专利名称：表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体，还涉及该载体的构建方法和应用。
背景技术：
乙型肝炎病毒(h印atitis B virus )是引起人类急、慢性肝炎的DNA病毒，也称丹氏颗粒，简称HBV。HBV属嗜肝DNA病毒科(h印adnaviridae)，基因组长约3. 2kb，有四个 0RF,编码以下蛋白Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白和S蛋白(L,M, S)。Core是核衣壳蛋白；X蛋白对病毒复制是重要的，并与肝癌的发生有关；S蛋白是病毒的包膜蛋白，与病毒进入细胞有关。HBV 超螺旋共价、闭合、环状 DNA 分子(covalently closed circularDNA, cccDNA)的持续存在是HBV慢性感染的根源，松弛环状DNA (RC DNA)是cccDNA形成的前体，故阻断RC DNA的合成将致cccDNA减少。研究发现缺失某些序列的突变型rHBV的RC DNA合成效率更高，rHBV与HBV共存于细胞内时，由于rHBV具有如下特性①合成效率高，rHBV将在数量上占优；@rHBV自身不能合成复制所必需的Core、Pol蛋白，需利用野生HBV的Core、Pol蛋白进行复制，从而竞争性抑制野生HBV的复制，但不能完全抑制。因此寻找一种能够完全抑制野生HBV的方法是解决HBV持续慢性感染的关键。
发明内容
本发明的目的之一在于提供表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体，能够依赖野生型HBV进行复制，并且形成RC DNA,为慢性HBV感染的治疗提供了新的工具。为实现上述发明目的，技术方案为
表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体，所述乙型肝炎病毒shRNA表达载体由LJ196载体删除2111-2643位、187-680位或1060-1500位碱基后，在删除序列处替换识别所述删除序列的shRNA转录结构单元而得。优选的,所述shRNA转录结构单元由启动子和shRNA编码序列组成。优选的,所述启动子为Hl启动子。更优选的，所述shRNA 编码序列如 SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 22 或 SEQ ID NO. 25 所示。本发明的目的之二在于提供表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体的制备方法，其制备方法简单，重复性好，技术方案为
所述重组HBV载体的制备方法，根据LJ196载体序列设计引物，然后以LJ196载体为模板，进行PCR扩增，得删除LJ196载体2111-2643位、187-680位和1060-1500位碱基的序列，同时克隆Hl启动子并分别与所得序列连接，环化后在Hl启动子3’端连入识别所述删除序列的shRNA的转录结构单元，得重组HBV载体。优选的，所述引物为SEQ ID NO. 2-7所示的核酸序列。更优选的，所述克隆Hl启动子的具体方法为以SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9所示核酸序列为引物，以PLVTHM质粒为模板，进行PCR扩增，得Hl启动子。本发明的目的之三在于提供乙型肝炎病毒shRNA表达载体的应用，技术方案为 所述重组HBV载体在制备干扰乙型肝炎病毒基因组DNA复制的药物中的应用。本发明有益效果在于本发明公开的重组HBV载体，删除病毒蛋白表达元件，并保留RC DNA合成必须顺式元件，并在删除序列处替代shRNA转录结构单元(由Hl启动子和shRNA序列组成，不足300bp)，用以表达靶向被删除序列的shRNA，使其特异性降解野生型 HBV pgRNA,阻断RC DNA合成及cccDNA的形成；该重组HBV载体依赖野生型HBV复制并且不会整合入宿主基因组中，因此重组HBV载体只能在感染HBV病毒的细胞中存活，在正常细胞中会很快消失，不会影响正常细胞的生长，也不会引起转基因细胞发生突变。重组HBV载体因删除了靶序列而不受RNAi的影响，并能在野生型HBV表达的Core、Pol蛋白辅助下转化为cccDNA，后者持续表达siRNA达到持久抗HBV复制效应①在半衰期方面，野生型HBV cccDNA和rHBV cccDNA相同，同时在肝细胞内可能存在降解cccDNA的未知机制；②在复制效率方面，rHBV高于野生型HBV ;③受RNAi抑制作用方面，野生型HBV在pgRNA水平受到大量降解，RC DNA合成受阻，而rHBV的pgRNA不受RNAi影响，可以合成RC DNA进而形成cccDNA ;在这些效应下，随着肝细胞的分裂，最终野生型HBVcccDNA先于rHBV cccDNA被耗竭，达到治疗乙型肝炎病毒感染的目的。
图1 rHBV载体与LJ96辅助质粒共转染IfepG2细胞后Southern blot结果。图2为rHBV-Hl载体与LJ96辅助质粒共转染H印G2细胞后Southern blot结果图。图3为shRNA541双链结构图。图4为shRNA456双链结构图。图5为shRNA1436双链结构图。图6为shRNA1302双链结构图。图7为shRNA1573双链结构图。图8为rHBV-shRNA表达载体的结构示意图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。本发明中使用的LJ196和LJ96质粒由Daniel D. Loeb教授惠赠，并在公开的文献中有记载(Liu N, Ji L, Maguire ML, Loeb DD. cis-Acting sequences that contributeto the synthesis of relaxed-circular DNA of human hepatitis B virus. J Virol.Jan 2004 ；78(2) :642-649.)。一、缺失突变rHBV构建过程
在不表达任何病毒蛋白的质粒LJ196 (SEQ ID NO.1)的基础上，利用反向PCR技术删除LJ196质粒的DNA片段，使删除后RC DNA合成效率更高。分别删除LJ196的第2111至2643位核苷酸(简记为rHBVl)、删除LJ196的第187至680位核苷酸(简记为rHBV2)、删除LJ196的第1060至1500位核苷酸(简记为rHBV3)、删除LJ196的第2111至2643位核苷酸和1060至1500位核苷酸(简记为rHBVl. 3)、删除LJ196的第2111至2643位核苷酸和187至1500位核苷酸(简记为rHBVl. 23)。rHBV1-3载体的构建方法
设计合成以下引物
HBV187-163 :5’-aggggtcctagggatccttatgtga-3’ (SEQ ID NO. 2)；
HBV1060-1036 :5’-caaaggcatcaacgcaggataacca-3’ (SEQ ID NO. 3)
HBV2111-2087 :5’-agtcattagttccccccagcaaaga-3’ (SEQ ID NO. 4)
HBV680-704 :5’-agtgccatttgttcagtggttcgta-3’ (SEQ ID NO. 5)
HBV1500-1518 :5’-tgccgttccgaccgaccac-3’ (SEQ ID NO. 6)
HBV2643-2667 :5’-attatgcctgccaggttttatccaa-3’ (SEQ ID NO. 7)
按表I引物配对，以LJ196质粒为模板，分别进行反向PCR扩增，PCR扩增条件为94°C预变性2分钟；然后96°C变性15秒，55°C退火30秒，68 °C延伸6分钟40秒，共21个循环。表1.反向PCR扩增引物对
权利要求
1.表达特异性HBVShRNA的重组HBV载体，其特征在于所述表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体由LJ196载体删除2111-2643位、187-680位或1060-1500位碱基后，在删除序列处替换识别所述删除序列的shRNA转录结构单元而得。
2.根据权利要求1所述表达特异性HBVshRNA的重组HBV载体，其特征在于所述 shRNA转录结构单元由启动子和shRNA编码序列组成。
3.根据权利要求1所述表达特异性HBVshRNA的重组HBV载体，其特征在于所述启动子为Hl启动子。
4.根据权利要求1-3任一项所述表达特异性HBVshRNA的重组HBV载体，其特征在于 所述 shRNA 编码序列如 SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 16,SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 22 或 SEQ ID NO. 25 所示。
5.权利要求1-4任一项所述重组HBV载体的制备方法，其特征在于根据LJ196载体序列设计引物，然后以LJ196载体为模板，进行PCR扩增，得删除LJ196载体2111-2643位、 187-680位和1060-1500位碱基的序列，同时克隆Hl启动子并分别与所得序列连接，环化后在Hl启动子3’端连入识别所述删除序列的shRNA的转录结构单元，得重组HBV载体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述引物为SEQID NO. 2-7所示的核酸序列。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于所述克隆Hl启动子的方法为， 以SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列为引物，以pLVTHM质粒为模板，进行PCR 扩增，得Hl启动子。
8.权利要求1-4任一项所述重组HBV载体在制备干扰乙型肝炎病毒基因组DNA复制的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及表达特异性HBVshRNA的重组HBV载体及其构建方法和应用，重组HBV载体由LJ196载体删除2111-2643位、187-680位或1060-1500位碱基后，在删除序列处替换识别所述删除序列的shRNA转录结构单元而得，制备方法简单，该重组HBV载体能够利用野生型乙型肝炎病毒基因组的Core蛋白和Pol蛋白高效合成RCDNA，并且合成效率高于野生型乙型肝炎病毒基因组DNA，竞争野生型乙型肝炎病毒的复制，同时利用重组HBV载体合成效率高的特性，高效表达shRNA，然后干扰乙型肝炎病毒DNA复制和HBsAg合成，能够用于制备干扰乙型肝炎病毒基因组DNA复制的药物，为慢性乙型肝炎病毒感染的治疗提供了新的思路。
文档编号A61K48/00GK103014045SQ201210584159
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月30日 优先权日2012年12月30日
发明者李俊刚, 毛青, 王宇明 申请人:中国人民解放军第三军医大学