孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞及用于有效且划算灭活和使用它们的方法

孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞及用于有效且划算灭活和使用它们的方法
【专利摘要】提供了新颖的菌株及其使用方法。具体地，含有孢子化缺陷型短芽孢杆菌(Brevibacillus)菌株的食物和其它口服产品或疗法，其在被对受试者施用时能抑制或减少受试者中的病原体数目并改善受试者的健康状况。
【专利说明】孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞及用于有效且划算灭活和使用它们的方法
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年3月I日提交的美国临时申请N0.61/447,703的权益，其完整内容通过提述并入。
发明领域
[0003]本发明总体上涉及生物【技术领域】，更具体地，涉及德克萨斯侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus texasporus)的胁迫敏感性或孢子化缺陷型菌株、用于德克萨斯侧孢短芽孢杆菌生物体的有效且划算的细胞灭活的方法、及自这类菌株衍生的饲料或水添加剂。
[0004]发明背景
[0005]本文中引用的任何文件并非承认该文件是现有技术或本文中任何权利要求的可专利性的考虑材料，并且关于任何文件的内容或日期的任何陈述均基于提交时该申请可用的信息，而不构成证实或承认该陈述是正确的。
[0006]健康动物或未被病原性生物体(如病原性细菌)感染的动物较快生长并且从每千克饲料取得更多的体重增加。因此，自20世纪40年代以来，抗微生物化合物已被用作家畜中的生长促进剂。通常，抗微生物化合物被以亚治疗剂量或低剂量在饲料中施用。
[0007]尽管已长期使用亚治疗剂量的抗微生物化合物来帮助家畜保持健康并更快生长，但最近的报告显示了抗生素的使用与从这些动物生产的肉类上药物抗性细菌的存在之间的联系。因此，欧洲委员会、美国农业部(USDA)以及美国食品和药品管理局(FDA)均已制定了关于将某些抗生素用作生长促进剂的禁令和指南。目前，规则通常聚焦于与用于治疗人类的抗生素相同或类似的抗生`素的使用。然而，对使用所有抗生素药物来增强家畜生长的总体性抵制日益增长。此外，有机生成肉类的市场正在扩大，并且要得到有机认证，美国肉类必须来自未经抗生素喂养的动物。因此，目前存在对用于家畜饲料的新型生长增强剂需求。
[0008]另外，伴侣动物健康是一个快速增长的市场。经由刺激先天性免疫来保持伴侣动物(例如老龄伴侣动物)的健康对于伴侣动物的保健是一种有吸引力的办法，并且口服投递的免疫刺激剂会是高度有价值的。
[0009]德克萨斯侧孢短芽孢杆菌(BT)(例如ATCC PTA-5854)是一种最近鉴定的土壤细菌，其生成一组阳离子非核糖体肽(NRPS peptides)(参见W02005/074626和WU等2005)。这些来自BT的阳离子肽在体外展现出广谱抗细菌活性，其杀死革兰氏阳性和阴性细菌、真菌和原生动物(W02005/074626)。
[0010]尽管具有体外抗细菌活性，但BT肽似乎缺乏体内抗细菌活性。万古霉素抗性肠球菌在体外对BT肽是高度敏感的。然而，BT肽在明显超出最小抑制浓度的浓度不能使共生的VRE自小鼠肠道去定殖化(decolonize)。
[0011]然而，分离的肽被显示了在被用作饲料添加剂时有效预防鸡的大肠杆菌病和沙门氏菌病。另外，还显示了此分离后的肽在鸡中有效促进生长并提高饲料转化。[0012]可能更重要地，BT肽的体内作用似乎不依赖于其体外抗生素活性，因为它在低于其体外最小抑制浓度的浓度时有效预防大肠杆菌和沙门氏菌对鸡的感染(JIANG等2005 ；KOGUT等2007 ；KOGUT等2010)。还被注意到的是，在饲喂BT肽的鸡中，血液异嗜白细胞(heterophil)和单核细胞被预备活化(primed for activation),这指向先天性免疫刺激为可能的作用机理。这些特征使得BT肽成为家畜生产中理想的饲料添加剂和抗生素化合物的替代品。
[0013]另外，由于现在还已知先天性免疫在控制病毒性和真菌性感染以及预防非传染病(如肥胖/代谢综合征和2型糖尿病)中起着关键作用(VIJAY-KUMAR等2010)，因此BT先天性免疫调节剂也应在这些治疗领域中具有重要的应用。
[0014]然而，BT肽作为饲料添加剂的经济价值严重受限于肽分离的需要，其使生产成本增加至其在经济上不再可行的程度。作为纯化该肽的替代方案，有可能可以将整个生物体(PTA-5854)(如在国际专利公开文本W02005/074626中讨论的)直接用来生产饲料添加剂。
[0015]通常，直接饲喂微生物(DFM)或益生菌(probiotic)菌株需要以活体形式和充足数目到达肠道，这需要菌株在饲料加工和消化期间存活(参见美国专利5，480，641和美国专利公开文本20040247568)。由于饲料颗粒生成通常牵涉足以显著降低存活力的加热，大多数益生菌菌株都经过目标为其对加热和胃中测出的PH条件的抗性的筛选。目前，最稳定的益生菌菌株是芽胞杆菌孢子，因为细菌孢子是热抗性的，并且在长期贮存期间保持存活。
[0016]然而，由于BT生物体不被认为是通常在家畜肠道中找到的共生细菌，期望和/或有必要的是在使用之前灭活其生物体。然而，在能生成孢子的菌株中，这是有问题的。另外，至少一个政府管理机构在评估涉及微生物来源的新饲料时考虑以下标准:微生物生产的安全性；微生物产品对人 、动物和环境的安全性；横向基因转移的潜在影响；与胃肠微生物区系的相互作用；在肠中的持久性；由于活体微生物洒落而对人和环境的潜在影响，尤其是在肉类污染会被认为有健康影响时(Directive on Guidelines for the Assessmentof Novel Feeds:Microbial Sources，Draft_June2007，The Canadian Food InspectionAgency)。因此，在使用微生物作为食品添加剂时，有两种相互冲突的期望结果。第一种是在整个加工和消化期间将微生物保持为活体状态，而第二种完全相反的期望是完全或近乎完全地将微生物灭活而不使活性肽失活。灭活的额外益处是其消除或降低德克萨斯侧孢短芽孢杆菌与肠中及环境中的微生物之间横向基因转移的机会；消除或限制与胃肠(GI)微生物区系的潜在相互作用；消除或降低经由活细胞洒落对人和环境的潜在风险；和/或消除或降低对源自消耗该饲料的动物的肉类的污染。因此，PTA-5854的连续孢子化严重限制将该菌株用作DFM的能力，因为孢子对用于灭活营养细胞的大多数方法是极具抗性，要求用严苛且昂贵的方法予以去除。
[0017]因此，本领域中需要可作为灭活的DFM有效使用的德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株。
[0018]发明概述
[0019]在一个实施方案中，本发明是饲料或水添加剂，其包含孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细菌菌株的灭活的细胞或灭活的培养物。本发明还涉及可以添加到一种或多种动物用的饲料或饮用水的本发明的灭活的经干燥的细胞或培养物(例如冻干或喷雾干燥的细胞或培养物)的用途，所述动物包括但不限于家禽、牲畜、牛、猪、鸡、马、火鸡、绵羊、山羊、鸭、鹤鹁、康沃尔游戏母鸡(Cornish game hen)、纟鸟、农场饲养的鱼、蟹、奸、淡水龟、犬和猫。例如，可以经由巴氏消毒法、饥饿、温度(热、冷或冷冻)、脱水(例如加热干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、晒干、风干或真空干燥)、酸化、碱化、醇、去污剂、溶菌酶、机械力、季铵阳离子、氧化剂(例如氯氧化物、过氧化氢、次氯酸盐或臭氧)和/或辐射(例如UV、X射线或Y射线)来灭活孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株培养物的细胞，然后可以将灭活的细胞或培养物纳入到饮用水或动物饲料中，如基于谷类的饲料，例如含有至少一种选自下组的谷类的饲料:大麦、大豆、小麦、小黑麦(triticale)、黑麦(rye)、玉米及其组合。实际上，可以将本发明添加到极其多种饲料中。可以将本发明的灭活的细胞或分离肽与选自下组的家畜用饮用水或饲料混合:代乳品(milk replacer)、生长饲料(grower feed)、肥育饲料(finisher feed)、育雏前饲料(pre-starter feed)、育雏饲料(starter feed)、水及其组合。
[0020]本发明还包括用于促进家畜和伴侣动物中的体重增加和饲料转化的方法，其通过将孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞或细胞培养物灭活(例如热处理或脱水)，并以足以促进生长的量向动物提供灭活的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞或培养基加细胞进行。另可选择的是，可以将有效量的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞或含有该细胞的培养基干燥(脱水)和/或通过造粒(一种热处理方式)纳入动物饲料中或添加到饮用水中。
[0021 ] 饲料成分的例子还包括谷类、大豆粉、分离的大豆蛋白、分离的大豆油、分离的大豆脂肪、脱脂乳、鱼粉、肉粉、骨粉、血粉、血浆蛋白质、乳清、稻糠、麦麸，并且还可以包含甜味剂、矿物、维生素、盐和草。[0022]在一个例示性的实施方案中，在含有饲料成分(如玉米粉和大豆粉)悬浮液的培养基中培养孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞。然后，可以对培养物进行细胞灭活和/或干燥/脱水以制备饲料添加剂(其中培养物中的微粒发挥BT肽的载体的功能)或增强型饲料。
[0023]本发明还包括用于预防和/或治疗动物中微生物感染的方法，其通过以足以治疗和/或预防动物中微生物感染的有效量提供灭活的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞或培养物进行。
[0024]本发明还包括用于促进正在生长的动物中重量增加和饲料转化的方法，其通过以足以治疗和/或预防动物中微生物感染的有效量提供灭活的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞或培养物进行。
[0025]本发明还包括孢子化缺陷型细胞作为人食物或水添加剂的用途。
[0026]在一个例示性实施方案中，本发明提供了德克萨斯侧孢短芽孢杆菌的孢子化缺陷型菌株，其具有小于约3.5x10'小于约1x10'小于约1x10'小于约1x10'小于约1x10'小于约1χ10_8或小于约1χ10_9的存活率，存活率可以通过使培养物处于约50°C的温度约5分钟并测定存活率或菌落形成能力来测量。
[0027]在一个例示性实施方案中，当对培养物进行灭活处理时，孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株还展现出降低的存活，如小于约1χ10_9的存活率，所述灭活处理如饥饿、冷冻(在缺乏有效量的冷冻保护剂的情况下)、脱水(于23°C用迅速真空(speedvaccum))、pH极端(例如pHl.0或pH13.0)、饱和丁醇、添加去污剂(例如1%SDS)或裂解剂(例如溶菌酶)、超声处理、机械力(例如动物饲料造粒机的弗氏压碎(French press))或过氧化氢(例如大于或等于1%H202)。
[0028]本发明还涉及增加德克萨斯侧孢短芽孢杆菌制剂中的BT肽产量的方法，其通过使用自孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株衍生的细胞进行。本发明还涉及增加德克萨斯侧孢短芽孢杆菌制剂中BT肽的稳定性和经济效用的方法，其通过在不纯化或分离BT肽的情况下使用自孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株衍生的细胞进行。
[0029]本发明还涉及德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞的粉末状形式，其中粉末基本上无孢子。在一个例示性实施方案中，在液体培养基中将孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌的培养物培养至足够的细胞密度，并将培养物脱水或干燥以生成基本无孢子的粉末。然后，可以将该粉末与水或饲料成分混合以生成不含显著量的来自德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细菌的活孢子的增强型动物饮料或食物。
[0030]本发明还涉及将德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞从用于德克萨斯侧孢短芽孢杆菌生产的装置和/或设施中除去或去污的方法，其如下进行，处理该装置和/或设施以灭活或杀死孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株，然后可以简单地将细胞冲洗掉。例如，可以使用蒸汽或高温水来清洁装置和/或设施，其中水既会除去细胞又会杀死它们(由于温度所致)，由此有效从装置和/或设施除去德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞。
[0031]本发明还涉及刺激动物或人的免疫系统的方法，其通过施用有效量的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株进行。例如，可以培养孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株，可以在有或无培养基的情况下收获细胞，并且可以将细胞与水或别的食物成分混合以生成增强型饮料或食物，其刺激受施用动物的免疫系统。例如，可以将孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株灭活并直接喂予动物或人以刺激该动物或人的免疫系统。在另一个例示性实施方案中，本发明涉及增强型食品，其通过对动物或人施用有效量的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株和食物载体来刺激动物或人的免疫系统。
[0032]可以培养孢子化缺陷`型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株并与水或食物成分混合以生成刺激免疫系统的增强型饮料或食物，例如，其可以加强对疫苗的免疫应答，该疫苗与增强型饮料或食物一起对动物或人施用或在投递增强型饮料或食物后对动物或人施用。另外，可以将孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株灭活并喂予动物或人，例如可以将灭活的细胞干燥、运送到期望的加工和/或施用地点、并与动物或人要消耗的水或食物混合，其中食物或水不含来自德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株的活孢子。
[0033]本发明还涉及用于刺激动物(包括人)的免疫系统的组成物，其通过与一或多种疫苗联合施用有效量的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株进行。例如，可以培养孢子化缺陷型菌株，收获细胞(附有或不附有培养基，例如细胞可以在离心后被清洗)，并在接种疫苗之前或与疫苗组合对动物施用，其中所述细胞预备活化或加强免疫系统对疫苗的应答。
[0034]本发明还涉及预防和/或治疗动物中疾病的组成物和/或方法,其包括对动物施用孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株。例如，所述治疗可以涉及减少动物体内的病原性微生物群体。可减少的例示性病原体包括但不限于不动杆菌属(Acinetobacter)、杆菌(Bacilli)、疏螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭菌(Clostridia)、大肠杆菌(E.coli)、肠球菌属(Enterococcus)、口蹄疫(Foot-and-mouth disease)病毒、淋病菌(Gonorrhea)、嗜血菌属(Haemophilus)、流感病毒(Influenza virus)、曼氏杆菌属(Mannheimia)、分枝杆菌(Mycobacteria)、支原体属(Mycoplasma)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和链球菌属(Streptococcus)。例示性疾病包括但不限于大肠杆菌病(colibacillosis)、沙门氏菌病(salmonellosis)、坏死性肠炎(necrotic enteritis)、球虫病(coccidiosis)、流感(influenza)、口蹄疫(foot-and mouth disease)、猪生殖与呼吸综合征(porcine reproduct ive&respiratory syndrome)、牛航运热月市炎(bovineshipping fever pneumonia)、尿路感染(urinary track infection)、肥胖(obesity) / 代谢综合征(Metabolic Syndrome)和 2 型糖尿病(type2diabetes mellitus)。
[0035]称为ΡΤΑ-12307 (菌株 MYGl 13)、ΡΤΑ-12308 (菌株 MYGl 10)、ΡΤΑ_12309(菌株MYG107)和ΡΤΑ-12310 (菌株MYGl I)的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株在2011年12月7日被保藏。所有这些菌株均在布达佩斯条约的条款下被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Blvd.，Manassas, Virginia20110-2209, USA)，并通过提述并入。
[0036]本发明还涉及至少一种选自下组的属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的细菌菌株:ΡΤΑ-12307、ΡΤΑ-12308、PTA-12309 和 ΡΤΑ-12310 的至少一种。
[0037]一种可用于灭活本发明细胞的办法涉及在合适的培养基中培养细胞，然后向培养物添加饲料成分或向饲料成分添加培养物以使细胞脱水。
[0038]可用于灭活本发明细胞的另一种办法(除热休克外)涉及使细胞处于pH极端，如约1、约2、约3、约4、约 5、约9、约10、约11、约12、约13或约14的pH。
[0039]可以实现足以灭活本发明细胞的pH改变，其通过添加碱、酸和/或其它组分来有效变换PH而超出生理学耐受范围来实现。例如，可以将二氧化碳溶解于水以产生碳酸并降低PH以引起细胞灭活。
[0040]可用于灭活本发明细胞的另一种办法是高压加工(也称为“高压处理”或“超高压处理”或“超高压灭菌”)，它是一种可涉及施加范围为100-1，OOOMPa (14, 500-145, OOOpsi)或150-600MPa(25，000至90，OOOpsi)的压力来将细菌、霉等的营养细胞从有这些细胞的产
品中消除的工艺。
[0041]高压处理的一个例子是弗氏压碎办法，其通过对细胞悬浮液施加压力(高达40，OOOpsi)，然后突然释放压力来破坏细胞。如此，可以通过施加和释放约40，OOOpsi,20，OOOpsiUO, OOOpsi,5, OOOpsi,2, OOOpsiU, OOOpsi或其任意组合的压力来灭活本发明的孢子化缺陷型菌株。
[0042]可用于灭活本发明细胞的又一种办法涉及使细胞处于终浓度为约70%、约60%、约50%、约40%、约30%、约20%、约10%、约5%、约2%或约1%(ν/ν)的醇中。
[0043]可用于灭活本发明的细胞的又一种办法涉及使细胞处于终浓度为约10%、约5%、约2%、约1%、约0.5%、约0.2%或约0.l%(w/v)的去污剂中。
[0044]可用于灭活本发明的细胞的又一种办法涉及对细胞进行脱水，其通过将德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞周围环境中的含水量降低至低于约80%、约70%、约60%、约50%、约45%、约40%、约35%、约30%、约25%、约20%、约15%、约10%、约5%、约2%或约1%的水平来进行。
[0045]在一个例示性实施方案中，制备依照本发明的孢子化缺陷型细胞的培养物，通过一种或多种灭活方法处理，并应用于动物饲料。例如，可以使用高产量系统培养孢子化缺陷型细胞的培养物，然后将其喷雾干燥以产生粉末。在此情况下，使用喷雾干燥来灭活细胞并生成产物，然后，可以将该产物添加到经干燥的饲料原料。或者，可以通过添加热和/或压力(如在制备颗粒化饲料的过程中)灭活细胞培养物。
[0046]在另一个例示性实施方案中，在液体培养基中培养依照本发明的孢子化缺陷型细胞如MYG107、MYG110*MYG113的培养物，然后添加到基本干燥的动物饲料成分混合物或动物饲料谷物以产生含有介于约10%和约25%(相对于固体)之间的最终含水量的混合物，然后将经湿润的混合物运行通过制粒机(pellet mill)以产生合适大小的颗粒，接着将其干燥至最终含水量，例如约5%。在此例子中，将细胞添加至基本干燥的动物饲料成分的混合物提供一种脱水方式，然后，其通过添加热并颗粒干燥来加强。在这些条件下，认为会灭活所有或基本所有细胞。
[0047]在另一个例示性实施方案中，使用饲料成分(包括2号黄色玉米、大豆粉、稻壳、精炼的蛋白质产物、盐、粉末状石灰石磷酸盐、液态动物脂肪和液态胆碱)来生成含有本发明的灭活细胞的饲料。一般通过将干粉末状或研碎的成分混合成均质状态，然后添加液体成分来制备一批次的饲料，所述液体成分可以包含德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞的孢子化缺陷型培养物(一种脱水方式)。将经湿润的混合物传送至条件化室，其中添加蒸汽(提供热休克形式)，并且饲料变为醪液。将此醪液彻底混合，之后进入制粒机中造粒。在制粒机中，迫使软热醪液通过铸模并形成圆柱体形状颗粒。将颗粒送至冷却器/干燥器，其中排风机将周围空气抽吸通过颗粒床以从颗粒除去湿气(进一步脱水)和热。然后可以使用传送器和桶式升降器将饲料移送至液体包被流程，其中将动物脂肪以按重量计约2%在饲料上喷雾。然后，完成的饲料即可使用。
[0048]在另一个例示性实施方案中，将孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株的约
1.0xlO10,1.0xlO11U.0xlO12,1.0xlO13,1.0xlO14 或 1.0xlO15 个灭活细胞添加至约 1000kg 动物饲料。
[0049]在又一个例示性实施方案中，对动物施用有效剂量的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞。在又一个例示性实施方案中，孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞在水中或饲料中含BT肽的有效剂量介于约5ppm和约1000ppm之间、介于约15ppm和约1000ppm之间、介于约20ppm和约1000ppm之间、介于约5ppm和约IOOppm之间、介于约IOppm和约IOOppm之间、介于约20ppm和约IOOppm之间、介于约5ppm和约75ppm之间、介于约IOppm和约75ppm之间、介于约20ppm和约75ppm之间、介于约5ppm和约50ppm之间、介于约IOppm和约50ppm或介于约20ppm和约50ppm之间。
[0050]在另一个例示性实施方案中，如下实施本发明的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株的脱水:冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥、渗透性脱水、流化床脱水、溶剂蒸发脱水、超声辅助脱水、微波辅助脱水、RF辅助脱水和/或其组合。
[0051]在另一个例示性实施方案中，通过添加吸水性物质(例如饲料成分)、热(如在动物饲料造粒过程中产生)和/或蒸发来完成对孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞或培养物的脱水。
[0052]附图简述
[0053]图1图示了 PTA-5854孢子消耗BT肽。将PTA-5854接种到LB中，并在37°C空气摇床中培养。每天取样品，提取BT肽，并测定了活性。I个人工单位是0.8ug/ml的BT肽。在第3天，将培养物分成3个等分试样(#1、#2和#3)。等分试样#1是未处理的。将等分试样#2在UV交联器中UV照射10分钟。将等分试样#3煮沸10分钟。然后，将各等分试样在37°C空气摇床中温育。
[0054]图2显示了在第1(1)和第2(2)项试验期间禽的生长。
[0055]图3显示了从两项试验综合的在第20天的禽的平均重量(均值土标准误差)。N=每种处理39-42只经攻毒的禽和N=每种处理16-19只未经攻毒的禽。*p ( 0.05。
[0056]图4显示了来自两项试验对整个喂养处理测量的平均饲料转化率(均值土标准误差，N=3个栏/处理/试验经攻毒的禽，N=I个栏/处理/试验未经攻毒的禽)(1=试验I，2=试验 2) ο *p < 0.05, **p <0.01。
[0057]图5显示了在来自两项试验(1=试验1，2=试验2)的经艾美球虫(Eimeria)攻毒的禽(N=20-24)和未经攻毒的禽(N=S)的小肠长度平均值(均值土标准误差)。
[0058]图6显示了在经艾美球虫攻毒的(N=10_12)和未经攻毒的(N=4)禽中囊重量与禽重量的平均比率(均值土标准误差)。
[0059]图7显示了对照(N=8)和BT肽(N=12)组中的艾美球虫病变评分结果(均值土标准误差)。在处理间有统计学显著的差异(p=0.098)。
[0060]图8显示了在经攻毒的禽中(N=每种处理5-6个集合)和来自未经攻毒的禽(N=每种处理2个集合)的回肠食糜的干物质的平均百分比(均值土标准误差)。
[0061]图9显示了在经攻毒的禽(N=每种处理4-6个集合)和未经攻毒的禽(N=每种处理2个集合)中盲肠食糜的干物`质的平均百分比(均值土标准误差)。
[0062]图10显示了来自经攻毒的禽(N=每种处理5-6个集合)和来自未经攻毒的禽(N=每种处理2个集合)的回肠中总微生物计数(均值土标准误差)。
[0063]图11显示了来自经攻毒的禽(N=每种处理5-6个集合)和来自未经攻毒的禽(N=每种处理2个集合)的盲肠中总微生物计数(均值土标准误差)。
[0064]图12显示了来自两项试验的经艾美球虫攻毒的禽(N=每种处理5-6个集合)的回肠中不同微生物的数量。P值为对照对BT，试验1=0.037。
[0065]图13显示了来自两项试验的未经攻毒的禽(N=每种处理2个集合)的回肠中不同微生物的数量。在组间无显著差异。
[0066]图14显示了来自两项试验的经艾美球虫攻毒的禽(N=每种处理5-6个集合)的盲肠中不同微生物的数量。在组间无显著差异。
[0067]图15显示了来自两项试验的未经攻毒的禽(N=每种处理2个集合)的盲肠中不同微生物的量。在组间无显著差异。
[0068]发明详述
[0069]如本文中和所附权利要求书中使用的，除非上下文另外清楚指示，单数形式例如“一 / 一个/ 一种”和“该/所述”包括复数。例如，述及“一种德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细菌”包含多种这类细菌，而述及“一个细胞”也是对多个类似细胞及其等同物的提述。
[0070]如本文中使用的，“约”意为合理地接近所述数目或量、大概是所述数目或量或略微多于或小于所述数目或量。
[0071]如本文中使用的，“动物”意指任何无脊椎动物或脊椎动物，包括马、山羊、绵羊、牛、猪、鸡、火鸡、游戏母鸡(game hens)、鹅、鸭、犬、猫、鹤踏、鱼、蟹、奸、淡水龟、人等。
[0072]如本文中使用的，“饲料”或“食物”意指为了对动物或人提供营养需求的至少一部分，和/或用于预防或治疗动物中的营养性病症的目的，而制备、销售或提供给动物(如家畜或驯化动物)或人消耗的，含有氨基酸、抗氧化剂、碳水化合物、调味剂、酶、脂肪、矿物、非蛋白质氮产物、蛋白质、维生素和/或粘合剂中的任何物质或物质混合物，并且可以含有造粒剂、着色剂、起泡剂和/或芳香剂。作为至关重要的营养物，水被认为是饲料成分，而且含水饮料是饲料或食物。
[0073]如本文中使用的，“失活”或“灭活”意指一般不能杀死孢子并将培养物的相对菌落形成效率(存活率)降低至小于约1x10'小于约1x10'小于约1x10'小于约1x10'小于约1x10'小于约lxl(T8或小于约lxl(T9的任何处理或胁迫(stress),如饥饿、温度休克、脱水/冻干/干燥(例如热干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、晒干、风干和/或真空干燥)、PH变化(例如酸化或碱化)、醇处理、用去污剂处理、过滤、用金属如银和锌处理、压力处理如高压加工、酶促破坏(例如用溶菌酶处理)、机械力(例如超声处理)、用季铵阳离子处理、氧化剂(例如氯氧化物、过氧化氢、次氯酸盐和/或臭氧)、盐化、电场处理、微波处理、电子束处理、辐射和/或其组合。
[0074]如本文中使用的，孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株的“灭活的细胞或培养物”意指不可存活的德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞、至少部分释放的细胞内容物和/或培养基成分的混合物。应当注意，取决于使用的灭活条件，灭活本发明的孢子化缺陷型菌株可能导致许多、大多数或所有细胞的裂解。因此，“灭活的细胞”、“灭活的培养物”及等同短语在其意义内包括至少部分通过灭活过程产生的细胞裂解物。
[0075]如本文中使用的，“突变”意指核酸序列中的任意变化，包括一或多个核苷酸的插入、缺失、转换和颠换(transvertion)。缺失或插入的大小可以从单个核苷酸变化到许多基因。
[0076]如本文中使用的，“表型”意指细胞或细胞培养物中观察到的生化、生理学和/或形态学特征。
[0077]如本文中使用的，“孢子化缺陷型”指相比于有完全孢子化能力的野生型(Wt)对应菌株，在孢子形成过程或产物中展现出任何可检测的缺陷的细菌菌株。如此，术语“孢子化缺陷型”指对降低培养物的相对菌落形成效率(存活率)(至小于约8.1x10'小于约
3.5x10'小于约1x10'小于约1χ10_5、小于约1x10'小于约1χ10_7、小于约1χ10_8或小于约lxlO—9)的胁迫(如饥饿、温度休克、脱水、酸化、碱化、醇、去污剂、溶菌酶、机械力、季铵阳离子、氧化剂和/或辐射)具有敏感性的任何菌株，其包含无孢子化能力的和实质性孢子化能力受损的细胞，或换言之，即由于菌株不具能力而不形成孢子的细胞，或具有降低了的形成孢子能力的细胞，或形成孢子但孢子可能不具活力或孢子对灭活胁迫敏感并在对其暴露后不能存活的细胞。可以通过本文中描述的任何方法来测量孢子化缺陷，例如可以使活跃生长的培养物处于约50°C或约70°C热休克约5分钟，并相对于未处理的培养物或上文未处于热休克的培养物的等分试样来测量相对菌落形成效率。
[0078] “饥饿”是引起活性或营养细胞数目减少(并刺激孢子形成和/或细胞死亡)的营养剥夺。野生型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞至少部分地通过孢子化挺过饥饿，但孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞不能避免由饥饿导致的细胞死亡。所以，可以简单地通过将菌株接种到生长培养基中并将该菌株温育延长一段时间，从而使得细胞在初始生长期后死于饥饿来获得孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株的灭活培养物。
[0079]如本文中使用的，“温度休克”意指约50°C至约100°C的热温、约0°C至约16°C的冷温或冷冻。
[0080]“脱水”定义为导致德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞周围环境中含水量降低的任何工艺流程或处理，例如渗透性休克，其将周围环境中的含水量降低至低于约80%、约70%、约60%、约 50%、约 45%、约 40%、约 35%、约 30%、约 25%、约 20%、约 15%、约 10%、约 5%、约 2% 或约1%的水平。
[0081]最好由内科医生或兽医基于各种因素如动物的大小、年龄、重量和/或医学状况来确定本发明细胞的有效量。
[0082]PTA-5854中的孢子形成限制BT肽的产量水平，因为PTA-5854孢子似乎降解BT肽。不希望受到理论束缚，看起来孢子形成和/或孢子活化降低了 PTA-5854BT肽的产生。如图1中显示的，将PTA-5854在LB培养基中于37°C持续培养超过3天(此时营养贫化至少已开始)导致了 BT肽的消耗(#1)。此BT肽消耗可以被在第3天的UV照射阻止，该照射杀死活性(营养)细胞和孢子两者(#2)。然而，此BT肽消耗不能被在第3天的煮沸阻止，该煮沸仅杀死活性细胞而不灭活孢子(#3)。
[0083]在BT肽水平降低外，PTA-5854中的孢子形成阻止使用该菌株作为饲料添加剂的最经济方法。具体地，使用BT肽作为饲料添加剂需要低生产成本，这实际上排除了任何肽纯化步骤。因此，最经济的基于BT的饲料添加剂会是经脱水的德克萨斯侧孢短芽孢杆菌培养物。脱水仅能灭活德克萨斯侧孢短芽孢杆菌的营养细胞而非其孢子，因此脱水不能灭活专长孢子化的菌株。此外，来自这类菌株的孢子能发芽并消耗周围的BT肽，其中发芽的孢子对BT肽的降解也会造成饲料产品稳定性的严重问题。
[0084] 最后，含有德克萨斯侧孢短芽孢杆菌孢子的饲料添加剂可能达不到政府管理标准，并且引起关于扩散生产菌株的担忧。因此，高度期望的是能够有效灭活或消除孢子。
[0085]然而，德克萨斯侧孢短芽孢杆菌连续形成难以消除或灭活的孢子。可用于灭活德克萨斯侧孢短芽孢杆菌和所得孢子的常用技术包括Y照射、高温高压灭菌和其它极端处理。尽管Y照射在特定实体背景中有效消除孢子而不损害BT肽，但工业界一般认为它既不实际也不划算。高压灭菌是另一种有效消除孢子的方法，但该过程损害BT肽，如此使此方法变得不令人期望。
[0086]在工业环境中细胞灭活的最实际和划算的方法是BT肽能承受的短暂的中等加热处理(如巴氏消毒法，例如70°C持续30分钟)和/或脱水。由于德克萨斯侧孢短芽孢杆菌孢子对热处理相当有抗性(孢子能承受显著的胁迫水平，如于100°C煮沸60分钟(表1)，和脱水(表2))，因此德克萨斯侧孢短芽孢杆菌的实际和/或划算的使用(如用于DFM)需要对中等温度和/或脱水敏感的孢子化缺陷型菌株。本发明提供了可以使用对BT肽安全的技术(如巴氏消毒法、造粒、冻干和/或干燥)来灭活的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株，其中灭活条件能够灭活营养细胞，而一般不灭活非野生型孢子。
[0087]可用于灭活营养细胞的技术的例子包括但不限于饥饿、温度休克(加热如巴氏消毒法或低温如冷冻)、脱水/冻干/干燥(例如热干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、晒干、风干和/或真空干燥)、pH变化(例如酸化或碱化)、醇处理、用去污剂处理、过滤、用金属如银和锌处理、压力处理(如高压加工)、酶促破坏(例如用溶菌酶处理)、机械力(例如超声处理)、用季铵阳离子处理、氧化剂(例如氯氧化物、过氧化氢、次氯酸盐和/或臭氧)、盐化、使用射频(RF)能量的(脉冲)电场处理、微波处理、电子束处理、辐射(例如UV、X射线或Y射线)和/或其组合。在一个例示性实施方案中，可以使用这些技术中的一种或多种来灭活本发明的孢子化缺陷型细胞。
[0088]据发明人所知，没有出版物记载满足被认为是灭活DFM政府管理标准的、胁迫存活率〈10_6、〈10_7、〈10_8或〈10_9的孢子化缺陷。例如，在学术出版物中，10_2的芽孢杆菌胁迫存活率称作孢子化缺陷型(LEE等2001);而已公告的美国专利4，302，544、4，450，235，4，450，236,4, 465，773,6, 284，490 和 7，655，452 中的方法仅可以生成具有10_7级的胁迫存活率的孢子化缺陷型(“不生孢子的(asporugenous)”或“不产生芽胞的(asporugenic) O芽孢杆菌菌株。因此，似乎缺少生成胁迫存活率〈10_9的具有孢子化缺陷的芽孢杆菌菌株的技术。考虑到由于以下两个原因使最有力的基因删除方法不是合适的选项(并且唯一可用的诱变方法是化学方法，其通常引起沉默或“泄漏”点突变)的事实，很需要创建这类技术。第一，德克萨斯侧孢短芽孢杆菌是一种非遗传易处理的生物体，而且无法实施基因删除。第二，所得基因敲除菌株会是经遗传修饰的生物体(GMO)，其在如欧盟等地区中在人用食品中是被禁止的。在另一个例示性实施方案中，灭活方法足以将依照本发明的孢子化缺陷型菌株的存活率降低至小于约1χ10_4、小于约1χ10_5、小于约1χ10_6、小于约1x10'小于约lxlO—8或小于约1χ10_9，但其中灭活方法不足以将有孢子化能力的PTA-5854的存活率降低至低于约3.3X10-1或低于约4.3x10'
[0089]实施例1
[0090] 如下是进行分离PTA-5854孢子化缺陷型突变体的尝试。用EMS诱变了 PTA-5854细胞，然后将其铺板到LB-琼脂上。对约50，000个菌落筛选了对于75°C处理I小时的敏感性，并分离出42个温度敏感性候选菌株。将这些初始候选菌株进行了菌落纯化并再测试热敏感性。在液体LB培养基中于37°C将PTA-5854菌株和温度敏感性候选菌株培养了 3天。然后，将细胞以100μ I等分试样分配到无菌微量离心管中，并于多个温度(75、70、65、60、55、50或37°C )温育了不同长度的时间(5、15、30或60分钟)。将经处理的细胞铺板到LB-琼脂上，并于37°C过夜温育以测定铺板效率。以热休克后的铺板效率除以无热休克于37 0C的铺板效率计算了热休克处理后的存活率。
[0091]在初始的42个分离物中，确认了数个温度敏感性突变体。菌株B7显示最佳的温度敏感性表型(表1)。于50°C短暂的5分钟处理产生了 8.1χ10_7(约1x10 - 6)的存活率，而更高的温度和更长的温育并未显著降低存活率。就使用德克萨斯侧孢短芽孢杆菌作为DFM的目的而言，此细胞灭活水平被认为不够充分。对PTA-5854的重复诱变和突变体分离并未生成具有比B7更好的温度敏感性表型的菌株。据推断，超过一处突变可能对更坚实的温度敏感性表型(从而允许更有效的细胞灭活)是必需的。然而，对B7的诱变未产生具有改善了的温度敏感性表型的突变体，这可能是由于B7(相对于亲本PTA-5854)的不佳健康状况所致。
[0092]表1:德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞(作为2天龄LB培养物)的温度敏感性
[0093]
【权利要求】
1.孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillustexasporus)菌株,其具有小于约3.5xl0_3的存活率，其中可以通过使培养物处于约50°C的温度约5分钟并测量存活率来测量孢子化缺陷。
2.权利要求1的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株，其中所述存活率小于约1x10'
3.权利要求1的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株，其中所述存活率小于约lxlCT7。
4.权利要求1的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株，其中所述存活率小于约?χ?οΛ
5.权利要求1的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株，其中所述菌株是MYGll(ΡΤΑ-12310)、MYG107(ΡΤΑ-12309)、MYGllO(ΡΤΑ-12308)或 MYGl13(ΡΤΑ-12307)。
6.一种灭活权利要求1到5中任一项的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株的方法，其包括使德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞的培养物处于足以灭活细胞的胁迫。
7.权利要求6的方法，其中所述胁迫选自下组:饥饿、温度休克、脱水、pH变化、醇暴露、用去污剂处理、压力处理、酶促破坏、机械力及其组合。
8.权利要求6的方法，其包括将德克萨斯侧孢短芽孢杆菌培养物的存活率降低至小于约 ΙχΙΟΛ
9.权利要求7的方法，其中所述胁迫选自下组:将细胞加热至至少50°C达至少5分钟、将细胞在缺乏冷冻保护剂的情况下冷冻、将细胞脱水至含水量小于约80%、添加去污剂、喷雾干燥细胞、施加机械力及其`组合。
10.一种增强型动物饲料或饮料，其包含权利要求1到5中任一项的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株。
11.权利要求1到5中任一项的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株，其具有按重量计小于约10%的含水量。
12.—种改善动物的生长速率和饲料转化的方法，所述方法包括: 对动物施用权利要求10的增强型动物饲料或饮料；并相对于接受缺少所述孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株的饲料或饮料的动物，改善所述动物的体重增加或饲料转化。
13.权利要求1到5中任一项的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株用于预防和/或治疗动物疾病的用途。
14.依照权利要求13的用途，其中预防和/或治疗疾病包括减少动物中的病原性微生物数量，其中所述病原体选自下组:不动杆菌属(Acinetobacter)、杆菌(Bacilli)、疏螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭菌(Clostridia)、大肠杆菌(E.coli)、肠球菌属(Enterococcus)、淋病(Gonorrhea)、口蹄疫(Foot-andnouth disease)病毒、嗜血菌属(Haemophilus)、流感病毒(Influenza virus)、曼氏杆菌属(Mannheimia)、分枝杆菌(Mycobacteria)、支原体属(Mycoplasma)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和链球菌属(Streptococcus)。
15.依照权利要求13的用途，其中所述疾病选自下组:大肠杆菌病(colibacillosis)、沙门氏菌病(salmonellosis)、坏死性肠炎(necrotic enteritis)、球虫病(coccidiosis)、流感(influenza)、口蹄疫(foot-and mouth disease)、猪生殖与呼吸综合征(porcine reproductive&respiratory syndrome)、牛航运热月市炎(bovine shippingfever pneumonia)、 尿路感染(urinary track infection)、肥胖(obesity) / 代谢综合征(Metabolic Syndrome)和 2 型糖尿病(type2diabetes mellitus)。
【文档编号】A61P3/04GK103732734SQ201280020898
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年2月28日 优先权日:2011年3月1日
【发明者】姜亦微 申请人:迈加拉克西有限公司