影响。因此，根据一方面，本发明提供一种免疫预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象之方法，其包含向需要此治疗之动物施用治疗有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤。与PRDC相关之临床迹象选自由咳嗽及呼吸困难、生长缓慢、饲料效率降低、昏睡、厌食和/或在肥育中期至后期死亡率显著增加组成的组。因此根据另一方面，本发明涉及一种免疫预防及治疗动物之咳嗽及呼吸困难、生长缓慢、饲料效率降低、昏睡、厌食和/或与PRDC相关之死亡率显著增加的方法，其包含向需要此治疗之动物施用治疗有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤。优选地，该咳嗽及呼吸困难系难以用抗生素疗法治愈。本文中术语"抗原〃系指引起宿主免疫反应之氨基酸序列。本文中，抗原包括任何PCV2蛋白之全长序列、其类似物或其免疫原性片段。术语"免疫原性片段"系指包括一或多个表位且由此引起宿主免疫反应之蛋白质片段。可使用本领域已知的任何数目之表位定位技术来鉴别所述片段。例如参见 Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology,第 66 卷(Glenn E. Morris 编，1996) Humana Press, Totowa, New Jersey。举例而言，可藉由(例如)同时在固体支撑物上合成大量肽(所述肽对应于蛋白质分子的各个部分)且使所述肽与抗体反应(同时所述肽仍与支撑物连接)来测定线性表位。所述技术为本领域已知且描述于(例如)美国专利第4，708, 871号；Geysen等人(1984)Proc. Natl.Acad. Sci. USA 81:3998-4002 ;Geysen 等人(1986)Molec. Immunol. 23:709-715 中。同样地，构象性表位易于通过用X射线晶体学及2维核磁共振等方法测定氨基酸的空间构形而加以鉴别。例如参见 Epitope Mapping Protocols,同上。合成抗原亦包括于该定义中，例如多表位、侧接表位及其它重组或合成得到之抗原。例如参见 Bergmann 等人(1993)Eur. J. Immunol. 23:2777-2781 ；Bergmann等人(1996)，J.Immunol. 157:3242-3249 ;Suhrbier,A. (1997)，Immunol, and Cell Biol. 75:402-408 ;Gardner 等人，(1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 1998年6月28日-7月3日。〃免疫反应〃意谓(但不限于)在宿主中发生抗目标抗原、免疫原性组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常，〃免疫反应〃包括(但不限于)一或多种以下效应特异性针对目标组合物或疫苗中所包括之一或多种抗原之抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生或活化。优选地,宿主将显示治疗性或保护性免疫学(记忆)反应以使得对新感染之抗性将增强和/或疾病之临床严重性降低。此保护将由PCV2感染之数目或严重性的降低或一或多种与PCV2感染相关之症状之缺乏、病毒血症发作之延迟、病毒持续性降低、总病毒负载量降低和/或病毒性排泄物减少来证实。本文中术语〃免疫原性组合物〃或"疫苗〃(两种术语系同义使用)系指含有PCV2抗原之任何药物组合物，该组合物可用于预防或治疗受检者之PCV2感染相关疾病或病状。优选免疫原性组合物可诱发、刺激或增强针对PCV2之免疫反应。因此该术语涵盖如下所述之亚单位免疫原性组合物，以及含有全灭活或减毒和/或失活PCV2之组合物。因此根据另一方面，本发明涉及一种免疫预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象的方法，其包含向需要此治疗的动物施用有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤，其中该免疫原性组合物为亚单位免疫原性组合物、含有全灭活或减毒和/或失活PCV2之组合物。本文中术语〃亚单位免疫原性组合物〃系指含有至少一种来源于PCV2之抗原或与PCV2之抗原同源的免疫原性多肽或抗原、而非所有抗原的组合物。此组合物大体上不含完整PCV2。因此，〃亚单位免疫原性组合物〃系由来自PCV2或其重组类似物之至少部分纯化或分级分离(优选大体上纯化)之免疫原性多肽制备。亚单位免疫原性组合物可包含大体上不含来自PCV2之其它抗原或多肽或呈分级分离形式的目标亚单位抗原。优选免疫原性亚单位组合物包含如下所述之PCV2 0RF-2蛋白质。最优选者为免疫原性亚单位组合物，其包含WO 06/072065中提供之PCV2抗原中之任一者，该文献系以引用的方式全部并入本文中。根据其它方面，本文所述免疫原性组合物最优选包含由PCV2 0RF-2表达之多肽或其片段。在本文中用于制备组合物且在本文所述方法中的PCV20RF-2DNA及蛋白质为PCV2分离株内高度保守之域，且进而任何PCV20RF-2可有效作为如本文中使用之PCV 0RF-2DNA和/或多肽的来源。优选PCV2 0RF-2蛋白质为WO 06/072065之SEQ ID N0:lliPCV2 0RF-2蛋白质。另一优选PCV 0RF-2多肽系以WO 06/072065之SEQ ID N0:5形式提供。然而，本领域技术人员应了解此序列可在序列同源性方面改变多达6%-10%且仍保持使其适用于免疫原性组合物中之抗原特征。免疫学组合物之抗原特征可(例如)由如由WO 06/072065之实例4提供之激发实验评估。此外，与如WO 06/072065中提供之SEQ ID N0:3或SEQID NO:4之多核苷酸序列编码的PCV2 0RF-2蛋白质相比，当经修饰抗原赋予至少70%、优选80%、更优选90%之保护免疫性时，经修饰抗原之抗原特征仍得以保持。因此根据另一方面，本发明提供一种免疫预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象之方法，其包含向需要此治疗的动物施用有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤，其中该PCV2抗原为抗原PCV20RF-2蛋白质，与如由WO 06/072065中提供之SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4之多核苷酸序列编码的PCV2 0RF-2蛋白质相比，其具有至少70%、优选80%、甚至更优选90%之保护免疫性。该 PCV2 0RF-2 优选具有 WO 06/072065 之 SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 5 之序列。 在一些形式中，PCV2 0RF-2蛋白质之免疫原性部分系用作包含PCV2抗原之免疫原性组合物中的抗原组份。本文中术语〃免疫原性部分〃系指PCV20RF-2蛋白质和/或多核苷酸各自之截短形式和/或经取代形式或片段。优选地，所述截短形式和/或经取代形式或片段应包含全长0RF-2多肽之至少6个连续氨基酸。更优选地，截短形式或经取代形式或片段应具有全长PCV0RF-2多肽之至少10个，更优选至少15个且更优选至少19个连续氨基酸。此方面中之两个优选序列系以WO 06/072065之SEQ ID N0:9及SEQ ID NO: 10形式提供。应进一步了解所述序列可为较大片段或截短形式之部分。如上所述，另一优选PCV2 0RF-2多肽为由SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4之核苷酸序列编码之任一多肽。然而，本领域技术人员应了解此序列可在序列同源性方面改变多达6%-20%且仍保持使其适用于免疫原性组合物中之抗原特征。在一些形式中，此PVC2 0RF-2多肽之截短或经取代形式或片段系用作组合物中之抗原组份。优选地，所述截短或经取代形式或片段应包含(例如)SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4之全长PCV2 0RF-2核苷酸序列之至少18个连续核苷酸。更优选地，所述截短或经取代形式或片段应具有(例如)SEQ IDNO: 3或SEQ ID勵:4之全长？(^2 0RF-2核苷酸序列之至少30个、更优选至少45个且更优选至少57个连续核苷酸。本领域已知的〃序列一致性〃系指两个或两个以上多肽序列或两个或两个以上多核苷酸序列(亦即参考序列与待与参考序列比较之给定序列)之间之关系。如由所述序列之间的匹配所测定，序列一致性系在序列经最优选比对以产生最高序列相似度后，藉由比较给定序列与参考序列而测定。在此比对后，在位置-位置基础上确定序列一致性，例如，若在一特定位置处核苷酸或氨基酸残基一致，则所述序列在彼位置处"一致"。随后将所述位置一致性之总数除以参考序列中核苷酸或残基之总数以得到序列一致性百分比。可易于由已知方法来计算序列一致性，所述方法包括(并不限于)以下文献中描述之方法(Computational Molecular Biology, Lesk, A. N.编，Oxford UniversityPress, New York(1988) ；Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D.ff.编，Academic Press, New York (1993) ；Computer Analysis of Sequence Data,部分 I, Griffin, A. M.及 Griffin, H. G.编，Humana Press, New Jersey (1994) ；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinge, G. , Academic Press (1987) ；SequenceAnalysis Primer, Gribskov, M.及 Devereux, J.编，M. Stockton Press, New York(1991)；R Carillo1H.及 Lipman, D.，SIAM J. Applied Math.，48:1073 (1988)，其教示内容系以引用的方式并入本文中。测定序列一致性之优选方法经设计以得到所测试序列之间的最大匹配。测定序列一致性之方法已在测定给定序列之间的序列一致性之公开可用计算机程序中编码。所述程序之实例包括(但不限于)GCG程序套件(Devereux, J.等人，NucleicAcids Research, 12 (I) : 387 (1984))、BLASTP、BLASTN 及 FASTA (Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol. , 215:403-410 (1990)) BLASTX 程序可公开获自 NCBI 及其它来源(BLASTManual, Altschul, S.等人，NCVINLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol.，215:403-410 (1990)，其教示内容系以引用的方式并入本文中)。所述程序使用预设空隙权重(default gap weight)最优选比对序列以产生给定序列与参考序列之间的最高程度之序列一致性。举例而言，具有与参考核苷酸序列具有至少(例如)85%、优选90%、甚至更优选95%"序列一致性〃之核苷酸序列之多核苷酸意谓除给定多核苷酸序列可在参考核苷酸序列之每各100个核苷酸中包括至多15个、优选至多10个、甚至更优 选至多5个点突变之外，给定多核苷酸之核苷酸序列与参考序列一致。换言之，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85%、优选90%、甚至更优选95%—致性之核苷酸序列之多核苷酸中，参考序列中之至多15%、优选10%、甚至更优选5%之核苷酸可缺失或经另一核苷酸取代，或可将参考序列中全部核苷酸之至多15%、优选10%、甚至更优选5%之多个核苷酸插入参考序列中。参考序列之所述突变可发生在参考核苷酸序列之5'或3'末端位置处或所述末端位置之间的任何地方，个别地散布于参考序列中之核苷酸之间或参考序列内之一或多个连续群中。同样地，具有与参考氨基酸序列具有至少(例如)85%、优选90%、甚至更优选95%序列一致性之给定氨基酸序列之多肽意谓除给定多肽序列可在参考核苷酸序列之每各100个氨基酸中包括至多15、优选至多10、甚至更优选至多5个氨基酸变异之外，多肽之给定氨基酸序列与参考序列一致。换言之，为获得与参考氨基酸序列具有至少85%、优选90%、甚至更优选95%序列一致性之给定多肽序列，参考序列中之至多15%、优选至多10%、甚至更优选至多5%之氨基酸残基可缺失或经另一氨基酸取代，或可将参考序列中氨基酸残基总数之至多15%、优选至多10%、甚至更优选至多5%之多个氨基酸插入参考序列中。参考序列之所述变异可发生于参考氨基酸序列之胺基末端或羧基末端位置处或所述末端位置之间的任何地方，个别地散布于参考序列中之残基之间或参考序列内之一或多个连续群中。优选地，不一致之残基位置系因保守性氨基酸取代而不同。然而，当测定序列一致性时，不包括保守性取代作为匹配。 本文所述〃序列同源性〃系指一种测定两个序列之相关性的方法。为测定序列同源性，最优选比对两个或两个以上序列且必要时引入空隙。然而，与〃序列一致性〃不同，当测定序列同源性时，将保守性氨基酸取代计为匹配。换言之，为获得与参考序列具有95%序列同源性之多肽或多核苷酸，参考序列中之85%、优选90%、甚至更优选95%之氨基酸残基或核苷酸须与另一氨基酸或核苷酸匹配或包含经另一氨基酸或核苷酸之保守性取代，或可将参考序列中全部氨基酸残基或核苷酸(不包括保守性取代)之至多15%、优选至多10%、甚至更优选至多5%之多个氨基酸或核苷酸插入参考序列中。同源序列优选包含至少一段50个，甚至更优选至少100个，甚至更优选至少250个且甚至更优选至少500个核苷酸。
〃保守性取代〃系指一个氨基酸残基或核苷酸经另一个具有类似特征或性质(包括大小、疏水性等)之氨基酸残基或核苷酸取代，以使得整体功能不显著改变。〃分离〃意谓〃藉由人工〃自其天然状态改变，亦即若其存在于自然界中，则其已自原始环境改变或移出，或两者。举例而言，天然存在于活有机体中之多核苷酸或多肽系未经"分离"，当该术语用于本文中时，与天然状态之共存物质分离之相同多核苷酸或多肽系经〃分离〃。因此，根据另一方面，本发明提供一种预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象之方法，其包含向需要此治疗之动物施用有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤，其中该PCV2 0RF-2蛋白质为上述蛋白质中之任一者。该PCV2 0RF-2蛋白质优选为i)包含 WO 06/07065 之 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID N O: 10或SEQ ID NO: 11之序列的多肽；ii)与i)之多肽至少80%同源的任何多肽，iii) i)和/或ii)之多肽之任何免疫原性部分，iv) iii)之免疫原性部分，其包含包括于WO 06/072065之SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10或SEQ ID NO: 11之序列中的至少10个连续氨基酸，V)由包含 WO 06/072065 之 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4 之序列的 DNA 编码之多肽，vi)由与V)之多核苷酸至少80%同源之多核苷酸编码的任何多肽，vii)由V)和/或vi)之多核苷酸编码之多肽的任何免疫原性部分，viii) vii)之免疫原性部分，其中编码该免疫原性部分之多核苷酸包含包括于WO06/072065之SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4之序列中的至少30个连续核苷酸。所述免疫原性部分中之任一者优选具有由WO 06/07065之SEQ ID N0:3或SEQ IDNO:4之序列编码的PCV2 0RF-2蛋白质之免疫原性特征。根据另一方面，PCV2 0RF-2蛋白质系以可有效诱发所需免疫反应(亦即降低PRDC和/或与PRDC相关之任何临床症状之发病率、减轻PRDC和/或与PRDC相关之任何临床症状之严重性或预防或减少PRDC和/或与PRDC相关之任何临床症状)之抗原包涵量提供于免疫原性组合物中。PCV2 0RF-2蛋白质包涵量优选为每毫升最终免疫原性组合物至少O. 2 μ g抗原(μ g/ml)、更优选约O. 2 μ g/ml至约400 μ g/ml、更优选约O. 3 μ g/ml至约200 μ g/ml、甚至更优选约O. 35 μ g/ml至约100 μ g/ml、更优选约O. 4 μ g/ml至约50 μ g/ml、更优选约O. 45 μ g/ml至约30 μ g/ml、更优选约O. 6 μ g/ml至约15 μ g/ml、甚至更优选约O. 75 μ g/ml至约8 μ g/ml、甚至更优选约I. O μ g/ml至约6 μ g/ml、更优选约I. 3 μ g/ml至约3. O μ g/ml、甚至更优选约I. 4 μ g/ml至约2. 5 μ g/ml、甚至更优选约I. 5 μ g/ml至约
2.O μ g/ml 且最优选约 I. 6 μ g/ml。根据另一方面，PCV 0RF-2抗原包涵量为每剂最终抗原组合物至少O. 2微克如上所述之PCV2 0RF-2蛋白质(微克/剂)、更优选约O. 2微克/剂至约400微克/剂、更优选约O. 3微克/剂至约200微克/剂、甚至更优选约O. 35微克/剂至约100微克/剂、更优选约O. 4微克/剂至约50微克/剂、更优选约O. 45微克/剂至约30微克/剂、更优选约O. 6微克/剂至约15微克/剂、甚至更优选约O. 75微克/剂至约8微克/剂、甚至更优选约I. O微克/剂至约6微克/剂、更优选约I. 3微克/剂至约3. O微克/剂、甚至更优选约I. 4微克/剂至约2. 5微克/剂、甚至更优选约I. 5微克/剂至约2. O微克/剂且最优选约I. 6微克/剂。可以包括PCV2 0RF2之分离及纯化、标准蛋白质合成及重组方法之任何方式获得用于本发明之免疫原性组合物中之PCV2 0RF-2多肽。用于获得PCV2 0RF-2多肽之优选方法提供于WO 06/072065中，其教示及内容系以引用的方式全部并入本文中。简言之，用含有PCV2 0RF-2DNA编码序列之重组病毒载体感染易感细胞，由重组病毒表达PCV2 0RF-2多肽且藉由过滤自上清液回收所表达之PCV2 0RF-2多肽且由任何常规方法、优选使用二元氮丙啶使其失活，随后将其中和以终止失活过程。本文所述免疫原性组合物亦系指包含以下各物之组合物i)优选具有上述浓度之上述PCV2 0RF-2蛋白质中之任一者，及ii)表达该PCV2 0RF-2蛋白质之病毒载体、优选重组杆状病毒之至少一部分。此外，免疫原性组合物可包含i)优选具有上述浓度之上述PCV2 0RF-2蛋白质中之任一者，ii)表达该PCV2 0RF-2蛋白质之病毒载体、优选重组杆状 病毒之至少一部分，及iii) 一部分细胞培养物上清液。因此，根据另一方面，本发明提供一种免疫预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象之方法，其包含向需要此治疗的动物施用有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤，其中该PCV2抗原为重组PCV20RF-2、优选为杆状病毒表达之PCV20RF-2。所述重组或杆状病毒表达PCV2 0RF-2优选具有如上所述之序列。本文所述免疫原性组合物亦系指包含以下各物之组合物i)优选具有上述浓度之上述PCV2 0RF-2蛋白质中之任一者，ii)表达该PCV2 0RF-2蛋白质之病毒载体、优选重组杆状病毒之至少一部分，及iii) 一部分细胞培养物；其中约90%之组份具有小于I μ m之大小。本文所述免疫原性组合物亦系指包含以下各物之组合物i)优选具有上述浓度之上述PCV2 0RF-2蛋白质中之任一者，ii)表达该PCV2 0RF-2蛋白质之病毒载体之至少一部分，iii) 一部分细胞培养物，iv)及使重组病毒载体失活之失活剂，优选为BEI，其中约90%之组份i)至组份iii)具有小于Iym之大小。BEI优选以可有效使杆状病毒失活之浓度存在，优选为2mM至约8mMBEI、优选约5mM BEI之量。本文所述免疫原性组合物亦系指包含以下各物之组合物i)优选具有上述浓度之上述PCV2 0RF-2蛋白质中之任一者，ii)表达该PCV2 0RF-2蛋白质之病毒载体之至少一部分，iii) 一部分细胞培养物，iv)使重组病毒载体失活之失活剂，优选为BEI，及V)终止由失活剂所介导之失活之中和剂，其中约90%之组份i)至组份iii)具有小于Iym之大小。优选地，若失活剂为BEI，则该组合物包含与BEI等量之硫代硫酸钠。将多肽并入可施用对PCV2感染敏感之动物之组合物中。在优选形式中，组合物亦可包括本领域技术人员已知之其它组份(亦参见Remington' s PharmaceuticalSciences. (1990)。第18版,Mack Publ.，Easton)。另外，该组合物可包括一或多种兽医学上可接受之载剂。本文中，“兽医学上可接受之载剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂料、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂及其类似载剂。在一优选实施例中，免疫原性组合物包含优选具有上述浓度之如由此提供之PCV20RF-2蛋白质，其系与佐剂(优选Carbopol)及生理盐水混合。本领域技术人员应了解本文中所用之组合物可并有已知可注射、生理学上可接受之无菌溶液。为制备用于非经肠注射或输液之即用溶液，现成可用诸如盐水或相应血浆蛋白质溶液之等渗水溶液。另外，本发明之免疫原性组合物及疫苗组合物可包括稀释剂、等渗齐 、稳定剂或佐剂。稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油及其类似物。等渗剂尤其可包括氯化钠、右旋糖、甘 露糖醇、山梨糖醇及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之碱金属盐。本文所述〃佐剂〃可包括氢氧化铝及磷酸铝；皂素，例如Quil A.QS-21 (CambridgeBiotech Inc., Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc. , Birmingham, AL);油包水乳液；水包油乳液；水/油/水乳液。乳液尤其可基于轻液体石腊油(European Pharmacopea类型)；由烯烃、尤其异丁烯或癸烯之低聚合产生之类异戍二烯油，诸如角鲨烷油或角鲨烯油；含有直链烷基之酸或醇之酯，更特定言之植物油、油酸乙酯、丙二醇二 _(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三_(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇之酯，尤其异硬脂酸酯。该油系与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选为非离子型界面活性剂，尤其视情况经乙氧基化之脱水山梨糖醇酯、二缩甘露醇酯(例如无水甘露糖醇油酸酯)、乙二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯，及油酸酯、异硬脂酸酯、蓖麻油酸酯或羟基硬脂酸酯，及聚氧化丙烯-聚氧化乙烯共聚物嵌段体，尤其泊洛尼克(Pluronic)产品，尤其为 L121。参见 Hunter 等人，The Theory and Practical Application ofAdjuvants (Stewart-Tull, D. E. S.编)· John Wiley and Sons, NY,第 51-94 页(1995)及Todd 等人，Vaccine 15:564-570(1997)。举例而言，有可能使用"VaccineDesign, The Subunit and AdjuvantApproach", M. Powell 及 M. Newman 编，Plenum Press, 1995 之第 147 页所述之 SPT 乳液，及此同一本着作之第183页所述之乳液MF59。佐剂之另一实例为选自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及顺丁烯二酸酐及烯基衍生物之共聚物的化合物。有利佐剂化合物为尤其与糖或多元醇之聚烯基醚交联之丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物。所述化合物称为术语卡波姆(carbomer) (Phameuropa,第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员亦可参看美国专利第2，909，462号，其描述与具有至少3个羟基、优选不超过8个羟基之多羟基化合物交联的所述丙烯酸聚合物，其中至少三个羟基之氢原子经具有至少2个碳原子之不饱和脂族基团置换。优选基团为含有2至4个碳原子之基团，例如乙烯基、烯丙基及其它烯系不饱和基团。所述不饱和基团可自身含有诸如甲基之其它取代基。以名称Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA)销售之产品尤其适合。其与烯丙基鹿糖或烯丙基异戍四醇交联。其中，可提及Carbopol 974P、Carbopol 934P及Carbopol 971P。最优选使用优选每剂约500 μ g至约5mg之量、甚至更优选每剂约750 μ g至约2. 5mg之量且最优选每剂约Img之量的Carbopol,尤其使用Carbopol 971P。其它适合佐剂尤其包括(但不限于)RIBI佐剂系统(Ribi Inc·)、嵌段共聚物(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M(Chiron, Emeryville CA)、单憐酸基脂质 A、安夫利定(Avridine)脂质胺佐剂、来自大肠杆菌(E. coli)之热不稳定肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽。优选添加每剂约100 μ g至约IOmg佐剂。甚至更优选添加每剂约100 μ g至约IOmg佐剂。甚至更优选添加每剂约500 μ g至约5mg佐剂。甚至更优选添加每剂约750 μ g至约
2.5mg佐剂。最优选添加每剂约Img佐剂。另外，组合物可包括一或多种医药上可接受之载剂。本文中，〃医药上可接受之载剂"包括任何及所有溶剂、分散介质、涂料、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂及其类似物。由此提供之组合物最优选含有自活体外培养细胞之上清液回收的PCV2 0RF-2蛋白质，其中所述细胞系经含有PCV2 0RF-2DNA且表达PCV2 0RF-2蛋白质之重组病毒载体感染，且其中该细胞培养物系经约2mM至约8mM BEI、优选约5mM BEI处理以使病毒载体失活，且用相等浓度之中和剂(优选硫代硫酸钠溶液)处理至最终浓度为约2mM至约8mM、优选约5mM。本发明亦涉及免疫原性组合物用于免疫预防或治疗PRDC或减少与PRDC相关之任何临床迹象的用途，该免疫原性组合物包含i)优选具有上述浓度之上述PCV2 0RF-2蛋 白质中之任一者， )表达该PCV2 0RF-2蛋白质之病毒载体之至少一部分，iii) 一部分细胞培养物，iv)使重组病毒载体失活之失活剂，优选为BEI，及V)终止由失活剂所介导之失活之中和剂，优选为与BEI等量之硫代硫酸钠 '及Yi)适当佐剂,优选为上述量之Carbopol971 ;其中约90%之组份i)至组份iii)具有小于Iym之大小。根据另一方面，此免疫原性组合物进一步包含呈生理学上可接受之浓度的医药学上可接受之盐、优选磷酸盐。优选将该免疫原性组合物之PH值调节至生理pH值，意谓介于约6. 5与7. 5之间。本文所述免疫原性组合物亦系指一种组合物，其每一毫升包含i)至少I. 6 μ g上述PCV20 RF-2蛋白质；ii)表达该PCV2 0RF-2蛋白质之杆状病毒之至少一部分；iii) 一部分细胞培养物；iv)约2mM至8mM ΒΕΙ ；v)与BEI等量之硫代硫酸钠 '及γ )约Img Carbopol971 生理学上可接受之浓度之磷酸盐；其中约90%之组份i)至组份iii)具有小于I μ m之大小且将该免疫原性组合物之pH值调节至约6. 5至7. 5。免疫原性组合物可进一步包括一或多种其它免疫调节剂，诸如白细胞介素、干扰素或其它细胞因子。免疫原性组合物亦可包括庆大霉素(Gentamicin)及硫柳汞(Merthiolate)。尽管本领域技术人员可易于确定适用于本发明情况下之佐剂及添加剂之量及浓度，但本发明涵盖包含约50 μ g至约2000 μ g佐剂之组合物且优选每毫升剂量疫苗组合物包含约250 μ g佐剂。因此，本文所述免疫原性组合物亦系指包含约I μ g/ml至约60 μ g/ml抗生素且更优选小于约30 μ g/ml抗生素之组合物。本文所述免疫原性组合物亦系指包含以下各物之组合物i)优选具有上述浓度之上述PCV2 0RF-2蛋白质中之任一者，ii)表达该PCV2 0RF-2蛋白质之病毒载体之至少一部分，iii) 一部分细胞培养物，iv)使重组病毒载体失活之失活剂，优选为BEI，及V)终止由失活剂所介导之失活之中和剂，优选为与BEI等量之硫代硫酸钠；vi)适当佐剂，优选为上述量之Carbopol 971 ；vii)医药学上可接受之浓度之盐水缓冲液，优选为磷酸盐，及viii)抗微生物活性剂；其中约90%之组份i)至组份iii)具有小于I μ m之大小。本文所述免疫原性组合物亦系指丨ilge丨vac_ CircoFLEX (Boehringer IngelheimVetmedica Inc, St Joseph, MO, USA) >CircoVac (Merial SAS, Lyon, France) > PorcilisPCV(Intervet Inc. , Millsboro, DE, USA)或 Suvaxyn PCV_20ne Dose (Fort DodgeAnimal Health, Kansas City，KA，USA)。因此，本发明亦提供一种免疫预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象的方法，其包含向需要此治疗之动物施用治疗有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤，其中该包含 PCV2 抗原之免疫原性组合物为Ingelvac CircoFLEX 、CircoVac 、Porcilis PCV和 / 或 Suvaxyn PCV_20ne Dose ,其优选为Ingelvac CircoFLEX 。如上所述，PCV2已经鉴别为PRDC之一种相关病原体。大多数罹患PRDC之猪对PCV2 呈阳性(例如 Kim 等人，Veterinary Journal (2003) 166:251-256)。用 PCV2 抗原来治疗猪使得PRDC之呼吸道症状减少(参见实施例3)。因此根据另一方面，本发明提供一种免疫预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象的方法，其包含向需要此治疗之动物施用治疗有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤，其中该PRDC或与PRDC相关之所述临床迹象系与PCV2相关或由PCV2造成。此外，本发明亦提供一种免疫预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象的方法，其包含向需要此治疗之动物施用治疗有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤，其中该PRDC或与PRDC相关之所述临床迹象系与PCV2及PRRSV、胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、猪鼻支原体、猪链球菌(Streptococcus suis)和/或多杀巴斯德氏菌相关或由其造成。因为PCV2为PRDC之一种病原体，所以对PCV2呈阳性之畜群比不含PCV2之畜群具有更高的患上PRDC或患上更严重持续时间之具有严重临床症状之PRDC的风险。本文中术语〃对PCV2呈阳性之畜群〃意谓畜群动物之至少1%、优选10%、更优选30%、甚至更优选50%、最优选70%感染有PCV2或在任何时间变为感染有PCV2。此未必意谓该畜群之任何动物均出现已知由PCV2造成之临床症状(诸如PMWS或PRDC)。因此根据另一方面，本发明亦提供一种免疫预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象的方法，其包含向需要此治疗之动物施用治疗有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤，其中该动物属于对PCV2呈阳性之畜群。PRDC和/或与PRDC相关之任何临床迹象优选系由PCV2造成。因为在共感染PRDC之其它致病性病原体之动物中，PRDC及PRDC之临床症状亦可减轻或减少，所以本发明亦提供一种免疫预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象的方法，其包含向需要此治疗之动物施用治疗有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤，其中该动物属于对PCV2及一或多种选自由PRRSV、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、猪鼻支原体、猪链球菌和/或多杀巴斯德氏菌组成的组之其它病原体呈阳性的畜群。PRDC和/或与PRDC相关之任何临床迹象优选系由PCV2及至少一种其它PRDC致病性病原体造成。本文中术语〃对PCV2及一或多种选自由PRRSV、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、猪鼻支原体、猪链球菌和/或多杀巴斯德氏菌组成的组之其它病原体呈阳性的畜群〃意谓畜群动物之至少10%、优选30%、更优选50%、甚至更优选70%感染有PCV2及至少一种下文列出之其它病原体或在任何时间变为感染有PCV2及至少一种下文列出之其它病原体感染。此未必意谓该畜群之任何动物均出现已知由PCV2及至少一种上文列出之病原体造成之临床症状(例如PRDC)。PRDC和/或与PRDC相关之任何临床迹象优选至少由PCV2造成。PRDC并非仅侵袭确定数目之动物，其通常侵袭畜群之所有动物(整个畜群)。换言之，若农场中至少一只动物发生PRDC，则PRDC之病原体持续存在于彼农场之牲畜中。因此根据另一方面，本发明亦提供一种免疫预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象的方法，其包含向需要此治疗之动物施用治疗有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤，其中该动物属于对PCV2呈阳性之畜群。PRDC和/或与PRDC相关之任何临床迹象优选系由PCV2造成。本文中术语〃对PCV2呈阳性之畜群〃意谓畜群动物之至少1%、优选10%、更优选30%、甚至更优选50%、最优选70%感染有PCV2或在任何时间变为感染有PCV2。此未必意谓该农场之任何动物均出现已知由PCV2造成之临床症状(诸如PMWS或PRDC)。PRDC和/或与PRDC相关之任何临床迹象优选系由PCV2造成。因为在共感染PRDC之其它致病性病原体之动物中，PRDC及PRDC之临床症状亦可减轻或减少，所以本发明亦提供一种免疫预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象的方法，其包含向需要此治疗之动物施用治疗有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤，其中该动物属于对PCV2及一或多种 选自由PRRSV、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血性博德特氏菌、猿流感病毒、猪鼻支原体、猪链球菌和/或多杀巴斯德氏菌组成的组之其它病原体呈阳性的农场。PRDC和/或与PRDC相关之任何临床迹象优选系由PCV2及至少一种其它PRDC致病性病原体造成。本文中术语〃对PCV2及一或多种选自由PRRSV、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、猪鼻支原体、猪链球菌和/或多杀巴斯德氏菌组成的组之其它病原体呈阳性的畜群〃意谓畜群动物之至少10%、优选30%、更优选50%、甚至更优选70%感染有PCV2及至少一种下文列出之其它病原体或在任何时间变为感染有PCV2及至少一种下文列出之其它病原体。此未必意谓该畜群之任何动物均出现已知由PCV2及至少一种上文列出之病原体造成之临床症状(例如PRDC)。母源免疫性已显示可赋予一定程度的对抗PCV2感染及与PCV2感染相关之临床疾病之保护。此保护已显示为效价依赖性较高效价通常具保护性，而较低效价不具保护性(McKeown 等人，2005; Clin. Diagn. Lab. Immunol. ; 12:1347-1351)。断乳动物之平均抗体半衰期已估算为19. O天,在群体内PCV2被动抗体衰减窗相对较宽(Opriessnig等人，2004, J. Swine Health Prod. 12:186-191)。母源抗体之存在不仅可赋予一定程度的对抗病毒感染之保护(然而其不可预测)，而且已知亦可能削弱免疫作用之功效。已惊奇地发现抗PCV2抗体(尤其多至1:20480之抗PCV2抗体效价)之存在不影响PCV2治疗之功效。因此，根据另一方面，本发明亦提供一种预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象的方法，其包含向具有抗PCV2抗体之需要此治疗之动物施用治疗有效量的PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤，优选其中该动物具有达1:100、优选大于1:100、甚至更优选大于1:250、甚至更优选大于1:500、甚至更优选1:640、甚至更优选大于1:750、最优选大于1:1000之可检测抗PCV2抗体效价。优选地，该抗PCV2抗体效价在特异性抗PCV2免疫检定中、优选在如实施例2中所述之检定中可检测且可定量。检测及定量抗PCV2抗体之方法为本领域已知。举例而言，PCV2抗体之检测及定量可由 Magar 等人，2000, Can. J. Vet Res. ; 64:184-186 或 Magar 等人，2000, J. Comp.Pathol. ; 123:258-269中所述之间接免疫荧光法进行。定量抗PCV2抗体之其它检定描述于Opriessnig等人,2006，美国猪兽医协会第37届年会(371* Annual Meeting of theAmerican Association of Swine Veterinarians)中。此外，实施例 2 亦描述一种本领域技术人员可使用之间接免疫荧光检定。在结果有争议及有任何疑问之情况下，本文所提及之抗PCV2效价系指由/可由实施例2中所述之检定估算出之抗PCV2效价。根据另一更通用方面，本发明提供一种免疫预防年幼动物中优选与PCV2相关或由PCV2造成之PRDC，或减少由PRDC造成或与PRDC相关之临床症状的方法，其包含向需要此治疗之彼年幼动物施用有效量之PCV2抗原的步骤。本文中术语〃年幼动物〃系指I至22天龄之动物。术语年幼动物优选意谓I至20天龄之动物。术语年幼动物更优选系指I至15天龄、甚至更优选I天龄至14天龄、甚至更优选I至12天龄、甚至更优选I至10天龄、甚至更优选I至8天龄、甚至更优选I至7天龄、甚至更优选I至6天龄、甚至更优选I至5天龄、甚至更优选I至4天龄、甚至更优选I至3天龄、甚至更优选I或2天龄之动物，最优选系指I天龄之动物。因此根据另一方面，本发明提供一种免疫预防年幼动物中优选与PCV2相关或由PCV2造成之PRDC，或减少由 PRDC造成或与PRDC相关之临床症状的方法，其包含向需要此治疗之I至22天龄、优选I至20天龄、更优选I至15天龄、甚至更优选I至14天龄、甚至更优选I至12天龄、甚至更优选I至10天龄、甚至更优选I至8天龄、甚至更优选I至7天龄、甚至更优选I至6天龄、甚至更优选I至5天龄、甚至更优选I至4天龄、甚至更优选I至3天龄、甚至更优选I或2天龄、最优选I天龄之动物施用有效量之PCV2抗原的步骤。举例而言，有证据证明在19至22天龄时进行疫苗接种/治疗展示高疫苗接种功效。此外，在12至18天龄时进行疫苗接种/治疗亦已展示可极有效减少与PRDC相关或由PRDC造成之临床症状、降低总病毒负载量、缩减病毒血症之持续时间、延迟病毒血症之发作、体重增加。由于PCV2在野外普遍存在，所以大多数年幼仔猪关于PCV2呈血清阳性。因此根据另一方面，本发明提供一种优选在疫苗接种当天免疫预防具有抗PCV2抗体之年幼动物中优选与PCV2相关或由PCV2造成之PRDC，或减少由PRDC造成或与PRDC相关之临床症状的方法，其包含向需要此治疗之I至22天龄、优选I至20天龄、更优选I至15天龄、甚至更优选I至14天龄、甚至更优选I至12天龄、甚至更优选I至10天龄、甚至更优选I至8天龄、甚至更优选I至7天龄、甚至更优选I至6天龄、甚至更优选I至5天龄、甚至更优选I至4天龄、甚至更优选I至3天龄、甚至更优选I或2天龄、最优选I天龄之动物施用有效量之PCV2抗原的步骤。在疫苗接种/治疗当天，所述年幼动物优选具有在疫苗接种/治疗当天高达1:100、优选大于1:100、甚至更优选大于1:250、甚至更优选大于1:500、甚至更优选1:640、甚至更优选大于1:750、最优选大于I : 1000之可检测抗PCV2抗体效价。如上所述，用PCV2抗原对罹患PRDC之动物进行疫苗接种/治疗使得与未经疫苗接种之对照动物相比病毒血症阶段缩短。与相同物种之未经疫苗接种之对照动物相比，平均缩短时间为15. 4天。因此，根据另一方面，本发明亦提供一种治疗或免疫预防动物中优选与PCV2相关或由PCV2造成之PRDC，或减少由PRDC造成或与PRDC相关之临床症状的方法，其包含向需要此治疗的动物施用有效量之PCV2抗原的步骤，其中与相同物种之未经治疗对照组之动物相比，治疗或免疫预防使得病毒血症阶段缩短5天或5天以上、优选6天或6天以上、甚至更优选7天或7天以上、甚至更优选8天或8天以上、甚至更优选9天、甚至更优选10天、甚至更优选12天、甚至更优选14天、最优选多于15天。
一般而言，对罹患PRDC之猪进行疫苗接种使得体重增加损失减小、临床呼吸道征象(诸如咳嗽及呼吸困难)减少、病毒血症持续时间较短、病毒血症较早结束及病毒负载量较低。因此，根据另一方面，本发明提供一种治疗或免疫预防动物中优选与PCV2相关或由PCV2造成之PRDC，或减少与PRDC相关或由PRDC造成之临床症状的方法，其包含向需要此治疗之动物施用有效量之PCV2抗原的步骤，其中该治疗或免疫预防使得与相同物种之未经治疗对照组之动物相比疫苗功效参数得以改良，所述疫苗功效参数系选自由体重增加损失减小、临床呼吸道征象(诸如咳嗽及呼吸困难)减少、病毒血症持续时间较短、病毒血症较早结束、较低病毒负载量或其组合组成的组。本文中术语〃有效量〃意谓(但不限于)在该有效剂量之PCV2抗原所施用之动物中引起或能够引起免疫反应的抗原量。有效量视疫苗成份及投药时程而定。通常，当在组合疫苗中使用失活病毒或经修饰活病毒制剂时，疫苗含有每剂约102_°至约109_° TCID5tl、优选每剂约103_°至约108_°TCID5Q、更优选每剂约IO4 ci至约108_ tlTCID5tl之量。详言之，当在疫苗中使用经修饰活PCV2时，待施用易感动物之推荐剂量优选为每剂约103_tlTCID5tl (组织培养物感染剂量50%终点)至每剂 约IO6 qTCID5q且更优选为每剂约IO4 qTCID5q至每剂约105_°TCID5(I。一般而言，当使用经纯化抗原时，抗原之量将介于O. 2微克与5000微克之间，且介于102_°与IO9 tlTCID5ci之间、优选介于IO3 0与IO6 ciTCID5tl之间、更优选介于IO4 0与IO5 ciTCID5tl之间。亚单位疫苗通常系以每剂至少O. 2 μ g抗原、优选每剂约O. 2 μ g至约400 μ g、更优选每剂约O. 3 μ g至约200 μ g、甚至更优选每剂约O. 35 μ g至约100 μ g、更优选每剂约
0.4 μ g至约50 μ g、更优选每剂约O. 45 μ g至约30 μ g、更优选每剂约O. 6 μ g至约16 μ g、甚至更优选每剂约O. 75 μ g至约8 μ g、甚至更优选每剂约l.Oyg至约6 μ g、更优选每剂约
1.3 μ g至约3. O μ g之抗原含量施用。出人意料地发现前述免疫原性组合物之免疫预防用途可有效减少动物中优选至少由PCV2造成之PRDC造成或与其相关的临床症状。此外，本文中所述之抗原组合物降低总圆环病毒负载量，其包括较迟发作、较短持续时间、病毒血症较早结束及病毒负载量降低及其在罹患PRDC之动物中之免疫抑制性影响，且进而产生较高程度之一般疾病抵抗性及降低之PRDC发病率。根据本发明之组合物可经皮内、气管内或阴道内施用。该组合物优选可经肌肉内或鼻内施用，最优选经肌肉内施用。在动物体内，可证实经由静脉内或藉由直接注射入靶组织中来施用上述药物组合物为有利的。就全身性施用而言，静脉内、血管内、肌肉内、鼻内、动脉内、腹膜内、经口或鞘内途径优选。可经皮下、皮内、皮肤内、心脏内、小叶内、骨髓内、肺内或直接在待处理组织(结缔组织、骨组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织)中或其附近实现更局部施用。视治疗之所需持续时间及有效性而定，可例如在每日基础上一次或若干次(亦间歇地)历时若干天、数周或数月且以不同剂量来施用根据本发明之组合物。优选地，至少一个剂量之如上所述之免疫原性组合物系经肌肉内施用有需要之受检者。根据另一方面，如本文中所述之PCV2抗原或包含任何此PCV2抗原之免疫原性组合物系装入瓶中且以每剂一(l)mL之量施用。因此，根据另一方面，本发明亦提供一种包含如本文中所述之PCV-2抗原的Iml免疫原性组合物，其系用于治疗或免疫预防动物中优选由PCV2造成之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与其相关的任何临床迹象，其包含向需要此治疗的动物施用有效量之PCV2抗原的步骤。根据另一方面，向有需要之受检者给予至少一个剂量之如上所述之免疫原性组合物的至少一次进一步投药，其中该第二或任何进一步投药系在初始或任何先前投药后给予至少14天。免疫原性组合物优选与免疫刺激物一起施用。该免疫刺激物优选给予至少两次。优选地，在免疫刺激物之第一次投药与第二次或任何进一步投药之间为至少3天、更优选至少5天、甚至更优选至少7天。优选地，在初始施用本文中提供之免疫原性组合物后给予免疫刺激物至少10天、优选15天、甚至更优选20天、甚至更优选至少22天。优选免疫刺激物为(例如)优选用不完全佛氏佐剂(Freund' s adjuvant) (KLH/ICFA)乳化之匙孔螺血氰蛋白(keyhole limpet hemocyanin ;KLH)。然而，由此应了解亦可使用本领域技术人员已知之任何其它免疫刺激物。本文中术语"免疫刺激物"意谓优选在未起始或增强特异性免疫反应(例如对抗特定病原体之免疫反应)之情况下，可触发免疫反应之任何药剂或组合物。进一步指示施用适合剂量之免疫刺激物。本发明亦涉及PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物用于制备药物的用途，其中该药物系用于免疫预防及治疗动物之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC 相关之任何临床迹象。PRDC或与PRDC相关之临床迹象优选系至少由PCV2、更优选以及一或多种其它病原体造成，所述病原体系选自由PRRSV、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血性博德特氏菌、猿(Simian)流感病毒、猪鼻支原体、猪链球菌和/或多杀巴斯德氏菌组成的组。更优选地，PCV2抗原为重组抗原、优选PCV20RF-2、甚至更优选Ingelvac' CircoFLEX 。本文所述〃动物〃意谓猪类(swine)、猪(pig)或仔猪(piglet)。因此，根据另一方面，本发明提供一种免疫预防及治疗猪之猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或与PRDC相关之任何临床迹象的方法，其包含向需要此治疗之猪施用治疗有效量之PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物的步骤。优选地，PRDC系至少由PCV2、优选以及至少一种已知造成PRDC之其它病原体(例如PRRSV、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、猪鼻支原体、猪链球菌和/或多杀巴斯德氏菌)造成。PCV2抗原或包含PCV2抗原之免疫原性组合物优选为前述任一者，PCV2抗原最优选为Ingeivac CircoFLEX 。优选实施方式详述以下实施例描述了本发明优选的材料和方法。尽管在实施或测试本发明时可使用与本文所述类似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选的方法、装置、以及材料。但应理解，这些实施例仅仅是举例说明，不应被视为对本发明总体范围的任何限制。实施例I制备PCV2 0RF-2 抗原将初始SF+细胞培养物从液氮储存器中取出，在无菌旋转烧瓶中的Excell 420培养基(JRH Biosciences, Inc. , Lenexa, KS)中悬浮培养，持续搅拌。使所述培养物在100-250mL旋转烧瓶中含有25-150毫升Excell 420的无血清培养基中生长。当细胞增殖至细胞密度为I. 0-8. O X IO6细胞/ml时，将其以O. 5-1. 5 X IO6细胞/ml的种植密度分至新容器中。随后使经过扩大培养的培养物在至多36升旋转烧瓶中或在至多300升不锈钢生物反应器中于25-29°C生长2-7天时间。
接种后，将烧瓶在27°C培育4小时。随后，用含有PCV2 0RF-2基因(SEQ IDNO:4)的重组杆状病毒对每个烧瓶进行接种。含有PCV2 0RF-2基因的重组杆状病毒按WO06/072065所述制备。在接种杆状病毒后，将所述烧瓶在27±2°C培育7天，期间以IOOrpm搅拌。所述烧瓶使用通风盖以容许空气流动。培育后，收获所得上清液，将其过滤以移除细胞碎片并灭活。上清液通过将温度升至37±2°C而灭活,添加二元氮丙唳(binary ethlylenimine, ΒΕΙ)至终浓度为5mM。随后将样品持续搅拌72-96小时。添加I. OM硫代硫酸钠溶液，使最终最小浓度为5mM，以中和任何残余BEI。在灭活后，添加约O. 5-2. 5毫克/剂的、经磷酸盐缓冲液及Carpopol缓冲的PCV2 0RF-2。最终每一剂包含约16微克PCV2 0RF-2抗原。实施例2抗PCV-2免疫分析·
将WO 02/07721 所述 PK15 (例如 ATCC CCL-33)或 VIDO Rl 细胞接种至 96 孔板(约20. 000-60. 000个细胞/孔)。当单层约65%至85%铺满时，将细胞用PCV2分离物感染。将经感染的细胞培育48小时。移除培养基，用PBS将孔洗涤两次。弃去洗涤缓冲剂，将细胞在约_20°C用冷50/50甲醇/丙酮固定剂(约100微升/孔)处理约15分钟。弃去固定剂，所述板在空气中干燥。在PBS中制备猪血清样品的系列稀释液，添加至所述板中，36. 5±1°C培育约I小时，若血清样品中有抗体则能够发生结合。抗PCV2的阳性及阴性对照样品(阳性对照及阴性对照样品)的系列稀释液并行进行。随后将所述板用PBS洗涤三次。弃去PBS。随后将所述板用在PBS中以1:100稀释的市售山羊抗猪FITC偶联物染色，36. 5±1°C培育约I小时，这样能够检测出与感染细胞结合的抗体。在培育完成后，自培育箱中移出微滴板，弃去偶联物，用PBS将所述板洗两次。通过UV显微镜检读板，将各孔读为阳性或阴性。用阳性对照及阴性对照样品监测该测试系统。若对照在预期范围内，则测试方法所用参数导致的结果是可接受的。用显示特异性IFA反应性的最高稀释度计算血清抗体效价，用适合的Reed-Muench公式计算每一稀释度的阳性孔数或50%终点。实施例3PCV2 0RF-2 (Ingelvac CircoFLEXn)在 PRDC 治疗中的功效目的此研究旨在证实Ingelvac' CircoFLEX控制PCV2相关PRDC的功效。研究的实施此研究中包括1542只普通猪(conventional pig),它们属于三个连续周组(weekgroup)，每组有约500只猪。将这些猪按照体重、以及是否一窝所生区分开，随机分配至一个疫苗接种组(n=769)及一个对照组(n=773)。-组I:在研究当天(第O天)，对约20日龄的猪进行单次肌肉接种，所接种的是，作为活性物质的含有PCV2 0RF-2蛋白(RP为I (每剂Iml))的Ingelvac CircoFLEX，及作为佐剂的Carbopol -组2:对照组接受Iml对照物品，其包含无PCV2 0RF-2蛋白的细胞培养物上清液及作为佐剂的Carbopol ,-组3:未经治疗的猪。在肥育结束时(研究第22周)终止研究。
所记录的参数参数记录如下-个体体重(所有动物)-“僵猪(runt) ”率(所有动物)-临床迹象(所有动物)-死亡率(所有动物)-血清中之PCV2病毒血症病毒血症之发作、结束、持续时间，病毒负载量(17%的研究动物)
-尸检(若可能，每一只死亡或安乐死动物)农场之发病情况根据饲养及肥育农场的发病史，动物自肥育中期开始经历与猪呼吸道疾病综合征(PRDC)相关之呼吸道症状。这些症状伴有肥育期间的体重增加程度降低(ADWG 750-780g)及死亡率增加(5. 5-6. 6%)。此时被认为涉及PRDC的病原体为PCV2、PRRSV、多杀巴斯德氏菌、支气管败血性博德特氏菌，有时还涉及SIV。此研究中还发现，猪肺炎支原体及猪鼻支原体与此疾病综合征有关。有趣的是，此研究的结果表明，PRRSV和猪肺炎支原体的感染(infection)在PCV2病毒血症发作的约4_6周前出现。然而，根据整个研究期间动物死亡数、以及PCV2病毒血症发作前后呼吸道症状的频率来看，这些动物一直未受这两种感染性病原体影响(rather unaffected)。结果体重、体重增加、平均每日体重增加(ADWG)在研究启始时两个处理组之体重相当。在研究第17周及第22周，疫苗接种组之体重显著高于安慰剂处理组之体重(分别为P=O. 0007及p〈0. 0001)。自研究启始至研究第22周，疫苗接种组动物比安慰剂处理组动物多增重2. 8kg。此对应于，从研究启始至研究第17周时疫苗接种组动物的ADWG高13g/d，至研究第22周时疫苗接种组动物的ADWG高18g/d。对于整个肥育期(研究第7-22周)而言，ADffG因此可从安慰剂处理组动物的777g/d(相当于过去的750-780g/d ADffG)增加至疫苗接种组动物的803g/d(表I及图I)。表I :体重、体重增加及ADWG之比较(所有三个周组之汇集数据)
权利要求
1.PCV2抗原或含PCV2抗原的免疫原性组合物的制药用途，所述药物是用于预防动物的猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和/或任何与PRDC相关的临床迹象及治疗动物的与PRDC相关的临床迹象的药物，其中与PRDC相关的临床迹象选自由咳嗽及呼吸困难、生长缓慢、饲料效率降低、昏睡、厌食、病毒血症和/或病毒负载组成的组。
2.权利要求I的用途，所述药物以治疗有效量施用需要此治疗之动物。
3.权利要求I或2的用途，其中与PRDC相关的临床迹象选自由咳嗽及呼吸困难、生长缓慢、饲料效率降低、昏睡、厌食和/或在肥育中期至后期死亡率显著增加组成的组。
4.权利要求3的用途,其中该咳嗽及呼吸困难是难以用抗生素疗法治愈的咳嗽及呼吸困难。
5.权利要求1-4之一的用途，其中该PRDC与PCV2感染相关。
6.权利要求5的用途，其中该PRDC由PCV2造成。
7.权利要求6的用途，其中该PRDC进一步与下列病原体的感染相关和/或由下列病原体的感染造成PRRSV、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、猪流感病毒(Swine influenza virus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)、猪链球菌(Streptococcus suis)和 / 或多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)。
8.权利要求1-7之一的用途，其中该动物属于PCV2阳性的畜群。
9.权利要求1-8之一的用途，其中该动物属于PCV2及一或多种选自下组的其它病原体阳性的畜群PRRSV、猪肺炎支原体、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、猪鼻支原体、猪链球菌和/或多杀巴斯德氏菌。
10.权利要求1-9之一的用途，其中该动物属于PCV2阳性农场的动物。
11.权利要求1-10之一的用途，其中该动物属于PCV2及一或多种选自下组的其它病原体阳性的农场PRRSV、猪肺炎支原体、支气管败血性博德特氏菌、猪流感病毒、猪鼻支原体、猪链球菌和/或多杀巴斯德氏菌。
12.权利要求1-11之一的用途，其中该PCV2抗原是与PCV2的0RF-2具有至少80%同源性的多肽。
13.权利要求1-12之一的用途，其中该PCV-2抗原是由重组杆状病毒表达的PCV20RF-2。
14.权利要求1-13之一的用途，其中该PCV2抗原为Ingelvac CircoFLEX 。
15.权利要求1-14之一的用途，其中该动物为猪。
全文摘要
本发明涉及治疗猪呼吸道疾病综合征。本发明涉及包含猪2型圆环病毒(PCV2)抗原的免疫原性组合物用于预防及治疗动物、尤其猪的猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的用途。
文档编号A61K39/12GK102872457SQ201210377480
公开日2013年1月16日 申请日期2008年1月2日 优先权日2007年1月3日
发明者维基.法钦格, 克努特.埃尔伯斯, 玛丽昂.基克斯莫勒, 弗朗索瓦-泽维尔.奥维伦, 伊莎贝尔.弗赖因冯里奇索芬, 阿克塞尔.利谢夫斯基 申请人:贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司