专利名称：具有靶向性的多肽-基因复合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种多肽-基因复合物，还涉及该复合物的制备方法和在制药领域中的应用。
背景技术：
小胶质细胞作为中枢神经系统免疫防疫的第一道防线，在炎症反应中起重要作用。当有外来病原体入侵或有细胞死亡，小胶质细胞会迅速被激活并将其清除，同时释放炎症因子介导炎症反应。但有研究表明，过度活化的小胶质细胞可能加速某些中枢神经系统疾病的进程，而其释放的细胞毒性因子也会对神经细胞造成进一步的损伤。因此，适当抑制小胶质细胞的活性可能是治疗中枢神经系统疾病的有效途径。低氧诱导因子-1 a (HIF-1 α )是目前发现的唯一特异在低氧条件下发挥作用的核转录因子，可调控多种低氧反应基因的转录，参与低氧反应信号转导过程，调控生物体内的氧平衡，对机体器官或局部组织适应低氧环境具有重要作用。目前已知直接受HIF-Ια调控的基因有60余种，涉及到血管发生、红细胞生成、能量代谢、细胞增殖和细胞凋亡等多个方面。大量研究表明，与常氧环境相比，低氧可以诱导小胶质细胞N9的HIF-Ια表达上调，增强小胶质细胞的活化，导致中枢神经系统疾病的发生。因此，如果能够有效干扰HIF-1 α的表达，则理论上可以抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的发生或恶化。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种具有靶向性的多肽-基因复合物，该复合物可以成功靶向小胶质细胞，干扰HIF-1 α的表达，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的发生或恶化。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案1.具有靶向性的多肽-基因复合物，由HIV-Tat49-57肽和V9肽的融合肽与HIF-1 αshRNA载体通过静电作用结合而成，所述HIV-Tat49-57肽的氨基酸序列为RKKRRQRRR(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg),所述 V9 肽的氨基酸序列为 LTQQMKFVV(Leu-Thr-Gln-Gln- Met-Lys-Phe-Val-Val)。进一步，所述HIV-Tat49_57肽和V9肽的融合肽由HIV_Tat49_57肽的羧基端和V9肽的氨基端直接连接而成。进一步，所述HIF-1a shRNA载体中含有正义链如SEQ ID No. 2所示、反义链如SEQ ID No. 3所示的双链寡核苷酸片段。进一步，所述HIF-1 a shRNA载体是将正义链如SEQ ID No. 2所示、反义链如SEQ ID No. 3所示的双链寡核苷酸片段正向插入到pSilencer 2. l_U6neo载体的和Hindlll位点之间而得。2.具有靶向性的多肽-基因复合物的制备方法，是在涡旋条件下，向含有HIF-1 ashRNA载体和氯化钠的水溶液中滴加HIV-Tat49-57肽和V9肽的融合肽溶液，滴毕，继续涡旋2(Γ60分钟，再静置2(Γ60分钟，即得具有靶向性的多肽-基因复合物。进一步，所述HIF-1 a shRNA载体与HIV_Tat49_57肽和V9肽的融合肽的质量比为 2. 5:1。进一步，所述具有靶向性的多肽-基因复合物的制备方法是在涡旋条件下，向含有浓度为500 μ g/mL的HIF-1 a shRNA载体和浓度为lmg/mL的氯化钠的水溶液中，滴加等体积浓度为200 μ g/mL的HIV-Tat49-57肽和V9肽的融合肽溶液，滴加完毕后，继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得具有靶向性的多肽-基因复合物。进一步，所述HIF-1a shRNA载体的制备方法是先将正义链如SEQ ID No. 2所示、反义链如SEQ ID No. 3所示的I对互补单链寡核苷酸片段退火形成双链寡核苷酸片段，再将所得双链寡核苷酸片段与经及丽TI和历ii/III双酶切处理的pSilencer 2. l_U6neo载体 连接，即得HIF-1 a shRNA载体。3.具有靶向性的多肽-基因复合物在制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的药物中的应用。本发明的有益效果在于来源于人类免疫缺陷病毒I型的穿膜肽HIV-Tat49_57为带正电荷的短肽，可通过电性中和作用与带负电荷的HIF-1 a shRNA载体聚合形成致密颗粒，提高细胞对HIF-1 a shRNA载体的摄取率，增强转染效率。CX3CR1受体在中枢神经系统中主要在小胶质细胞上表达，来源于US28受体N末端的诱惑配体多肽V9可以阻断人源CX3CR1受体结合生理性趋化因子形成的趋化作用，但其本身不引起趋化运动，不影响胞内信号转导和细胞自然活性。本发明所述多肽-基因复合物可通过V9肽的导向作用，特异靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体，在V9肽与CX3CR1受体作用的同时，HIF-1 a shRNA载体高效转染入小胶质细胞，干扰HIF-1 α的表达，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的发生或恶化，可用于制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的药物，在神经系统疾病治疗领域有着良好的开发应用前景。
图1为透射电镜鉴定多肽-基因复合物HIV-Tat49_57/V9 & pSilencer 2.1/HIF-1 a shRNA。图2 为 RT-PCR 检测多肽-基因复合物 HIV_Tat49_57/V9 & pSilencer 2.1/HIF-1 a shRNA转染的小胶质细胞中HIF-1 a mRNA的表达水平，其中I为空白组，2为对照组，3为实验组。图3为免疫印迹法检测多肽-基因复合物HIV-Tat49_57/V9 & pSilencer 2.1/HIF-1 a shRNA转染的小胶质细胞中HIF-1 α的表达水平，其中I为空白组，2为对照组，3为实验组。图4为ELISA检测多肽-基因复合物HIV-Tat49_57/V9& pSilencer 2. 1/HIF-1 αshRNA转染的小胶质细胞活化后细胞因子的分泌水平。图5 为多肽-基因复合物 HIV-Tat49_57/V9 & pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA 转染的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、具有靶向性的多肽-基因复合物的制备
1、HIV-Tat49_57 肽和 V9 肽的融合肽 HIV_Tat49_57/V9 的制备 融合肽HIV-Tat49-57/V9由HIV_Tat49_57肽的羧基端与V9肽的氨基端直接连接而成，氨基酸序列为 RKKRRQRRRLTQQMKFVV (SEQ ID No.1)。融合肽HIV-Tat49_57/V9的合成在AB_43 IA型多肽合成仪上进行，采用标准Fmoc方案。以O. 25mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂为起始树脂，按照融合肽HIV-Tat49-57/V9的氨基酸序列，使肽链自羧基端向氨基端逐个延伸，肽链合成完毕后，将含有肽链的树脂转移至切割液(由酒石酸乙二胺O. 25mL、三氟乙酸9. 5mL和去离子水
O.25mL组成)中，室温下搅拌反应使肽链从树脂上裂解下来，然后用G6玻砂漏斗过滤，收集滤液，室温下低压蒸干，残余物用去离子水溶解后，用AKTA explorer 100型中压液相色谱仪进行纯化，色谱柱为C18柱,流动相A为质量分数为O. 1%的三氟乙酸水溶液,流动相B为质量分数为O. 1%的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在(Γ15分钟内由10%上升至50%，流速为lmL/min，收集融合肽HIV_Tat49_57/V9的洗脱液，冷冻干燥，即得融合肽HIV-Tat49-57/V9，用去离子水溶解制成浓度为3mg/mL的溶液，用孔径为
O.20 μ m的微孔滤膜过滤除菌，_70°C冻存备用。取融合肽HIV-Tat49_57/V9的洗脱液，用Delta 600型反相高压液相色谱仪进行纯度鉴定，色谱柱为Symmetry C18柱，流动相A为质量分数为O. 1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为质量分数为O. 1%的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在(Γ15分钟内由10%上升至60%,流速为lmL/min。结果经峰面积归一化法计算，融合肽HIV-Tat49-57/V9 的纯度为 99%。另取融合肽 HIV_Tat49_57/V9 的洗脱液，用 API 2000 LC/MS/MS型质谱仪进行分子量鉴定，结果显示，融合肽HIV-Tat49-57/V9的分子量实测值与理论值相符。2、HIF-1a shRNA 干扰载体 pSilencer 2. 1/HIF-1 α 的构建
根据NCBI GenBank上公开的AHIF-1a基因序列(NCJ)OOO 14. 8)和shRNA的设计原则，先筛选出针对HIF-1 a mRNA不同剪接子的RNAi作用的公共靶点，再根据该公共靶点，设计并合成I对互补并编码shRNA的单链寡核苷酸片段正义链5 ' -ccccgtcaatttatgaatatt-3 ' (SEQ ID No. 2),反义链5' -tattcataaattgagcccctt-3' (SEQ ID No. 3)。将上述单链寡核苷酸片段分别用双蒸水溶解制成浓度为100 μ mol/L的溶液，再各取5 μ L混合，退火形成双链寡核苷酸片段，在Τ4DNA连接酶的作用下与经和//iflt/III双酶切的pSilencer 2. l_U6neo载体(Ambion公司)连接，连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，挑选氨苄青霉素抗性菌落，扩增培养后，将菌液送武汉晶赛生物工程技术有限公司进行插入片段测序，测得序列与设计序列一致者即为成功构建的 HIF-1 a shRNA 载体 pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA。同时，设计并合成I对互补但与人类基因组序列无任何匹配的单链寡核苷酸片段作为阴性对照正义链5 ' -ttctccgaacgtgtcacgttt-3 ' (SEQ ID No. 4),反义链:5' -acgtga-cacgttcggagaatt-3' (SEQ ID No. 5)。再按照上述相同方法构建阴性对照shRNA载体。3、多肽-基因复合物 HIV-Tat49_57/V9 & pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA 的制备 于室温、涡旋条件下，向100 μ L含有浓度为500 μ g/mL的HIF-1 a shRNA载体
pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA和浓度为lmg/mL的NaCl的水溶液中，滴加100 μ L浓度为200 μ g/mL的融合肽HIV-Tat49-57/V9溶液，滴加速度为5 μ L/min,滴加完毕后，于室温下继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得多肽-基因复合物HIV-Tat49-57/V9 & pSilencer
2.1/HIF-la shRNA。
将新鲜制备的多肽-基因复合物HIV-Tat49_57/V9 & pSilencer 2. 1/HIF-l αshRNA滴于200目铜网上，吸附3分钟，用吸水纸吸干，晾干30秒，以质量分数为1%的醋酸铀水溶液负染30秒,用吸水纸吸干，晾干30秒，80kV透射电镜观察。结果如图1所示，所得多肽-基因复合物呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于25nm。同时，按照上述相同方法，以阴性对照shRNA载体替代HIF-1 a shRNA载体，制备阴性对照多肽-基因复合物。二、具有靶向性的多肽-基因复合物的活性测试1、多肽-基因复合物转染小胶质细胞
将小胶质细胞BV-2于6孔板内单层培养至覆盖面积约30%，换入2mL无血清DMEM培养基，并加入10(^1^多肽-基因复合物!11￥-了3七49-57/￥9 & pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA,培养4小时，再换入2mL完全DMEM培养基，培养48小时，收集细胞，用PBS洗涤并重悬，获得多肽-基因复合物HIV-Tat49-57/V9 & pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA转染的小胶质细胞。同时，按照上述相同方法，采用阴性对照多肽-基因复合物，获得阴性对照多肽-基因复合物转染的小胶质细胞。另外，分别将多肽-基因复合物HIV-Tat49_57/V9 & pSilencer 2. 1/HIF-l αshRNA和阴性对照多肽-基因复合物转染少突胶质细胞HO，作为无关细胞对照。2,RT-PCR检测多肽-基因复合物转染的小胶质细胞中HIF_1 a mRNA的表达水平 设置小胶质细胞空白组(正常小胶质细胞BV-2 )、小胶质细胞对照组(阴性对
照多肽-基因复合物转染的小胶质细胞)、小胶质细胞实验组(多肽-基因复合物HIV-Tat49-57/V9 & pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA 转染的小胶质细胞)、少突胶质细胞空白组(正常少突胶质细胞HO)、少突胶质细胞对照组(阴性对照多肽-基因复合物转染的少突胶质细胞)、少突胶质细胞实验组(多肽-基因复合物HIV-Tat49-57/V9 & pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA转染的少突胶质细胞)。取各组细胞，用TRIzol试剂提取细胞总RNA，用反转录试剂盒(QIAGEN公司)反转录为cDNA，再以该cDNA为模板，用上游引物 5 ' -gcaagactttcctcagtcgacaca-3 ' (SEQ ID No. 6)和下游引物5' -gcatcctgtactgtcctgtggtga-3' (SEQ ID No. 7), PCR 扩增长 207 bp 的 HIF-1 α 基因片段，以肌动蛋白(β-actin)为内参照。PCR扩增参数为95°C预变性5分钟；然后94°C变性30秒，58°C退火40秒，72°C延伸30秒，共30个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR扩增产物进行质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照，根据各条带的吸光度，利用GEL-Pro Analyzer软件分析细胞中HIF-1 a mRNA的表达水平。结果如图2所示，多肽-基因复合物HIV-Tat49-57/V9 & pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA可以明显降低小胶质细胞中HIF-1 a mRNA的表达水平，但不能降低少突胶质细胞中HIF-1 a mRNA的表达水平，说明多肽-基因复合物HIV-Tat49-57/V9 & pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA可以特异性靶向转染小胶质细胞。3、免疫印迹法检测多肽-基因复合物转染的小胶质细胞中HIF-1 α的表达水平 设置小胶质细胞空白组(正常小胶质细胞BV-2)、小胶质细胞对照组(阴性对照多
肽-基因复合物转染的小胶质细胞)、小胶质细胞实验组(多肽-基因复合物HIV-Tat49-57/V9 & pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA转染的小胶质细胞)、少突胶质细胞空白组(正常少突胶质细胞HO)、少突胶质细胞对照组(阴性对照多肽-基因复合物转染的少突胶质细胞)、少突胶质细胞实验组(多肽-基因复合物HIV-Tat49-57/V9 & pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA转染的少突胶质细胞)。取各组细胞，用PBS洗涤2次，加入400 μ L细胞裂解液，沸水浴加热5分钟，冰上冷却5分钟，1200g、4°C离心10分钟，取上清液测定总蛋白浓度，再取50 μ g 总蛋白上样，用质量分数为12%的聚丙烯酰胺凝胶于200V恒压下电泳分离50分钟，之后将分离的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，用抗HIF-1 α抗体于4°C孵育过夜，再用辣根过氧化物酶标记的抗体IgG (Abeam公司)室温孵育I小时，再用发光液作用5分钟，置暗盒中曝光5分钟，显影、水洗、定影。结果如图3所示，多肽-基因复合物HIV-Tat49-57/V9& pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA可以明显降低小胶质细胞中HIF-1 α的表达水平，但不能降低少突胶质细胞中HIF-1a的表达水平，说明多肽-基因复合物HIV-Tat49-57/V9 &pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA可以特异性靶向转染小胶质细胞。4、ELISA检测多肽-基因复合物转染的小胶质细胞活化后细胞因子的分泌水平 设置空白组(正常小胶质细胞BV-2)、对照组(阴性对照多肽-基因复合物转染的小胶
质细胞)和实验组(多肽-基因复合物 HIV-Tat49-57/V9 & pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA转染的小胶质细胞)。取各组细胞，以4X IO5/孔种植于24孔板中，向细胞培养液中加入脂多糖(LPS)至终浓度为10μ g/mL，刺激O. 5小时，之后弃去含LPS的细胞培养液并洗涤细胞2次，再加入DMEM培养基lmL，继续培养24小时，吸取细胞培养液，用ELISA试剂盒测定白细胞介素_1β (IL-Ιβ )和肿瘤坏死因子α (TNF-α)的含量。结果如图4所示，多肽-基因复合物HIV-Tat49-57/V9 & pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA可以明显降低活化的小胶质细胞分泌细胞因子IL-1 β和TNF-α的水平。5、检测多肽-基因复合物转染的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平
将少突胶质细胞HO用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基体外培养，收集细胞，离心洗涤2次，再用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为I X 106/mL,取ImL细胞悬液置IOmL血清瓶中，加入100 μ Ci的Na51CrO4,37°C孵育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的51Cr,再用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度为I X 105/mL，作为靶细胞。在96孔U型板中，设置空白组(以正常小胶质细胞BV-2作为效应细胞)、对照组(以阴性对照多肽-基因复合物转染的小胶质细胞作为效应细胞)、实验组(以多肽-基因复合物HIV-Tat49-57/V9 & pSilencer
2.1/HIF-l a shRNA转染的小胶质细胞作为效应细胞)、最大释放组(用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞)和最小释放组(用含有质量百分浓度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基替代效应细胞)，每组设3个复孔，各孔按效靶比(E/T)为1:1加入效应细胞与靶细胞，500r/min离心30秒后，37°C孵育4小时,再1000r/min离心10分钟,各孔取上清100 μ L,用Y计数器测定每分钟放射活性(cpm值)，再按下述公式计算杀伤率杀伤率(%) = [(相应组cpm均值-最小释放组cpm均值)/ (最大释放组cpm均值-最小释放组cpm均值)]X 100%,杀伤率大于15%判为特异性杀伤。结果如图5所示，多肽-基因复合物HIV-Tat49-57/V9 &pSilencer 2. 1/HIF-l a shRNA可以明显降低活化的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.具有靶向性的多肽-基因复合物，其特征在于，由HIV-Tat49-57肽和V9肽的融合肽与低氧诱导因子-1a shRNA载体通过静电作用结合而成，所述HIV-Tat49_57肽的氨基酸序列为RKKRRQRRR，所述V9肽的氨基酸序列为LTQQMKFVV。
2.根据权利要求1所述的具有靶向性的多肽-基因复合物，其特征在于，所述HIV-Tat49-57肽和V9肽的融合肽由HIV_Tat49_57肽的羧基端和V9肽的氨基端直接连接。
3.根据权利要求1所述的具有靶向性的多肽-基因复合物，其特征在于，所述低氧诱导因子-1a shRNA载体中含有正义链如SEQ ID No. 2所示、反义链如SEQ ID No. 3所示的双链寡核苷酸片段。
4.根据权利要求3所述的具有靶向性的多肽-基因复合物，其特征在于，所述低氧诱导因子-1 a shRNA载体是将正义链如SEQ ID No. 2所示、反义链如SEQ ID No. 3所示的双链寡核苷酸片段正向插入到pSilencer 2. l_U6neo载体的和位点之间而得。
5.权利要求1至4任一项所述的具有靶向性的多肽-基因复合物的制备方法，其特征在于，在涡旋条件下，向含有低氧诱导因子-1 a shRNA载体和氯化钠的水溶液中滴加HIV-Tat49-57肽和V9肽的融合肽溶液，滴毕，继续涡旋2(Γ60分钟，再静置2(Γ60分钟，即得具有靶向性的多肽-基因复合物。
6.根据权利要求5所述的具有靶向性的多肽-基因复合物的制备方法，其特征在于，所述低氧诱导因子-1 a shRNA载体与HIV-Tat49-57肽和V9肽的融合肽的质量比为2. 5:1。
7.根据权利要求6所述的具有靶向性的多肽-基因复合物的制备方法，其特征在于，在涡旋条件下，向含有浓度为500 μ g/mL的HIF-1 a shRNA载体和浓度为lmg/mL的氯化钠的水溶液中，滴加等体积浓度为200 μ g/mL的HIV-Tat49-57肽和V9肽的融合肽溶液，滴加完毕后，继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得具有靶向性的多肽-基因复合物。
8.根据权利要求5所述的具有靶向性的多肽-基因复合物的制备方法，其特征在于，所述低氧诱导因子-1a shRNA载体的制备方法是先将正义链如SEQ ID No. 2所示、反义链如SEQ ID No. 3所示的I对互补单链寡核苷酸片段退火形成双链寡核苷酸片段，再将所得双链寡核苷酸片段与经及丽TI和历ii/III双酶切处理的pSilencer 2. l_U6neo载体连接，即得低氧诱导因子-1a shRNA载体。
9.权利要求1至4任一项所述的具有靶向性的多肽-基因复合物在制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有靶向性的多肽-基因复合物，由HIV-Tat49-57肽(RKKRRQRRR)和V9肽(LTQQMKFVV)的融合肽与HIF-1αshRNA载体通过静电作用结合而成，该复合物可利用V9肽的导向作用，特异靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体，在V9肽与CX3CR1受体作用的同时，HIF-1αshRNA载体高效转染入小胶质细胞，干扰HIF-1α的表达，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的发生或恶化，可用于制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的药物，在神经系统疾病治疗领域有着良好的开发应用前景。
文档编号A61K48/00GK103007293SQ201210584158
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月30日 优先权日2012年12月30日
发明者杨曌, 李飞, 胡荣, 储卫华, 冯华 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院