专利名称：CpG-ODN在制备促淋巴瘤细胞凋亡药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及CpG-ODN的应用，特别涉及CpG-ODN在制备促淋巴瘤细胞凋亡药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
B细胞淋巴瘤是以⑶5阳性B细胞在外周血、骨髓、外周淋巴器官中的克隆性生长及聚集为特征的一种恶性肿瘤疾病，它是西方国家中最普遍的白血病种类之一。最新研究发现，B淋巴瘤细胞中由于促凋亡与抗凋亡系统的平衡被破坏以及促细胞生存信号通路被上调等因素的存在，从而对临床常用的放射疗法及化学疗法产生严重的抗药性。因此，能够 延长B淋巴瘤患者生命并能最终达到有效治疗目的的替代疗法与药物是目前国内外研究的热点与前沿。CpG寡脱氧核苷酸是富含非甲基化CpG基序的寡脱氧核苷酸序列(简称CpG-ODN)，人工合成的CpG-ODN具有广泛的免疫调节作用，能够活化宿主的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞及树突状细胞等免疫细胞，进而通过调控宿主免疫系统而参与到多种相关疾病的发生发展过程中。目前研究热点主要集中在诱导天然保护性免疫；预防感染；用于肿瘤的免疫治疗；用于过敏性疾病的免疫治疗；作为疫苗佐剂等。近年研究表明，传统的CpG寡脱氧核苷酸1826 (1826-CpG)可通过减少细胞活性、提升细胞因子的释放水平及增强免疫反应而发挥抗淋巴瘤的活性(Li Jiali, Song ffenru, Czerwinski DebraK. , VargheseBindu, Uematsu Satoshi, Akira Shizuo, Krieg Arthur M. , Levy Ronald.LymphomaImmunotherapy with CpG Oligodeoxynucleotides Requires TLR9Either in theHostor in the Tumor Itself. The Journal of Immunology, 2007，179:2493-2500)。虽然目前针对肿瘤的免疫治疗已经开发出了多种不同类型的CpG-ODN，但多数CpG-ODN具有种属特异性，主要是通过刺激宿主免疫系统而发挥功能，然而，具有直接杀伤肿瘤细胞功能且其作用机制明确的新型广谱、高效CpG-ODN尚未见报道。因此，尽快开发出能够有效诱导B淋巴瘤细胞凋亡、并能有效预防与治疗B细胞淋巴瘤的广谱、高效的新型CpG-ODN是抗淋巴瘤药物研发领域的热点与前沿。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供CpG-ODN在制备促淋巴瘤细胞凋亡药物中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现CpG-0DN在制备促淋巴瘤细胞凋亡药物中的应用；所述的CpG-ODN 为 KSK-CpG，KSK-CpG 的核苷酸序列如下所示5' -TCGTCGTTTTCGTCGTCGTTTT-3'；所述的KSK-CpG能同时激活人源和鼠源性免疫细胞；所述的促淋巴瘤细胞凋亡药物以KSK-CpG为有效成分，通过抑制Erk活性，引起细胞周期阻滞在Gl期，下调线粒体膜电位水平，诱导DNA断裂，增强促凋亡相关蛋白如Caspase3, PARP, Bax的活性，抑制抗凋亡蛋白Bcl_2的活性，促进细胞因子IFN-Y的表达与分泌及促进TLR9的表达等方式而促进淋巴瘤细胞的凋亡；所述的淋巴瘤细胞为小鼠B淋巴瘤A20细胞株。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明提供了 CpG寡脱氧核苷酸KSK-CpG的新的用途，首次提出KSK-CpG无需经过宿主免疫系统而可以直接杀伤、杀死B淋巴瘤细胞A20，并量化分析了 KSK-CpG多方面的促淋巴瘤A20细胞株凋亡的活性，阐明了 KSK-CpG可通过激活TLR9信号通路、促进细胞因子IFN-Y的自分泌等途径，直接对B淋巴瘤A20细胞株发挥细胞毒性功能，上述细胞毒性与细胞凋亡密切相关。本发明提供了KSK-CpG促B淋巴瘤细胞凋亡功能新的认识，并表明KSK-CpG的使用将为B细胞淋巴瘤的治疗提供一种新的治疗策略。
图I是KSK-CpG对淋巴瘤细胞活性的影响图；其中A为CpG-ODN对小鼠B淋巴瘤A20细胞活性的时间效应图；B为CpG-ODN对小鼠B淋巴瘤A20细胞活性的剂量效应图；C为CpG-ODN对小鼠T淋巴瘤EL4细胞活性的时间效应图；D为CpG-ODN对小鼠T淋巴瘤EL4细胞活性的剂量效应图。图2是CpG-ODN诱导小鼠B淋巴瘤A20细胞凋亡的H0/PI双染实验结果图。图3是CpG-ODN诱导小鼠B淋巴瘤A20细胞凋亡的DNA断裂实验结果图；其中，泳道 I 为 DNA marker (IOObp Plus DNA Ladder, Bioneer, Korea);泳道 2 是不进行任何处理的空白对照，泳道3 5分别为Non-CpG、1826-CpG与KSK-CpG。图4是KSK-CpG诱导小鼠B淋巴瘤A20细胞凋亡的流式细胞仪检测结果图。图5是为图4的统计分析结果图。图6是KSK-CpG促进小鼠B淋巴瘤A20细胞的线粒体膜电位降低的结果图，其中A为KSK-CpG处理的A20细胞的JC-I染色及流式细胞仪分析的典型结果图；B为A的统计分析结果图。图7是KSK-CpG对小鼠B淋巴瘤A20细胞中生存相关信号通路及细胞周期的影响，其中A为KSK-CpG对蛋白激酶活性的影响结果图；B为通过流式细胞仪分析KSK-CpG对A20细胞周期及凋亡实验的Gl期细胞数量的统计分析结果图；C为通过流式细胞仪分析KSK-CpG对A20细胞周期及凋亡实验的凋亡细胞数量的统计分析结果图。图8是KSK-CpG对凋亡相关蛋白活性的影响结果图，其中A为CpG-ODN对A20及EL4细胞中凋亡相关蛋白表达的影响结果图；B为KSK-cpG对A20细胞中凋亡相关蛋白表达的影响结果图；C为KSK-cpG介导A20细胞中Caspase3活性的ELISA分析结果图；D为Caspase3特异性抑制剂Ac_DEVD-pNA降低KSK-CpG诱导的A20细胞死亡的结果图。图9是KSK-CpG对对TLR9的影响结果图，其中A为CpG-ODN对A20及EL4细胞中TLR9的mRNA表达的影响图；B为氯喹抑制KSK-CpG所诱导的A20细胞死亡的结果图。图10是细胞因子表达及其对A20细胞活性的影响，其中A为CpG-ODN对细胞因子IFN- y及TNF- a的mRNA表达的影响结果图；B为细胞因子IFN- y及TNF- a对A20细胞活性的影响结果图；C SKSK-CpG可剂量依赖性地促进A20细胞中IFN-Y的释放结果图；D为IFN- y促进A20细胞的DNA断裂结果图；E为IFN- y抗体可抑制KSK-CpG所诱导的A20细胞的DNA断裂结果图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I :CpG寡脱氧核苷酸的设计与合成本发明中所用的CpG-ODN的序列如下murine CpG 0DN(1826_CpG)为标准对照5，-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3，;KSK-CpG 为实验组:5，-TCGTCG TTT TCG TCG TCGTTT T-3’ ；同时以 Non-CpG (无 CpG-ODN 功能)为阴性对照5’ -TCC AGG ACT TCT CTC AGG TT-3，；(均通过 Bio-Whittaker, Walkersville, MD, USA 合成)。实施例2 =CpG寡脱氧核苷酸对B淋巴瘤细胞活性的影响为检测CpG寡脱氧核苷酸对淋巴瘤细胞生长与活性的影响，我们首先用EZ-CyToxCell Viability Assay Kit (Daeil Lab Service Co. Ltd.，Seoul, Korea)检测了 KSK-CpG及传统的1826-CpG对小鼠B淋巴瘤A20细胞株(美国ATCC)与小鼠T淋巴瘤EL4细胞株(美国ATCC)活性的影响。具体实验方法为A20细胞与EL4细胞分别用含有体积百分比为10%的胎牛血清、IOOU 青霉素、100 u g 链霉素的RPMI1640培养基(BioWhittakerInc. ,Walkersville, MD，USA)接种到96孔板中，在37°C、含有5%C02细胞培养箱中培养至80%左右的融合，更换为含体积百分比为2%胎牛血清的培养基，在10 ii g .Hir1CpG-ODN(分别为Non-CpG、1826-CpG和KSK-CpG)存在的情况下将细胞再培养3天，在每个孔中加入10 y L的检测试剂(试剂盒自带)，37°C继续培养2小时，于460nm波长处用酶标仪检测吸光值，细胞活性按照试剂盒的说明书进行计算。结果发现，1826-CpG与KSK-CpG处理I天后均能有效抑制A20细胞的活性；而且，与Non-CpG相比，1826-CpG与KSK-CpG均能在2天后显著降低A20细胞的活性；重要的是，KSK-CpG的活性明显高于传统的1826-CpG ;然而，CpG-ODN对T淋巴瘤细胞EL4的活性并没有显著影响(图I中的A和C)。为研究CpG-OND的剂量效应，肿瘤细胞用不同浓度的CpG-ODN处理3天。结果表明，KSK-CpG与1826-CpG均能在5 y g mL—1的浓度下显著抑制A20细胞的活性，而且，在IOu g mr1以上的浓度时，KSK-CpG对A20细胞的敏感性明显高于1826-CpG(图I中的B和D)。上述结果表明KSK-CpG对B淋巴瘤细胞A20的直接细胞毒性显著高于传统的1826-CpG。实施例3 =CpG寡脱氧核苷酸(KSK-CpG)促进B淋巴瘤细胞凋亡用Hoechst33342 (HO) /Propidium iodide (PI)双染检测了 CpG-ODN 介导的肿瘤细胞死亡。具体实验方法为细胞用lug* mr1的HO或5 ii g mr1的PI在37°C、5%C02的条件下避光培养15分钟，离心收集细胞，用质量百分比4%的甲醛固定，4°C预冷的的PBS(0. 01M, pH7. 4)洗涤，重悬，取适量细胞悬液涂于载玻片上，风干，用
封剂封片，用DMI4000荧光显微镜拍照观察。将完整的淡蓝色细胞核(H0+/PI-)、浓缩或断裂的深蓝色细胞核(HP++/PI-)、浓缩或断裂的粉红色细胞核(H0++/PI++)、完整的粉红色细胞核(H0+/PI++)分别定义为存活、早期凋亡、晚期凋亡、坏死细胞。每组实验取四个不同视野的共500个细胞进行统计分析。H0/PI双染实验表明，KSK-CpG与1826-CpG在IOug- mL—1的浓度下均可诱导肿瘤细胞A20发生凋亡(图2)。
利用DNA fragmentation实验检测DNA断裂是否参与了 CpG-ODN所介导的细胞凋亡。具体实验方法为离心收集细胞，PBS洗涤，用400 ii L裂解液(IOmMTris pH8. OUOmMNaCl、IOmM EDTA、质量百分百比1%的SDS和100 u g mr1的蛋白酶K)在65°C孵育过夜，加入75 u L乙酸钾(浓度为8M)并在4°C孵育15分钟，加入750 y L氯仿，剧烈震荡后用12000 X g在室温离心10分钟，将上清液转入新的离心管中，并加入750 L乙醇在-20°C孵育过夜，12000Xg离心10分钟获得DNA沉淀，干燥后溶解于50ii L TE缓冲液(IOmM Tris-HCl,ImMEDTA, pH8. 0)，用质量百分比2. 0%的琼脂糖凝胶进行电泳。实验结果表明与对照及Non-CpG相比，KSK-CpG与1826-CpG均可有效导致A20细胞的DNA断裂(图3)。用Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen,SanDiego，CA，USA)检测了细胞凋亡情况，具体实验方法参照试剂盒说明书进行。结果表明，KSK-CpG可以剂量依赖性地促进A20细胞发生凋亡(图4 5)。上述研究结果表明，KSK-CpG可通过诱导凋亡而发挥对B淋巴瘤细胞A20的直接杀伤效应。实施例4 =KSK-CpG可降低A20肿瘤细胞的线粒体膜电位 为进一步验证线粒体功能失调是否参与了 KSK-CpG介导的A20细胞凋亡过程，将肿瘤细胞(小鼠B淋巴瘤A20细胞株)用KSK-CpG (0 10 y g mL—1)培养3天，用JC-I(Molecular Probes)染色及流式细胞术检测了 KSK-CpG对A20细胞中线粒体膜电位的影响。具体实验方法为JC-I粉末用二甲基亚砜溶解成5mg mr1的存储液，将肿瘤细胞用lug* mL—1的JC-I在37°C避光孵育15分钟，洗涤，重新悬浮于500 u LPBS中，将细胞用流式细胞仪(CytomicsTM FC500, Beckman Coulter)分析,线粒体膜电位用红色突光与绿色突光的比值来表示。结果表明，KSK-CpG能够剂量依赖性地降低肿瘤细胞A20的线粒体膜电位(图6)。实施例5 =KSK-CpG诱导A20肿瘤细胞周期阻滞在Gl期Akt, Erk, p38等激酶通常经过介导细胞周期蛋白Dl而参与不同种类细胞的周期调控及增殖效应。因此，使用Western blotting进一步检测了 CpG-ODN对A20肿瘤细胞中上述激酶活性的影响。具体实验方法请参照文献(Xu-Feng Qi, Dong-HeuiKim, Yang-Suk Yoon, Jian-Hong Li, Soon-Bong Song, Dan Jin, Xue-Zhu Huang, Yung-ChienTeng, Kyu-Jae Lee. The adenylyl cyclase-cAMP system suppresses TARC/CCL17andMDC/CCL22production through p38MAPK and NF-k B in HaCaT keratinocytes. MolImmunol, 2009，46(10) : 1925-1934.)执行。结果表明，Non-CpG、KSK-CpG、1826-CpG 均对磷酸化的Akt与p38无明显作用，然而，KSK-CpG与1826-CpG均可显著抑制磷酸化的Erk活性，而且，KSK-CpG可呈剂量依赖性地抑制磷酸化的Erk活性(图7A)。既往研究表明，CpG ODN可诱导肿瘤细胞凋亡并使细胞周期阻滞在Gl期。因此，对KSK-CpG对肿瘤细胞A20细胞周期的影响进行检测。具体实验方法为收集细胞，用预冷的PBS洗涤，用体积百分比75%的乙醇在-20°C固定过夜，PBS洗涤，用RNase A(25 u g mlT1, Bio Basic Inc. , Markham, Ontario, Canada)在 37°C孵育 30 分钟，PBS 洗漆后用碘化丙唳(Propidium Iodide, 50 u g ml/1)在室温下避光孵育30分钟,将细胞重新悬浮于500 ii LPBS中，用流式细胞仪(CytomicsTM FC500, Beckman Coulter)分析,结果用ModFit LT3. 2软件(Verity Software House, USA)进行分析。流式细胞仪分析结果表明，KSK-CpG能够剂量依赖性地(0 10 ii g mr1)显著诱导A20细胞凋亡，并显著地使细胞周期阻滞在Gl期，并伴随有S期与G2/M期细胞数量的显著降低(图7B和C)。实施例6 =KSK-CpG调控凋亡相关信号传导通路及TLR9基因表达的实验为了进一步检测KSK-CpG诱导淋巴瘤细胞A20凋亡的内在分子机制，通过Westerblotting技术检测了凋亡相关蛋白分子的活性。具体实验方法请参照文献(Xu-FengQi, Dong-Heui Kim, Yang-Suk Yoon, Jian-Hong Li, Soon-Bong Song,Dan Jin,Xue-ZhuHuang, Yung-Chien Teng, Kyu-Jae Lee. The adenylyl cyclase—cAMP system suppressesTARC/CCL17and MDC/CCL22production through p38MAPK and NF-k B in HaCaTkeratinocytes. Mol Immunol, 2009, 46(10) :1925-1934.)执行。结果表明，KSK-CpG 与1826-CpG在10 u g ml/1浓度下可显著增强A20细胞中Caspase_3、PARP及Bax等促凋亡相关蛋白的活性，并明显抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的活性；然而，CpG ODN对EL4细胞中凋亡相关蛋白并无明显的作用(图8A)。 而且，KSK-CpG能够剂量依赖性地上调A20细胞中凋亡相关蛋白的活性及Caspase-3蛋白的活性(图8B C)，而KSK-CpG介导的A20细胞死亡可以被z_DEVD_FMK(促凋亡蛋白Caspase-3的特异性抑制剂)显著抑制(图8D)，说明凋亡效应在KSK-CpG诱导的A20细胞死亡过程中起到了关键作用。通过RT-PCR技术检测了 A20细胞与EL4细胞中TLR9的mRNA表达情况。具体实验方法为用 TRI reagent (Molecular Research Center Inc.，Cincinnati, USA)提取细胞的总 RNA,用 A260 与 A280 检测其质量,用 Prime RT Premix kit (GeNet Bio, Chungnam, Korea)合成cDNA，所用PCR引物序列为TLR9上游引物为5’ -GAC TTA CTG TTG GAG GTG CAGACC-3’，TLR9 下游引物为 5’ -GAACAC CAC GAA GGC ATC ATA GG-3’ ; 3-actin 上游引物为5，-GCA CCA CACCTT CTA CAA TGA G_3’，P-actin 下游引物为 5，-TTG GCA TAG AGG TCTTTACGG A_3’。PCR 反应用 Prime Taq Premix kit (GeNet Bio, Chungnam, Korea)试剂盒完成，反应程序为94°C预变性5分钟；94°C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸I分钟，30个循环；72°C延伸7分钟。PCR产物用质量百分比2%的琼脂糖凝胶进行电泳并拍照。结果表明，在A20细胞中存在TLR9的内源性表达，其表达水平可进一步被KSK-CpG或1826-CpG所增强。然而，无论在CpG ODN处理或静息的EL4细胞中，均未检测到TLR9的表达(图9A)。为了进一步验证TLR9是否参与了 KSK-CpG所介导的A20细胞凋亡过程，通过检测氯喹(TLR9的抑制剂)对KSK-CpG诱导A20细胞凋亡的影响。结果表明，氯喹(2ii g mL—1)可显著抑制KSK-CpG所介导的A20细胞凋亡效应(图9B)。上述结果说明，TLR9通路至少部分参与了KSK-CpG诱导的A20细胞凋亡过程。实施例7 =KSK-CpG诱导A20细胞产生的细胞因子及其功能实验目前，众多体内外研究结果表明，CpG-ODN能够诱导细胞产生多种细胞因子如IFN-Y和TNF-a，进而影响多种不同细胞的功能。因此，本发明最后检测了 IFN-Y和TNF- a在CpG-ODN (IOu g mL—1，24h)处理的A20细胞中的表达与分泌情况。具体实验方法为用 TRI reagent (Mo lecular Research Center Inc.，Cincinnati, USA)提取细胞的总RNA,用 A260 与 A280 检测其质量,用 Prime RT Premix kit (GeNet Bio, Chungnam, Korea)合成cDNA，所用PCR引物序列为INF-Y上游引物为5’-CTC AAG TGG CAT AGA TGT-3，，INF-y 下游引物为 5’-GAG ATA ATC TGG CTC TGC AGG ATT_3，;TNF-a 上游引物为 5’-CACCACGCT CTT CTG TCT ACT GAA C_3’，TNF-a 下游引物为 5’-CCG GAC TCC GTGATG TCTAAG TAC T-3，; 3-actin 上游引物为 5’-GCA CCA CAC CTT CTA CAATGA G_3，，^ -actin下游引物为 5’-TTG GCA TAG AGG TCT TTA CGG A_3’。PCR 反应用 Prime Taq Premix kit(GeNet Bio, Chungnam, Korea)试剂盒完成，反应程序为94°C预变性5分钟；94°C变性30秒、55-60°C退火30秒、72°C延伸I分钟，30个循环；72°C延伸7分钟。PCR产物用质量百分比2%的琼脂糖凝胶进行电泳并拍照，分析电泳条带亮度。结果表明，KSK-CpG和1826-CpG均可显著促进A20细胞中IFN- y和TNF- a的mRNA表达水平(图10A)。为进一步验证细胞因子IFN-Y和TNF-a对A20细胞功能的影响，本发明用不同浓度的IFN-Y或TNF-a (0 20ng ml/1)处理A20细胞3天，随后用EZ-CyToxCellViability Assay Kit检测细胞活性,具体实验方法如上所述。结果表明，IFN-Y可显著抑制A20细胞的活性，且呈剂量依赖关系；然而，TNF- a对A20细胞的活性没有明显作用(图10B)。用ELISA 试剂盒(Mouse IFN-gamma Quantikine ELISA Kit, R&D System, USA)检测了细胞上清中IFN-Y的分泌情况，具体实验方法参照试剂盒的说明书进行。检测结果表 明，KSK-CpG可呈剂量依赖性地显著增强A20细胞中IFN-Y的分泌水平(图10C)。上述结果说明，细胞因子IFN-Y可能参与了 KSK-CpG诱导的A20细胞凋亡过程。通过DNA fragmentation实验检测DNA的断裂情况,具体实验方法同实施例3。实验结果表明，细胞因子IFN- y可剂量依赖性地诱导A20细胞发生DNA断裂及凋亡现象(图10D)。为了进一步验证自分泌的IFN-Y在KSK-CpG诱导的A20细胞凋亡过程中的作用，本发明单独用KSK-CpG或将其与IFN-Y抗体共同孵育A20细胞，并进行DNAfragmentation检测。结果表明，IFN- y抗体可显著抑制KSK-CpG诱导的DNAfragmentation(图10E)。上述研究结果说明，自分泌IFN-Y至少部分地参与了 CpG-ODN所介导的A20细胞凋亡过程。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.CpG-ODN在制备促淋巴瘤细胞凋亡药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的CpG-ODN在制备促淋巴瘤细胞凋亡药物中的应用，其特征在于所述的CpG-ODN为KSK-CpG，KSK-CpG的核苷酸序列如下所示5 ' -TCGTCGTTTTCGTCGTCGTTTT-3'。
3.根据权利要求I所述的CpG-ODN在制备促淋巴瘤细胞凋亡药物中的应用，其特征在于所述的促淋巴瘤细胞凋亡药物以KSK-CpG为有效成分，通过抑制Erk活性，引起细胞周期阻滞在Gl期，下调线粒体膜电位水平，诱导DNA断裂，增强促凋亡相关蛋白如CaSpaSe3、PARP.Bax的活性，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的活性，促进细胞因子IFN-Y的表达与分泌及促进TLR9的表达，促进淋巴瘤细胞的凋亡。
4.根据权利要求I所述的CpG-ODN在制备促淋巴瘤细胞凋亡药物中的应用，其特征在于所述的淋巴瘤细胞为小鼠B淋巴瘤A20细胞株。
全文摘要
本发明公开了CpG-ODN在制备促淋巴瘤细胞凋亡药物中的应用。该CpG-ODN为KSK-CpG，序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次提出KSK-CpG无需经过宿主免疫系统而可以直接杀伤、杀死B淋巴瘤细胞，并量化分析了KSK-CpG多方面的促淋巴瘤细胞A20凋亡的活性，阐明了KSK-CpG可通过激活TLR9信号通路、促进细胞因子IFN-γ的自分泌等途径，直接诱导B淋巴瘤细胞A20发生凋亡，且其活性明显高于传统的1826-CpG。本发明提供了KSK-CpG促B淋巴瘤细胞凋亡功能新的认识，并表明KSK-CpG的使用将为B细胞淋巴瘤的治疗提供一种新的治疗策略。
文档编号A61K48/00GK102961758SQ20121044251
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者齐绪峰, 金寿起, 李奎在, 蔡冬青, 秦俊文, 禹艳红, 武征 申请人:暨南大学