专利名称：促血管生成素1基因修饰的间充质干细胞、及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞、及其构建方法与应用。
背景技术：
急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是临床常见的高发病率、高病死率的疾患，目前全球发病率在8-20人/10万人/年。骨髓源性间充质干细胞在肺损伤和炎症修复中发挥重要作用，是肺损伤修复的重要潜在途径。但是间充质干细胞修复肺损伤的研究揭示一些问题，如外源性干细胞到达肺部的细胞数稀少、修复水平低，无法达到预期的效果。有研究者采用突光蛋白示踪间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的研究指出，除去自发荧光、死亡细胞和受污染的血细胞后，甚至检测不到骨髓干细胞在肺内对上 皮细胞的有效重建与修复。由此可见，增加MSCs在肺内的驻留及有效修复可能是提高干预效率的关键。前期研究证实促血管生成素I (angiopoietin I,Angl)在肺损伤及许多疾病中起重要作用。Angl通过激活血管内皮细胞上酪氨酸激酶型受体Tie2 (tyrosine kinase withIg and EGF homology domains)受体发挥强大作用。多项研究证实Angl稳定内皮细胞的特异性结构一细胞间粘附连接复合体(adherens junction complexes,AJCs),抑制炎症因子所致的内皮细胞渗透性增加、减少中性粒细胞粘附于内皮细胞、降低IL-8的分泌，减轻炎症反应及肺损伤。但如何将Angl回输肺内并使其发挥生物活性，目前并无较好的方法。研究表明Tie2受体表达在血管内皮上，且以肺内血管的Tie2表达最为丰富。通过Angl-Tie2间的受体配体结合力(范德华力)，Angl可最大限度地在肺内庞大的血管网内驻留。综上所述，本领域有必要进一步开发一种方法，使Angl在MSCs上过表达，从而修饰过的MSCs在经过肺血管网时，高效滞留在肺部，并在此微环境中通过细胞及体液方式修复肺损伤。
发明内容
本发明的目的是提供一种促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞。本发明所提供的促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞，是携带有促血管生成素I基因的间充质干细胞。所述促血管生成素I基因来源于pCR2. I-Angl质粒，所述间充质干细胞来源于哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔子、羊、狗、猪、猴或人等。本发明的第二个目的是提供一种构建上述促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞的方法。本发明所提供的上述促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞的构建方法，可以包括以下步骤
1)将促血管生成素I基因导入慢病毒包装系统中的目的基因转移载体中，得到携带有促血管生成素I基因的重组慢病毒载体；
2)将携带有促血管生成素I基因的重组慢病毒载体与慢病毒包装系统中的包装质粒和包膜质粒按16-24:5. 7-11. 7:5. 5-10. 5的重量份数比混合，转染慢病毒包装细胞，得到携带有促血管生成素I基因的重组慢病毒；
3)将携带有促血管生成素I基因的重组慢病毒转染间充质干细胞，得到过表达促血管生成素I的促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞。在上述步骤中，所述步骤I中优选地，所述促血管生成素I基因来源于pCR2. I-Angl质粒；获得Angl基因的方法可以为从pCR2. I-Angl质粒中调取Angl基因，在克隆引物的引导下PCR扩增Angl基因，然后使用重组酶将PCR产物与经BamHI内切酶酶切后的Age I酶切载体连接，对重组后的Age I酶切载体进行酶切鉴定，琼脂糖电泳检测和 基因测序，检测PCR扩增是否获得了序列正确的Angl基因。在上述步骤中，所述步骤I中优选地，间充质干细胞来源于哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔子、羊、狗、猪、猴或人等。慢病毒包装系统中的目的基因转移载体优选为PLV质粒，pLV质粒可以表达绿色荧光蛋白(GFP)，pLV质粒中含有Ubiqutin启动子，能够在宿主细胞中持续表达GFP。所述步骤2中，包装质粒可以为pCMV-dR8. 74质粒，pCMV_dR8. 74质粒中含有HIV病毒的编码病毒主要的结构蛋白的gag基因，编码病毒特异性的酶的pol基因，和编码调节gag和pol基因表达的调节因子rev基因；包膜质粒可以为pMD2G，pMD2G质粒中含有单纯疱疹病毒来源的VSVg基因，提供病毒包装所需要的衣壳蛋白；慢病毒包装细胞可以为293T细胞。携带有促血管生成素I基因的重组慢病毒载体与慢病毒载体体系中的包装质粒和包膜质粒混合后，可以通过磷酸钙法EAE-葡聚糖法或人工脂质体法等方法转染慢病毒包装细胞，得到携带有促血管生成素I基因的重组慢病毒。本发明的另一个目的是提供促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞在制备修复肺损伤药物或材料中的应用。本发明提供了一种促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞。可利用慢病毒包装系统将促血管生成素I基因导入间充质干细胞，从而得到本发明过表达促血管生成素I的促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞。实验证明，本发明的促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞经静脉回输后，促血管生成素I能在肺组织内过表达，明显改善肺部病理损伤、炎症反应与肺水肿，效果明显且持久。本发明促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞及其构建方法将为肺损伤的修复提供适宜的微环境，应用前景广阔。下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的介绍和描述，以更好的理解本发明，在下文中促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞简称为MSCs-Angl。
图I为重组Age I酶切载体基因测序结果；
图2为包装病毒的病毒滴定的检测结果，EGFP为荧光显微镜检测绿色荧光结果，DIC为光镜检测结果；
图3为小鼠MSCs经标准流程诱导多向分化鉴定结果a为分化前，b为成骨分化，c为成脂分化，d为成软骨分化；
图4为转染指数M0I=20，转染第5天时，倒置荧光显微镜下MSCs-Angl表达的GFP荧光强度鉴定结果a为光镜图片，b为荧光倒置显微镜图片，c为a和b的重叠 图5为MSCs-Angl表达的Angl蛋白SDS-PAGE电泳检测结果，其中，条带(Iane)I转染前，条带2为转染3天后，条带3为转染5天后；
图6为MSCs-Angl特异性表型的流式细胞术检测结果；
图7为MSCs-Angl静脉回输后Angl在肺组织内过表达检测结果,其中，a为Angl蛋白电泳检测图，b为检测结果曲线图；· 图8为MSCs-Angl静脉回输后GFP在肺组织受损处表达检测结果；
图9为光学显微镜下肺部病理，MSCs-Angl静脉回输明显改善内毒素所致的肺损伤；
图10为MSCs-Angl静脉回输后肺泡灌洗液中蛋白含量、中性粒细胞数量和肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性检测结果。
具体实施例方式一、构建促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞 I)表达Angl基因的慢病毒载体质粒的构建
I.I.提取Angl基因 克隆引物为
ANGIF - CTTTTTTGTTAGACAGGATCCGAGTGTGCTGGCAGTACAATGAC AGTTTTCCANGIR — CTCACCATGGTGGCGACCGGTggAAAATCTAAAGGTCGAATCAT CANGl-seq TCGTCGTGTCGTGACGTC + ANGIR
从pCR2. I-Angl质粒中调取Angl基因，在克隆引物的引导下PCR扩增Angl基因，对PCR扩增产物进行琼脂糖电泳检测，结果获得大小为1556bp的DNA片段，与预期结果相符。回收并纯化该PCR产物，然后使用重组酶将PCR产物与经BamHI内切酶酶切后的Age I酶切载体连接，对重组后的Age I酶切载体进行酶切鉴定，对酶切产物进行琼脂糖电泳检测，与预期结果相符，再对重组Age I酶切载体使用ANGl-seq测序，测序结果如图I所示，测序结果表明PCR扩增获得了序列正确的Angl基因。I. 2.载体质粒的构建
将重组后的Age I酶切载体酶切，回收并纯化获得的1556bp的DNA片段，将其连入经同样酶酶切的慢病毒包装系统中的目的基因转移载体PLV质粒中。2)慢病毒包装
取细胞密度为O. 5 X IO6细胞/ml对数生长期的293T细胞，接种25ml细胞于25ml的细胞培养皿，在37 °C、5% C02培养箱内培养，待细胞密度达60 %_70 %时即可用于转染。上一步骤中构建的携带有Angl基因的慢病毒载体pLV质粒和包装质粒pCMV-dR8. 74及包膜质粒pMD2分别溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在I. 8 2. O之间，DNA浓度在500 ng/μ I以上。向一灭菌离心管中加入所制备的各质粒溶液(pLVT 20 μ g, pCMV-dR 8.7415 μ g，pMD2G 7. 5 μ g)，无菌水定容至1800 μ I,再加入200 μ I CaCl2 (2. 5mol/L)溶液，轻轻混匀；逐滴缓慢加入2000 μ I PBS缓冲盐溶液，轻弹管壁混匀，室温放置20 30 min,温育结束时,用小吸尖轻轻吹打一次，重悬混合液。将DNA-磷酸钙混合液转移至含293T细胞的培养液中，混匀，于37°C培养箱中培养。倒去含有转染混和物的培养基，再加入15ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。重复该步骤3次。加入含10 %血清的细胞培养基15ml继续培养48小时。收集转染后72小时的293T细胞上清液。于4 °C,4000 rpm离心10 min，除去细胞碎片。用0.45 μ m滤器过滤上清液于40ml超速离心管中，25000 rpm(Beckman V70ti)，4 °C，离心90min。以冰的PBS液重旋病毒沉淀，于4 °C溶解过夜。以10 μ I/管分装病毒液置于一 70 °C低温冰箱中保存。对在293T细胞中制备病毒颗粒进行病毒滴度测定，结果如图2所示，病毒包装完成。对在293T细胞中制备病毒颗粒进行克隆鉴定，克隆鉴定为包含完整Angl序列并表达所含不踪基因的GFP蛋白。3)小鼠间充质细胞的转染
分离纯化小鼠MSCs，并分析MSCs细胞表型及诱导多向分化(成骨、成软骨和成脂分 化)，鉴定MSCs，鉴定结果如图I所示，小鼠间充质干细胞具有多向分化潜能。MSCs经培养传代至第四代后，将细胞接种于12孔培养板，在37 1、5%0)2培养箱内培养，使细胞密度大致在70%左右，按MOI值=20接种相应体积的上述包装好的病毒液于细胞中，继续培养箱内培养，并密切监测转染效率。每8小时采用倒置荧光显微镜观察GFP荧光强度。结果提示本系统转染时间较慢但稳定，在转染第5天，细胞荧光强度和细胞Angl的表达均达到高峰，转染效率达到90%以上，如图4和图5所示。经上述基因工程和组织工程技术处理后，构建过表达Angl的MSCs细胞，在常规细胞培养条件下可以增殖并传代。收集转染前后的MSCs细胞，经处理后，通过流式细胞仪鉴定其干细胞特异性表型⑶44、⑶73、⑶105、Sca-I、⑶45、⑶31、⑶I lb、⑶14等，结果表明转染前后细胞表型无明显差异，如图6所示，Angl基因修饰对MSCs细胞的表型无明显影响。促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞构建成功，可用于体外和体内研究。二、促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞修复肺损伤
经静脉回输Angl修饰的MSCs (MSCs-Angl)后,细胞经体循环进入肺组织,到达肺损伤部位，发挥干细胞治疗和基因治疗的多重作用。MSCs-Angl预期进入肺循环，充分利用血液循环和肺血管特点，在肺循环庞大的毛细血管网的阻留及Angl-Tie2间的结合力作用下，最大限度地滞留于肺部，提高MSCs-Angl在肺部特定微环境中定向分化为肺组织细胞的概率；同时针对肺损伤的靶点一肺上皮和内皮细胞进行修复。最终MSCs-Angl可改善肺组织损伤，修复细菌内毒素所致的肺损伤，如图7-10所示。图7中，静脉回输MSCs-AngI后，提取肺组织中总蛋白后，经SDS-PAGE电泳和western blot检测Angl蛋白，条带大小75kD。比较各组各时间点条带可见，空白对照组(NSgroup) Angl蛋白在脂多糖诱导肺损伤后下降,直至14d仍然低于肺损伤前；Angl组(Anglgroup) Angl蛋白也有下降趋势,但第3天高于空白对照组；MSCs组(MSCs group) Angl蛋白同样下降，但第14天已有回升；MSCs-Angl组(MSCs-Angl group)在第7天与第14天明显高于MSCs组和Angl单独组，提示MSCs-Angl的回输具有明显的放大效应，MSCs-Angl回输后Angl在肺组织内过表达。图8中MSCs-Angl回输可修复病理性肺损伤。外源性MSCs-Angl携带Angl-eGFP基因，经静脉输入体内后，在第14天可见肺组织受损处多处表达GFP的细胞出现(免疫组化显示为棕色颗粒的细胞为GFP阳性细胞。a、b为MSCs-Angl回输组，a xlOO, b x400 ；c、d :对照组)。由于小鼠本身不表达GFP蛋白，表达GFP蛋白的细胞只可能是MSCs转化而来。荧光显微镜直接观察和免疫组化均可见细胞GFP的表达(e荧光显微镜观察到绿色荧光；f为同一视野的DAPI染色显示细胞核)。图9中，与MSCs及Angl单独回输相比,MSCs-Angl明显改善光学显微镜下所见的肺部病理损伤、炎症反应与肺水肿(a、b :空白对照组；c、d :转染MSCs组；e、f Angl组；g,h MSCs 组。a、C、e、g xl00 ;b、d、f > h :x400)。图10中，MSC-Angl回输明显减轻肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白含量、中性粒细胞数量和肺组织过氧化物酶(MPO)活性。这些指标反映肺组织炎症反应程度和肺损伤程度。MSCs或Angl单独直接输入体内，作用较微弱而短暂，而以MSC作为载体转入Angl，其效果更为明显和持久(*与同一时间点对照组比较，P〈0. 05)。
实验证明，本发明的促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞可改善肺组织损伤，修复细菌内毒素所致的肺损伤。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
权利要求
1.一种促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞，其特征在于，是携带有促血管生成素I基因的间充质干细胞。
2.根据权利要求I所述的促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞，其特征在于，所述促血管生成素I基因来源于pCR2. I-Angl质粒。
3.根据权利要求I所述的促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞来源于哺乳动物。
4.一种构建权利要求I所述的促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将促血管生成素I基因导入慢病毒包装系统中的目的基因转移载体中，得到携带有促血管生成素I基因的重组慢病毒载体； 2)将携带有促血管生成素I基因的重组慢病毒载体与慢病毒包装系统中的包装质粒 和包膜质粒(16-24) : (5. 7-11. 7) : (5. 5-10. 5)的重量份数比混合，转染慢病毒包装细胞，得到携带有促血管生成素I基因的重组慢病毒； 3)将携带有促血管生成素I基因的重组慢病毒转染间充质干细胞，得到过表达促血管生成素I的促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述间充质干细胞从哺乳动物中分离纯化得到。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述促血管生成素I基因来源于pCR2. I-Angl 质粒。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤I)中的慢病毒包装系统中的目的基因转移载体为PLV质粒，pLV质粒中含有Ubiqutin启动子。
8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)包装质粒为pCMV-dR8.74质粒，包膜质粒为PMD2G质粒，慢病毒包装细胞为293T细胞。
9.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中的转染慢病毒包装细胞采用磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法或人工脂质体法。
10.权利要求I至3中任何一项所述的促血管生成素I基因修饰的间充质干细胞在制备修复肺损伤药物或材料中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种促血管生成素1基因修饰的间充质干细胞及其构建方法和应用，该间充质干细胞携带有促血管生成素1基因，实验证明，本发明促血管生成素1基因修饰的间充质干细胞能过表达促血管生成素1，经静脉回输后，促血管生成素1能在肺组织内过表达，明显改善肺部病理损伤、炎症反应与肺水肿，效果明显且持久，本发明促血管生成素1基因修饰的间充质干细胞及其构建方法将为肺损伤的修复提供适宜的微环境，应用前景广阔。
文档编号A61K48/00GK102899293SQ201210431720
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者徐金富, 瞿介明 申请人:上海市肺科医院