专利名称：靶向小胶质细胞的miR-21复合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种多肽-基因复合物，还涉及该复合物的制备方法和在制药领域中的应用。
背景技术：
小胶质细胞作为中枢神经系统免疫防疫的第一道防线，在炎症反应中起重要作用。当有外来病原体入侵或有细胞死亡，小胶质细胞会迅速被激活并将其清除，同时释放炎症因子介导炎症反应。但有研究表明，过度活化的小胶质细胞可能加速某些中枢神经系统疾病的进程，而其释放的细胞毒性因子也会对神经细胞造成进一步的损伤。因此，适当抑制小胶质细胞的活性可能是治疗中枢神经系统疾病的有效途径。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类约21-25个核苷酸的非编码RNA分子，普遍存在于真核生物中，不编码蛋白质或多肽，而是与靶基因的信使RNA (mRNA) 3’非翻译区互补结合，导致靶基因mRNA的降解或翻译抑制，从而实现转录后基因调控作用。近年来，miRNA与神经系统疾病的发病关系越来越受重视。miRNA已被证实参与了神经细胞的发育与分化、细胞活化及应答调控等过程，并且与神经系统有关疾病的发生发展密切相关。例如，在缺血缺氧引发的小胶质细胞介导的炎症反应中，小胶质细胞特定miRNA会发生表达改变，调控宿主细胞的基因表达，应对微环境做出相应的反应，从而参与疾病的发生与发展。因此，miRNA在小胶质细胞介导的中 枢神经系统疾病的治疗领域可能具有极为广阔的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种miR-21复合物，该复合物可以特异靶向小胶质细胞，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的发生或恶化。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案1.靶向小胶质细胞的miR-21复合物，由K9肽和S9肽的融合肽与miR-21通过静电作用结合而成，所述K9肽的氨基酸序列为KKKKKKKKK (Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys),所述 S9 妝的氨基酸序列为 VVMKFLTQQ (Val-Val-Met-Lys-Phe-Leu-Thr-Gln-Gln) 进一步，所述K9肽和S9肽的融合肽由K9肽的羧基端和S9肽的氨基端直接连接。2.靶向小胶质细胞的miR-21复合物的制备方法，是在涡旋条件下，向含有miR-21和氯化钠的水溶液中滴加K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴毕，继续涡旋2(Γ60分钟，再静置2(Γ60分钟，即得靶向小胶质细胞的miR-21复合物。进一步，所述miR-21与K9肽和S9肽的融合肽的质量比为2. 5:1。进一步，所述靶向小胶质细胞的miR-21复合物的制备方法是在涡旋条件下，向含有浓度为500 μ g/mL的miR-21和浓度为lmg/mL的氯化钠的水溶液中，滴加等体积浓度为200 μ g/mL的K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴加完毕后，继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得靶向小胶质细胞的miR-21复合物。3.靶向小胶质细胞的miR-21复合物在制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的药物中的应用。本发明的有益效果在于K9肽为带正电荷的短肽，可通过电性中和作用与带负电荷的miRNA聚合形成致密颗粒，提高细胞对miRNA的摄取率，增强转染效率。CX3CR1受体在中枢神经系统中主要在小胶质细胞上表达，来源于US28受体N末端的诱惑配体多肽S9可以阻断人源CX3CR1受体结合生理性趋化因子形成的趋化作用，但其本身不引起趋化运动，不影响胞内信号转导和细胞自然活性。本发明所述miR-21复合物可通过S9肽的导向作用，特异靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体，在S9肽与CX3CR1受体作用的同吋，miR-21高效转染入小胶质细胞，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的发生或恶化，可用于制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的药物，在神经系统疾病治疗领域有着良好的开发应用前景。
图1为透射电镜鉴定miR-21复合物。图2为miR-21复合物转染的小胶质细胞活化后细胞因子的分泌水平。图3为miR-21复合物转染的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、靶向小胶质细胞的miR-21复合物的制备1、K9肽和S9肽的融合肽K9-S9的制备
融合肽K9-S9由K9肽的羧基端与S9肽的氨基端直接连接而成，氨基酸序列为KKKKKK-KKKVVMKFLTQQ (SEQ ID No.1)。融合肽K9-S9的合成在AB-431A型多肽合成仪上进行，采用标准Fmoc方案。以
0.25mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯こ烯(HMP)树脂为起始树脂，按照融合肽K9-S9的氨基酸序列，使肽链自羧基端向氨基端逐个延伸，肽链合成完毕后，将含有肽链的树脂转移至切割液(由酒石酸こニ胺0. 25mL、三氟こ酸9. 5mL和去离子水0. 25mL组成)中，室温下搅拌反应使肽链从树脂上裂解下来，然后用G6玻砂漏斗过滤，收集滤液，室温下低压蒸干，残余物用去离子水溶解后，用Akta explorer 100型中压液相色谱仪进行纯化，色谱柱为C18柱，流动相A为质量分数为0. 1%的三氟こ酸水溶液，流动相B为质量分数为0. 1%的三氟こ酸こ腈溶液，ニ元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在(T15分钟内由10%上升至50%，流速为lmL/min,收集融合肽K9-S9的洗脱液，冷冻干燥，即得融合肽K9-S9，用去离子水溶解制成浓度为3mg/mL的溶液，用孔径为0. 20 y m的微孔滤膜过滤除菌，_70°C冻存备用。取融合肽K9-S9的洗脱液，用Delta 600型反相高压液相色谱仪进行纯度鉴定，色谱柱为Symmetry C18柱，流动相A为质量分数为0. 1%的三氟こ酸水溶液，流动相B为质量分数为0. 1%的三氟こ酸こ腈溶液，ニ元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在(T15分钟内由10%上升至60%，流速为lmL/min。结果经峰面积归ー化法计算，融合肽K9-S9的纯度为98%。另取融合肽K9-S9的洗脱液，用API 2000 LC/MS/MS型质谱仪进行分子量鉴定，结果显示，融合肽K9-S9的分子量实测值与理论值相符。2、miR-21复合物的制备
miR-21 的核苷酸序列为5’ -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’ (SEQ ID No. 2)。于室温、涡旋条件下，向100 ii L含有浓度为500 u g/mL的miR-21和浓度为lmg/mL的NaCl的水溶液中，滴加100 u L浓度为200 u g/mL的融合肽K9-S9溶液，滴加速度为5 u L/min,滴加完毕后，于室温下继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得miR-21复合物。将新鲜制备的miR-21复合物滴于200目铜网上，吸附3分钟，用吸水纸吸干，晾干30秒，以质量分数为1%的醋酸铀水溶液负染30秒,用吸水纸吸干，晾干30秒,80kV透射电镜观察。结果如图1所示，所得miR-21复合物呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于25nm。同时，按照上述相同方法，以无关序列5’ -CUUAUAGUGACUUGAUGUCAGA-3’ (SEQ IDNo. 3)替代miR-21，制得阴性对照复合物。ニ、靶向小胶质细胞的miR-21复合物的活性测试1、miR-21复合物转染小胶质细胞
将小胶质细胞BV-2于6 孔板内单层培养至覆盖面积约30%，换入无血清DMEM培养基2mL，并加入miR-21复合物100 u L，培养4小时，再换入完全DMEM培养基2mL，培养48小时，收集细胞，用PBS洗涤并重悬，获得miR-21复合物转染的小胶质细胞。同时，按照上述相同方法，采用阴性对照复合物，获得阴性对照复合物转染的小胶质细胞。另外，分别将miR-21复合物和阴性对照复合物转染少突胶质细胞HO，作为无关细胞对照。2、ELISA检测miR-21复合物转染的小胶质细胞活化后细胞因子的分泌水平 设置空白组(正常小胶质细胞BV-2)、对照组(阴性对照复合物转染的小胶质细胞)和实
验组(miR-21复合物转染的小胶质细胞)。取各组细胞，以4X IO5/孔种植于24孔板中，向细胞培养液中加入脂多糖(LPS)至终浓度为IOii g/mL，刺激0. 5小时，之后弃去含LPS的细胞培养液并洗涤细胞2次，再加入DMEM培养基lmL，继续培养24小吋，吸取细胞培养液，用ELISA试剂盒测定白细胞介素-13 (IL-1 @ )和肿瘤坏死因子a (TNF_a)的含量。结果如图2所示，miR-21复合物可以明显降低活化的小胶质细胞分泌细胞因子IL-1 ^和TNF-a的水平。3、检测miR-21复合物转染的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平
将少突胶质细胞HO用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基体外培养，收集细胞，离心洗涤2次，再用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为I X 106/mL,取ImL细胞悬液置IOmL血清瓶中，加入100 u Ci的Na51CrO4,37°C孵育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的51Cr,再用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度为I X 105/mL,作为靶细胞。在96孔U型板中，设置空白组(以正常小胶质细胞BV-2作为效应细胞)、对照组(以阴性对照复合物转染的小胶质细胞作为效应细胞)、实验组(以miR-21复合物转染的小胶质细胞作为效应细胞)、最大释放组(用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞)和最小释放组(用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基替代效应细胞)，每组设3个复孔，各孔按效靶比(E/T)为1:1加入效应细胞与靶细胞，500r/min离心30秒后，37°C孵育4小时，再1000r/min离心10分钟，各孔取上清IOOy L，用Y计数器測定每分钟放射活性(cpm值)，再按下述公式计算杀伤率杀伤率(%)=[(相应组cpm均值-最小释放组cpm均值)/ (最大释放组cpm均值-最小释放组cpm均值)]X 100%,杀伤率大于15%判为特异性杀伤。结果如图3所示，miR-21复合物可以明显降低活化的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过參照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对 其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.靶向小胶质细胞的rniR-21复合物，其特征在于，由K9肽和S9肽的融合肽与miR-21通过静电作用结合而成，所述K9肽的氨基酸序列为KKKKKKKKK，所述S9肽的氨基酸序列为VVMKFLTQQo
2.根据权利要求1所述的靶向小胶质细胞的miR-21复合物，其特征在于，所述K9肽和S9肽的融合肽由K9肽的羧基端和S9肽的氨基端直接连接而成。
3.权利要求1或2所述的靶向小胶质细胞的miR-21复合物的制备方法，其特征在于，在涡旋条件下，向含有miR-21和氯化钠的水溶液中滴加K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴毕，继续涡旋2(Γ60分钟，再静置2(Γ60分钟，即得靶向小胶质细胞的miR-21复合物。
4.根据权利要求3所述的靶向小胶质细胞的miR-21复合物的制备方法，其特征在于，所述miR-21与K9肽和S9肽的融合肽的质量比为2. 5:1。
5.根据权利要求4所述的靶向小胶质细胞的miR-21复合物的制备方法，其特征在于，在涡旋条件下，向含有浓度为500 μ g/mL的miR-21和浓度为lmg/mL的氯化钠的水溶液中，滴加等体积浓度为200 μ g/mL的K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴加完毕后，继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得靶向小胶质细胞的miR-21复合物。
6.权利要求1或2所述的靶向小胶质细胞的miR-21复合物在制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种靶向小胶质细胞的miR-21复合物，由K9肽(KKKKKKKKK)和S9肽(VVMKFLTQQ)的融合肽与miR-21通过静电作用结合而成，该复合物可利用S9肽的导向作用，特异靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体，在S9肽与CX3CR1受体作用的同时，miR-21高效转染入小胶质细胞，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的发生或恶化，可用于制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的药物，在神经系统疾病治疗领域有着良好的开发应用前景。
文档编号A61K48/00GK103028121SQ20121058415
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月30日 优先权日2012年12月30日
发明者杨曌, 杨清武 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院