专利名称：重组血管内皮生长因子受体及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组血管内皮生长因子受体及其编码基因与应用，特别涉及一种由血管内皮生长因子受体VEGFR-I的结构域1-3与人源IgGl的Fe片段融合后所得的重组血管内皮生长因子受体及其编码基因与应用。
背景技术：
恶性肿瘤是当前严重威胁人类健康的一类疾病，每年全球因恶性肿瘤而死亡的人数达700万以上，新增恶性肿瘤患者1000万以上，WHO预计，到2020年，全世界肿瘤发病率将是现在的两倍。在过去的几十年中，化疗药物治疗肿瘤取得显著成效，但是，化疗药物存在毒副作用大以及易产生耐药等现象，因此，人们一直在努力寻找新一代的抗肿瘤药物。其中，抗血管生成疗法治疗肿瘤成为大家关注的焦点。抗血管生成治疗具有很多优越性①正常组织很少发生血管生成，而肿瘤生长对血管生成的依赖性使抗血管生成治疗具有特异性。②内皮细胞容易暴露于药物。③内皮细胞基因型稳定，突变率很低，以内皮细胞为靶标不易产生耐药。④破坏一条微血管即可抑制众多癌细胞的生长。⑤可抑制原发肿瘤的播散转移，控制转移瘤生长。⑥毒副作用小。⑦这种治疗方法理论上适合于各种实体肿瘤，不论其起源。血管生成贯穿胚胎发育期，在成人，血管生成降到较低水平，主要存在于创伤愈合及女性月经周期。在肿瘤血管前期，肿瘤细胞主要依赖弥散作用获取营养，当实体瘤达到I 2mm3、细胞数达到IO7左右时，其继续生长就必须要由新生血管来提供足够的氧及营养物质。新血管生成是在一系列调控因子的作用下，内皮细胞激活，基底膜降解，细胞迁移，侵入胞外基质，内皮细胞增殖，最终血管腔形成。在发现的一系列调控血管生成的因子中，血管内皮生长因子(Vascularendothelial growth factor, VEGF)是其中作用最强的一个。现已发现的VEGF家族有六个成员VEGF(即通常所指的VEGF-A)、胎盘生长因子(placenta growth factor, PIGF)、VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 和 VEGF-E。VEGFR 家族成员目前已发现有5种,其中有3种属于酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinases,RTKs)超家族，命名为 VEGFR-I (Flt-I)、VEGFR-2 (KDR/Flk-1)、VEGFR-3 (Flt-4)。另两种受体是 Npn-1 (neuropillin-1)和 Npn_2 (neuropilIin_2) [2]。此外，尚存在可溶性的VEGFR(sVEGFR)，它是由VEGFR-I的mRNA不同剪接而产生的，仅有胞外区序列而无跨膜和胞内序列。它可在周围血液中检测到，是VEGF的高亲和力受体(Kd=l-5pM)。VEGFR-I可与VEGF、VEGF-B和PIGF结合，对血管生成主要起调节作用；VEGFR_2可与VEGF、VEGF-C,VEGF-D和VEGF-E结合，是引起内皮细胞增殖转移的最主要受体，VEGF促进瘤细胞生长、侵袭和转移的作用也是通过VEGF与瘤细胞上的KDR结合，调控下游基因的表达而实现的m ；VEGFR-3只能与VEGF-C和VEGF-D结合，调节淋巴内皮细胞的增殖、移行、存活和淋巴管的生成，促进肿瘤淋巴转移。Npn-I可与VEGF165、PIGF-2和VEGF-E结合，Npn_2可与VEGF165和VEGF145结合，是配体与VEGFR2结合的辅助受体。
VEGFRl和VEGF结合的关键部位是第2、3结构域(R1D2-3)，缺失第二结构域的VEGFRl几乎完全失去与VEGF的结合能力，但单独的第二结构域与VEGF的结合能力只有野生型的1/60。在血管生成的过程中，VEGF在多个阶段具有重要作用①VEGF是强大的血管内皮细胞有丝分裂原VEGF能够调节多种激活内皮细胞、降解胞外基质的酶，如纤溶酶的激活剂与抑制剂抑制内皮细胞的凋亡；④诱导骨髓来源的前体内皮细胞成熟并迁移到血管生成位点；⑤为肿瘤细胞和循环内皮细胞前体细胞的到达提供一个适宜环境，并通过分泌一些趋向性因子，促进肿瘤细胞和循环内皮细胞前体细胞向此部位的转移[15] 增加血管通透性，抑制DC细胞分化成熟，促进己糖向内皮细胞的转运，诱导组织因子及单核细胞转运等。肿瘤细胞分泌VEGF促进血管生长，血管生长支持了肿瘤的进一步生长并分泌更多的VEGF，在VEGF的诱导下，肿瘤细胞还可通过上调VEGFR的表达来增强这种正反馈效应。大多数肿瘤，包括血液系统肿瘤，都有较高水平的VEGF表达，包括结直肠癌，肝癌，肺癌，甲状腺癌，乳腺癌，胃肠道癌，膀胱癌，卵巢癌和宫颈癌，血管肉瘤，生殖细胞瘤，颅内肿瘤。体内VEGF的表达水平与肿瘤的生长速度、微血管密度、增值、肿瘤的恶性程度和病人预后等有密切关系，成为判断肿瘤复发与预后的标志之一，并成为放、化疗与激素治疗的有效靶标。VEGF作为具有吸引力的肿瘤治疗的靶标具有两大优势VEGF处于调控肿瘤生长的关键节点，连接一系列上下游调控信号，并直接刺激内皮细胞；VEGF作用于基因型稳定的内皮细胞，而不是易突变的肿瘤细胞。最近研究还发现，对于产生基因突变的细胞，直接拮抗肿瘤来源的VEGF，治疗效果要优于抑制VEGF信号传导的药物。传统药物难以在肿瘤组织中达到足够浓度，这是因为第一，肿瘤组织的血管大多崎岖弯折，并存在盲端；第二，由于严重血管渗漏造成的组织间液过多，较高的组织内压极大的阻碍了药物的渗透。这些因素和放化疗引起的局部缺氧一起，引起VEGF的高表达，进一步增加了血管渗液与组织内压，并且VEGF还有保护肿瘤细胞抗调亡的作用。针对VEGF和VEGFR治疗恶性肿瘤的药物正在研发之中，包括抗VEGF和VEGFR的单抗，阻断受体信号传导的酪氨酸激酶抑制剂，VEGFR-I核酶，VEGF-毒素偶联物，可溶性VEGF受体。国内对VEGF/VEGFR的研究多集中在VEGF/VEGFR在各种肿瘤组织中的表达及意义研究，也有对VEGF/VEGFR家族成员进行克隆、表达的，但未见有抗VEGF药物的研究报道。因此，构建能够拮抗VEGF的诱捕性、可溶性受体，用于发现新的抗肿瘤药物极有意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种融合蛋白，该融合蛋白是一种重组血管内皮生长因子受体。本发明所提供的融合蛋白名称为VEGFR-1/Fc，自氨基端至羧基端依次为血管内皮生长因子受体I (VEGFR-I)的结构域1-3、人IgGl的Fe片段。所述融合蛋白是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白；
(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制血管生成活性的由序列I衍生的蛋白。其中，序列I由563个氨基酸组成，其中第1-331位为血管内皮生长因子受体I(VEGFR-I)的结构域1-3，第332-563位为人IgGl的Fe片段。上述(a)和(b )中的VEGFR-1/Fc蛋白均可人工合成，也均可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。编码所述融合蛋白VEGFR-1/Fc的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。在本发明的一个实施例中，所述核酸分子为编码所述融合蛋白VEGFR-1/Fc的基因(命名为VEGFR-1/Fc);所述基因是如下I) -5)中任一所述的DNA分子I)编码序列为序列表中序列2的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列3所示的DNA分子；4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且编码具有抑制血管生成活性的蛋白的DNA分子；5)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA分子杂交，且编码具有抑制血管生成活性的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65° C下杂交，然后用2XSSC，O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。其中，序列2由1692个核苷酸组成，整个序列2即为编码序列，编码序列表中序列I所示的VEGFR-1/Fc蛋白。序列3由2530个核苷酸组成，其所有外显子序列如下第13-1005位(序列2的第1-993位)为VEGFR-I结构域1_3基因的编码序列，编码序列表中序列I的第1-331位氨基酸，第1396-1440位为IgGl Fe片段的铰链区的编码序列(序列2的第994-1038位)；第1559-1891位为IgGl Fe片段的CH2区的编码序列(序列2的第1039-1371位)；第1989-2309位为IgGl Fe片段的CH3区的编码序列(序列2的第1372-1692位)。序列3编码序列表中序列I所示的蛋白。与序列2相比，序列3包含酶切位点，内含子及相关功能序列。含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述VEGFR-1/Fc基因转录的启动子具体为CMV启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在PIRES2-EGFP载体的多克隆位点处插入所述VEGFR-1/Fc基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为EcoR I和Not I。所述表达盒由能够启动所述VEGFR-1/Fc基因表达的启动子，所述VEGFR-1/Fc基因，以及转录终止序列组成。上述融合蛋白VEGFR-1/Fc，或核酸分子，或重组载体，或表达盒，或重组细胞，或重组菌，或重组病毒在制备下述任一产品中的应用也属于本发明的保护范围(I)抑制内皮细胞增殖的产品；(2)抑制内皮细胞迁移的产品；(3)抑制血管生成的产品；(4)抗肿瘤产品；所述内皮细胞具体为血管内皮细胞；在本发明的一个实施例中，所述血管内皮细胞具体为人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cell-1, HMEC-1)。活性成分为上述融合蛋白VEGFR-1/Fc，或核酸分子，或重组载体，或表达盒，或重组细胞，或重组菌，或重组病毒的如下产品也属于本发明的保护范围( I)抑制内皮细胞增殖的产品；(2)抑制内皮细胞迁移的产品；(3)抑制血管生成的产品；(4)抗肿瘤产品；所述内皮细胞具体为血管内皮细胞；在本发明的一个实施例中，所述血管内皮细胞具体为人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cell-1, HMEC-1)。本发明所提供的融合蛋白VEGFR-1/Fc的制备方法也属于本发明的保护范围。所述融合蛋白VEGFR-1/Fc的制备方法具体可包括如下步骤将所述融合蛋白的编码基因在生物细胞中进行表达得到所述融合蛋白；所述生物细胞为非人动物细胞、微生物细胞或植物细胞；在本发明的一个实施例中，所述生物细胞具体为CHO-Kl细胞。在上述方法中，所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列2所
/Jn ο 实验证明，本发明所提供的融合蛋白VEGFR-1/Fc与VEGF有较高的亲合力，KD值达到了 265pM ； VEGFR-1/Fe对血管内皮细胞的增殖与迁移有明显的抑制效应；对于鸡胚绒毛尿囊膜以及裸鼠体内的血管生成都有明显的抑制作用。本发明所提供的融合蛋白VEGFR-I/Fe在肿瘤治疗中具有很大的应用前景。
图I为总RNA电泳结果。其中，泳道M为分子量标准；泳道I为总RNA电泳结果。图2为VEGFR-I结构域1_3基因的PCR扩增结果。其中，泳道M为分子量标准；泳道I为VEGFR-I结构域1-3基因的PCR扩增结果。图3为IgGl Fe片段的PCR扩增结果。其中，泳道M为分子量标准；泳道I为含有内含子的IgGl Fe片段的PCR扩增结果。图4为重组表达载体pIRES2-EGFP-VEGFR-l/Fc转染CHO-Kl细胞前后的细胞形态。其中，A为转染前野生型CHO细胞；B-D为重组表达载体pIRES2-EGFP-VEGFR-l/Fc转染后筛选得到CHO-Kl单克隆细胞；E-G重组表达载体pIRES2-EGFP-VEGFR-l/Fc转染后筛选得到CHO-Kl单克隆细胞的荧光图。图5为BCA法蛋白定量时的蛋白标准曲线。图6为VEGFR-1/Fc融合蛋白的SDS-PAGE检测结果。其中，A为VEGFRl/Fc单体(还原电泳)的检测结果；B为VEGFR-1/Fc融合蛋白的二聚体(非还原电泳)的检测结果。A和B中，泳道M均为蛋白分子量标准；泳道2均为VEGFR-1/Fc融合蛋白的检测结果。图7为预结合试验测定VEGF与CM5结合的最佳pH值。四个峰从左至右依次代表ρΗ4· O, ρΗ4· 5，ρΗ5· O, ρΗ5· 5 四种 pH 值。图8为BIAcore测定VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165结合常数结合解离曲线。其中，I表示200nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；2表示IOOnM的VEGFR-1/Fe融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；3表示50nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；4表示25nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；5表示12. 5nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线。图9为Mg离子对VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF结合的影响。其中，A为Mg离子存在时的结合解离曲线；B SMg离子不存在时的结合解离曲线。A和B中，I均表示200nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；2均表示IOOnM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；3均表示50nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；4均表示25nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线；5均表示12. 5nM的VEGFR-1/Fc融合蛋白与VEGF165的结合解离曲线。图10为VEGFR-1/Fc融合蛋白对HMEC-1增殖的影响。图11为VEGFR-1/Fc融合蛋白对HMEC-1迁移的影响一荧光图片。其中，a_d中VEGFR-1/Fe 的工作浓度依次为 800、200、50、0ng/ml。图12为VEGFR-1/Fc融合蛋白对HMEC-1迁移的影响一统计结果。图13为VEGFR-1/Fc融合蛋白抑制鸡胚尿囊绒毛膜(CAM)血管生长试验结果。其中，a为PBS ；b-d中VEGFR-1/Fe融合蛋白的用量依次为5pmol、IOpmol和25pmol。图14为VEGFR-1/Fc融合蛋白对裸鼠血管生成的影响。其中，a_d中VEGFR-1/Fc融合蛋白的工作浓度依次为10_7，IO-8, IO-9,10_1(lmOl/L ；e为阳性对照；f为阴性对照。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、VEGFR-1/Fe融合基因的克隆及表达载体的构建乳腺癌细胞MCF-7 :协和基础所细胞库；pUC19载体TaKaRa公司；pIRES2_EGFP载体Invitrogen公司；pIGl质粒记载在刘荷中，毛宁，侯春梅等.阻断⑶40/⑶40L相互作用延长移植物抗宿主病小鼠存活时间.中国临床药理学与治疗学，2003，8 (1):6-10中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得JoplO感受态大肠杆菌Transgen公司；Taq酶、Pyrobest酶、DNA连接酶均为TaKaRa产品，限制性内切酶均为NEB公司产品；质粒提取、PCR产物回收、酶切产物回收分别采用Promega公司Wizard Plus SVMinipreps DNA purification System、Wizard PCR preps DNA purification system、Wizard DNA clean-up 试剂盒；RNA 提取试剂 Trizol Invitrogen 公司。一、VEGFR-l/Fc融合基因的克隆(一)VEGFR-I结构域1-3基因的获得I、引物的设计与合成为了提高扩增含有VEGFR-I结构域1_3的特定片段的成功率，采用嵌套PCR，设计内外两组引物(I代表外部，2代表内部)，在内部引物首尾加EcoR I GGAATTCC和Xba IGCTCTAGAGC酶切位点(含保护碱基)，引物序列如下Flt-IRTlU 5 ' -GGGAAGTGGTTGTCTCCTGG-3’(GenBank :ΝΜ_001160031 的第138-157 位)；Flt-IRTlD 5 ' -CCTTTTCGTAAATCTGGGGTT-3’(GenBank :ΝΜ_001160031 的第1565-1585位的反向互补序列)；Flt-1RT2U 5/ -GGAATTCCAGAGGACGGACTCTGGCG-3’(下划线处为 EcoR I 的识别位点序列，其后的序列为GenBank NM_001160031的第208-225位)；Flt-1RT2D 5/ -GCTCTAGAGCCTGGAAACGATGACACGG-3，(下划线处为 Xba I 的识别位点序列,其后的序列为GenBank NM_001160031的第1586-1603位的反向互补序列)。为从RT-PCR扩增获得片断中扩增VEGFR-I结构域1_3，设计引物如下引物5’端加Nhe I CTAGCTAGC (含保护碱基)；3’端加BamH I CGGGATCCCG (含保护碱基)、剪接供体序列ACTTACCTGT (以便人IgGl Fe片段(含有内含子及剪接配体)序列)转录过程的正确剪接)Flt-I R1-3U :5’ CTAGCTAGCACCATGGTCAGCTACTGGGAC-3’ (下划线处为 Nhe I 的识别位点序列，其后的序列为GenBank NM_001160031的第283-303位)Flt-I R1-3D :5，-CGGGATCCCGACTTACCTGT TTTATCATATATATGCACTGAG-3，(下划线处为BamH I的识别位点序列和剪接供体序列，其后的序列为GenBank NM_001160031的第1257-1278位的反向互补序列)2、从乳腺癌细胞MCF-7中提取总RNA采用RNA提取试剂Trizol (Invitrogen)提取乳腺癌细胞MCF-7中的总RNA。具体操作如下(1)裂解在细胞培养瓶中移去全部培养基，加3. 5ml Trizol，用移液器吹打，使充分裂解，(每IOcm2培养面积用Iml Trizol)。(2)分离在15°C _30°C温育匀浆5min，加O. 2ml氯仿(每Iml Trizol)盖好盖子，剧烈摇动管子15s，15°C _30°C温育2_3min。以转速〈12000g，温度4°C离心15min。(3)将水相(无色，在氯仿上层，RNA存在于水相)移至新管，加 O. 5ml 异丙醇(每 Iml Trizol)温育 15°C -30°C IOmin0 离心,转速 <12000g, 4°C离心lOmin。(4)移去上清，加至少Iml 75%乙醇洗涤，漩涡混匀，以转速<7500g，4°C离心5min。(5)倒掉上清,置超净台中待其自然干燥，(切勿离心)用无RNase的水200 μ I溶解，550C -60°C温育lOmin，_20°C冻存，备用。(6)进行RNA电泳检测。结果如图I所示，所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28SRNA和18SRNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。3、RT-PCR以步骤2获得的总RNA为模板，利用步骤I设计的引物Flt-IRTIU、Flt-IRTID、Flt-1RT2U 和 Flt-1RT2D 进行嵌套 PCR 扩增。反应体系2X反应混合液25 μ I ；RNA1 μ I ;5’引物1μ I ;3’引物1μ I ;RT/Taq酶I μ I ；Mg2+(50mM)1.8y I ;水补充至 50 μ L·循环参数5(TC30min—94°C2min— (94°C 30s ^ 52°C 30s ^ 72°C 60s) X40 —72°C5min — 4 °C4、VEGFR-I结构域1-3基因的获得
以步骤3获得的RT-PCR扩增片断为模板，利用步骤I设计的引物Flt_lRT3U和Flt-1RT3D 进行 PCR 扩增。反应体系(100μ I) :dNTP 8 μ I ；pyrobest 0. 5 μ I ；10Xbuffer 10 μ I ;模板10 μ I ;5，引物 2μ I ;3，引物 2μ I ;水67.54 I。循环参数94V 2min — (94 V 30s — 60 V 30s — 72 V 60s) X 30 — 72 V 5miη — 4 °C。以低融点琼脂糖(LMP)凝胶电泳(Promega,Agarose LMP, Cat No.V2111,胶浓度为1%，缓冲液TAE,电压6V/cm)电泳分离 目的基因。米用Promega公司Wizard PCR prepsDNA purification system纯化回收扩增的可变区片段。用琼脂糖凝胶电泳验证回收产物。(IOOmL的胶中加I μ I溴化乙锭EB)电泳缓冲液为ΤΑΕ，电压6V/cm。PCR扩增结果如图2所示，结果表明扩增得到大小约为IOOObp的目的条带(VEGFR-I结构域1-3基因)。并对其进行测序鉴定，结果表明，该片段的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-1028位+送。其中序列3的第13-1005位对应序列2的第1-993位(GenBank NM_001160031的第286-1278位)，为VEGFR-I结构域1_3基因的编码序列，编码序列表中序列I的第1-331位氨基酸。(二)IgGlFc片段基因的获得鉴于含有内含子的基因在体内具有更高的表达水平，在构建融合蛋白时，以PlGl质粒为模板，以引物FcU与FcD扩增获得含有内含子的IgGlFc片段基因。引物序列如下FcU 5 -CGGGATCCGGAGGGAGGGTG-3 FcD :5，-AAGGAAAAAAGGTACCCTATTACTGCCTCCCTCATGCCAC-3’首尾加BamH I GGATCC和Kpn I GGTACC酶切位点(含保护碱基)以及终丨h密码子CTATTA。反应体系(100μ I) :dNTP 8 μ I ；pyrobest 0. 5 μ I ；10Xbuffer 10 μ I ;模板1μ I ;5，引物 2μ I ;3，引物 2μ I ;水76.5“ I。循环参数94°C2min — (94 °C 30s — 60 °C 30s — 72 °C 120s) X 30 — 72 °C 5min — 4 °C。以低融点琼脂糖(LMP)凝胶电泳(Promega,Agarose LMP, Cat No.V2111,胶浓度为1%，缓冲液TAE,电压6V/cm)电泳分离目的基因。米用Promega公司Wizard PCR prepsDNA purification system纯化回收扩增的可变区片段。用琼脂糖凝胶电泳验证回收产物。(IOOmL的胶中加I μ I溴化乙锭EB)电泳缓冲液为ΤΑΕ，电压6V/cm。PCR扩增结果如图3所示，结果表明扩增得到大小约为1500bp的目的条带(包含内含子的IgGlFc片段)。并对其进行测序鉴定，结果表明，该片断核苷酸序列如序列表中序列3的第1016-2530位所示，共由1515个核苷酸组成，其中第1016-1023位为BamH I的识别位点及保护性碱基；第1396-1440位为IgGlFc片段的铰链区的编码序列(序列2的第994-1038位);第1559-1891位为IgGlFc片段的CH2区的编码序列(序列2的第1039-1371位)；第1989-2309位为IgGlFc片段的CH3区的编码序列(序列2的第1372-1692位)。二、VEGFR-1/Fc融合基因的重组表达载体的构建用限制性内切酶Nhe I和BamH I双酶切步骤一(一)获得的VEGFR-I结构域1_3基因，用限制性内切酶BamH I和Kpn I双酶切步骤一 (二)获得的IgGlFc片段基因，用限制性内切酶 Nhe I 和 Kpn I 双酶切 pIRES2_EGFP 载体。米用 Promega Wizard DNA clean-up试剂盒回收酶切产物。将酶切回收的三个片段进行共连接，连接体系如下T4连接酶Iy I ；IOXBuffer 2. 5 μ I ;经酶切的VEGFR-I结构域1_3基因和IgGlFc片段基因各5 μ I ;经酶切的PIRES2-EGFP载体2 μ I ;水补充至25 μ I。16°C水浴连接过夜。将 连接产物转化至大肠杆菌ToplO感受态。摇菌后，提取质粒，采用内切酶Nhe I和Kpn I进行酶切鉴定，将经鉴定得到大小约为2500bp目的条带的重组质粒送样测序，将经测序表明在PIRES2-EGFP载体的酶切位点Nhe I和Kpn I之间插入了序列表中序列3所示的DNA片段的重组载体命名为pIRES2-EGFP-VEGFR-l/Fc。其中，序列3为VEGFR-I结构域1-3基因与含有内含子的IgGlFc片段基因的融合基因序列。序列3中的所有外显子序列如下第13-1005位(序列2的第1-993位)为VEGFR-I结构域1_3基因的编码序列，编码序列表中序列I的第1-331位氨基酸，第1396-1440位为IgGlFc片段的铰链区的编码序列(序列2的第994-1038位)；第1559-1891位为IgGlFc片段的CH2区的编码序列(序列2的第1039-1371位);第1989-2309位为IgGlFc片段的CH3区的编码序列(序列2的第1372-1692位)。序列3编码序列表中序列I所示的蛋白。重组表达载体pIRES2-EGFP-VEGFR-l/Fc中启动VEGFR-1/Fc基因转录的启动子为CMV启动子。实施例2、VEGFR-1/Fe融合蛋白的表达、纯化及鉴定质粒转染及加压筛选所用材料CHO-Kl细胞ATCC Number CCL-61，培养条件为DMEM/F12 培养基(Gibco)，含 5% (v/v)新生牛血清(FBS) (Hyclone)，培养于 5%C023 7°C温箱(Thermo Forma)。Lipofectamine 2000 阳离子脂质体转染试剂盒，及Opti-MEM l<; I 低血清培养基(Invitrogen)。G418 (Roche)。ELISA筛选高表达克隆所用材料牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)。PBS-TCKCl O. 2g/
I；KH2PO4 O. 2g/L ；NaCl 8. Og/L ；Na2HP04 · 7H20 I. 56g/L ；Tween 20 0. 05%(v/v) ;pH7. 4)。96孔酶联板(Nunc )。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG(H+L)(中山生物技术公司进口分装)。TMB显色液(欣经科生物技术公司)。酶标板读板机(Thermo Labsystems)。纯化用填料及设备rProteinA Sepharose Fast Flow (GE healthcare)。低温离心机(Sigma 2K15C)。8823A紫外检测仪(北京新技术应用研究所)，3057记录仪(YOKOGAffA)0其他材料BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京赛驰生物科技有限公司)，SDS-PAGE电泳设备(北京六一仪器厂)，低分子量蛋白标准(Tiangen),高分子量蛋白标准(Takara),广谱分子量蛋白标准(NEB)。Western电转仪(北京六一仪器厂)，PVDF膜(Millipore)，TBST(IOmM Tris-HCl, IOOmM NaCl, O. 2%Tween_20，pH7. 4)，脱脂奶粉(北京普利来)，HRP 标记的goat anti-human IgG 抗体(北京莱博公司)，化学发光底物 Immunobilon HRP substrate(Millipore)。一、VEGFR-1/Fc融合蛋白的表达I、稳定转染细胞系的筛选(I)转染前一天，胰酶消化CH0-K1细胞并计数，24孔板每个孔中加I. 2 X IO5个细胞铺板，使其在转染日密度为90%，不要使细胞保持融合超过24小时。细胞铺板在O. 5ml含血清，不含抗生素的正常生长培养基中。(2)对于每孔细胞，使用50μ I无血清培养基(如OPTI-MEM I培养基)稀释O. 8 μ g-1. Oyg DNA (实施例I构建的重组表达载体pIRES2-EGFP_VEGFR-l/Fc)。多孔操作可以批量制备。(3)对于每孔细胞，使用50μ1的OPTI-MEM I培养基稀释I μ 1-3 μ 1LIP0FECTAMINE 2000 试剂。LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在 30 分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。(4)室温保温20分钟。注意溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。(5)直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。(6)在37°C，5%的CO2中保温24_48小时，无须去掉复合物或更换培养基，在4_5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。(7)在开始转染一天后将细胞按I :10以上比例传代至新鲜培养基中，24h后换用含G418 500mg/L的筛选培养基加压筛选，每3d换液一次，加压筛选7_10d，见到细胞形成一个个集落以后，原位消化一次，促进死亡细胞从底部脱落，再继续加压筛选2-3d，即可进行
单克隆化培养。(8)单克隆化培养用有限稀释法进行单克隆化培养。将细胞消化成单细胞悬液后计数，用含G418400mg/L生长培养基稀释至20、10和5个细胞/ml，100 μ I/孔接种于96孔培养板，置37°C培养。7-10天后，即可见单细胞克隆生长，逐孔观察，挑出单克隆，待其生长数目达IO3以上后，取上清用ELISA检测蛋白表达量，选取表达水平较高的克隆，消化传代至24孔板培养，至长满孔底，换无血清DMEM/F12培养基培养24h，取上清用ELISA再次检测蛋白表达量。其中，ELISA法测定VEGFR-1/Fc融合蛋白表达水平的方法如下1)包被将待检孔的上清各50 μ I直接加入酶联板孔，37°C孵育2h，PBS-T (含O. 05%吐温20的PBS)洗涤I次；2)封闭1% (lg/100ml)牛血清白蛋白(BSA)(溶于 PBS-T)，250 μ I/孔，37°C 孵育 2h，PBS-T洗涤I次；3)标记加入辣根酶标记山羊抗人IgG(H+L)，用封闭液按照体积比I :8000 的比例稀释，50 μ I/孔，37°C孵育lh, PBS-T洗涤3次；4)显色加入TMB A、B试剂各一滴/孔，室温放置约5-20min，显蓝色后每孔加入lmol/L H2S04 50 μ I终止，这时蓝色变为亮黄色;5) 450nm测OD值。(9)结果重组表达载体pIRES2-EGFP-VEGFR-l/Fc转染CH0-K1细胞(图4中A)后，经过G418加压筛选3d后细胞开始死亡，并在5-7d左右达到死亡高峰期，此时应l-2d即换液一次，I周左右可见细胞成集落生长。经原位消化后，又有大量细胞不能再贴壁，2-3d后，消化收集细胞，有限稀释法进行单克隆化培养，3d后，即可在孔中观察到细胞克隆；约7-10d后，每克隆细胞数即可达到约IO3 (图4中B-D、E-G)。无血清培养条件下，收集上清通过ELISA挑选阳性克隆，挑选出的阳性克隆传代至24孔板培养后，再次ELISA检测。经过两轮筛选，VEGFR-1/Fe得到A5、D2、E6、F5四株表达水平较高的克隆，其中以VEGFR-I/Fc-A5表达水平最高，经BCA法测定纯化蛋白浓度达到5. 2 μ g/ (IO6Cell · 24h)。2、VEGFR_1/Fc融合蛋白的表达将通过上述步骤I得到的高表达VEGFR-1/Fc融合蛋白的稳定转染细胞株A5，按6孔板-方瓶-转瓶逐级扩大培养，其间注意冻存高表达的细胞株。方瓶-转瓶传代培养时，将一个方瓶中的细胞以O. 25%的胰酶消化下来，加入IOOml生长培养基，接种至IOOOml的转瓶中，于37°C转瓶机培养3 4d，至细胞铺满90%以上瓶壁，换无血清DF培养基，每培养24h后，收获上清，更换新的无血清DF培养基。可连续收液直至细胞从瓶壁脱落。4°C存放收获上清。所得上清中即含有大量的VEGFR-1/Fc融合蛋白。二、VEGFR-1/Fe融合蛋白的纯化及浓度测定I、VEGFR-1/Fe融合蛋白的纯化结合缓冲液50mMTris-HCL, ρΗ7· O ;洗脱缓冲液0. IM Gly-HCl，ρΗ3· O ;中和缓冲液1M Tris-HCL, ρΗ9. O。米用rProtein A Sepharose Fast Flow 对步骤一得到的含有大量的 VEGFR-1/Fc融合蛋白的上清进行纯化，具体如下(I)装柱保持所有装柱物品等温。装柱前，应先用双蒸水和结合缓冲液清洗柱子，排尽介质以及柱子中的气泡，关闭流出孔，在柱中装入l-2cm深的结合缓冲液，将20mlrProtein A亲合层析介质勻衆沿玻璃棒勻速注入柱子,迅速用结合缓冲液充满剩余空间，放上顶膜，接上进样管。打开流出孔，用200ml (5-10倍体积)结合缓冲液以最高2ml/min的速度流洗柱子。用IOOml (5-10倍体积)洗脱缓冲液洗去柱内污染物。再以IOOml结合缓冲液流洗柱子。(2)上样将样品溶液经4000g离心10分钟，再以O. 8 μ m混合纤维素滤膜过滤以除去细胞、聚合物等杂质，调节上清pH至6. 5左右。流速设为5ml/min，直至样品流完，用结合缓冲液流洗柱子。直至A280值回归基线(所有未结合蛋白都被洗脱)。(3)洗脱用洗脱缓冲液流洗柱子，承接流洗液的容器中预先注入约为洗脱液1/10体积的中和缓冲液。洗下的溶液立即使用时，可存放于4°C，长期存放于-20°c，最好_70°C。所洗下的溶液即为纯化后的VEGFR-1/Fc融合蛋白。(4)储存用3倍柱体积洗脱缓冲液流洗柱子，再用5倍柱体积20%乙醇流洗柱子，存放4°C。2、VEGFR-1/Fe融合蛋白的浓度测定A粗测蛋白浓度采用280nm紫外光吸收法来测定。直接将样品加入石英比色皿测定。为排除核酸的干扰，可采用以下公式计算蛋白含量蛋白含量(mg/ml) =0D280值 X1.45-0D260 值 X0. 74。B准确定量蛋白浓度采用二喹啉甲酸(BCA)检测法(1)配制工作液根据标准品和样品数量，按 BCA 试剂 A (BCA 1%，Na2CO3 · H2O 2%, Na2C4H4O6 · H2O O. 16%, NaOH O. 4%,NaHCO3O. 95%。用NaOH调节pH至11. 25。其中“％”均表示g/100ml)与BCA试剂B (浓度为4g/100ml的CuSO4 · 5H20溶液)体积比50 1配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。(2)稀释标准品取10 μ I标准品用PBS稀释至100 μ 1，使终浓度为lmg/ml。将标准品按O，I，2，4，8，12，16，20 μ I加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20 μ I。(3)根据粗测蛋白浓度结果加适当体积步骤I纯化后的VEGFR-1/Fc融合蛋白样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20 μ I。(4)各孔加入200 μ I BCA工作液，37°C放置30分钟。(5)冷却到室温，用酶标仪测定0D570，根据标准品OD值绘制标准曲线，依据标准曲线计算出目的蛋白浓度。实验重复三次，结果取平均值。蛋白标准浓度曲线如图5所示，其R2值达到0. 99以上。步骤I得到的纯化后的VEGFR-1/Fe融合蛋白浓度达到2. 47mg/ml，三次测定结果如表I所示。·
表lVEGFR-1/Fc融合蛋白浓度的三次测定结果(单位mg/ml)
权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白自氨基端至羧基端依次为血管内皮生长因子受体I的结构域1-3、人IgGl的Fe片段。
2.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白是如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制血管生成活性的由序列I衍生的蛋白。
3.编码权利要求I或2所述融合蛋白的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子为编码权利要求I或2 所述融合蛋白的基因；所述基因是如下I) _5)中任一所述的DNA分子1)编码序列为序列表中序列2的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列3所示的DNA分子4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且编码权利要求I或2所述融合蛋白的DNA分子；5)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA分子杂交，且编码权利要求I或2所述融合蛋白的DNA分子。
5.含有权利要求3或4所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于在所述重组表达载体中，启动所述基因转录的启动子为CMV启动子。
8.权利要求I或2所述融合蛋白，或权利要求3或4所述核酸分子，或权利要求5-7 中任一所述的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒在制备下述任一产品中的应用(1)抑制内皮细胞增殖的产品；(2)抑制内皮细胞迁移的产品；(3)抑制血管生成的产品；(4)抗肿瘤产品；所述内皮细胞具体为血管内皮细胞。
9.活性成分为权利要求I或2所述融合蛋白，或权利要求3或4所述核酸分子，或权利要求5-7中任一所述的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒的如下产品(1)抑制内皮细胞增殖的产品；(2)抑制内皮细胞迁移的产品；(3)抑制血管生成的产品；(4)抗肿瘤产品；所述内皮细胞具体为血管内皮细胞。
10.权利要求I或2所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤将所述融合蛋白的编码基因在生物细胞中进行表达得到所述多肽；所述生物细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞；所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列2所示。
全文摘要
本发明公开了一种重组血管内皮生长因子受体及其编码基因与应用。本发明所提供的重组血管内皮生长因子受体为一种融合蛋白，自氨基端至羧基端依次为血管内皮生长因子受体1的结构域1-3、人IgG1的Fc片段。实验证明，本发明所提供的融合蛋白VEGFR-1/Fc与VEGF有较高的亲合力，KD值达到了265pM；VEGFR-1/Fc对血管内皮细胞的增殖与迁移有明显的抑制效应；对于鸡胚绒毛尿囊膜以及裸鼠体内的血管生成都有明显的抑制作用。本发明所提供的融合蛋白VEGFR-1/Fc在肿瘤治疗中具有很大的应用前景。
文档编号A61K48/00GK102924604SQ201210431729
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者胡显文, 师明磊, 郗永义, 高丽华, 邵勇, 冯立, 陈惠鹏, 赵志虎 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所