用于测定至少一种酶之代谢能力的方法
【专利摘要】本发明涉及用于测定至少一种酶之代谢能力的方法。所述方法包括以下步骤：对个体呼出空气中产物的浓度进行时间分辨测定，其中所述产物通过个体的至少一种酶对预先施用于个体之底物的代谢而产生，并且其中测定产物浓度至少直至达到所述个体呼出空气中的最大产物浓度；使模型函数拟合所述产物浓度的测量值，所述产物浓度的测量值通过开始时间与终止时间之间产物浓度的时间分辨测定而获得；以及基于说明所述模型函数的模型函数之参数来测定酶的代谢能力。本方法的特征在于：基于所述模型函数的至少两个参数进行测定所述酶的代谢能力，前提是在模型函数为单指数函数的范围内，模型函数的最大值和模型函数的时间常数不被同时选作参数，以及另一个前提是起始时间和/或终止时间不被选作参数。
【专利说明】用于测定至少一种酶之代谢能力的方法
[0001]说明书
[0002]本发明涉及权利要求1前序部分的用于测定至少一种酶的代谢能力的方法，以及分别根据权利要求16或17的多种13C标记的底物在该方法中的用途。
[0003]在动物和人的体内，酶对有害物质的降解有重要贡献。存在众多不同的酶(例如，细胞色素)，它们催化地转化底物。[0004]由于酶或酶系统(在下文中将只提及酶，但将意指酶、酶系统二者)发挥重要功能，因此，测定其在生物体中的功能能力(functional capacity)十分重要。现今,该测定例如通过直接在生物体外检验细胞培养物来进行，但缺点是酶未在其天然环境中进行检验。在生物体内进行检验一般涉及施用可被酶代谢的同位素标记的底物。该施用或应用通过外科介入(surgical intervention)(例如直接注入心脏)或者通过其他方法(例如口服底物)来进行。
[0005]此处非外科应用几乎总是具有这样的缺点:底物在血中的可得性(availability)需要数分钟。换言之，从底物S在血中的浓度开始升高直至其达到最大浓度(不考虑由代谢引起的可能的浓度降低)的时间长度需要数分钟。
[0006]替代方法是痕量气体的高灵敏度检测，无需预先施用底物。但其缺点是:必须已知受试个体的确切既往病史以及引起呼吸空气中某种气体富集的所有原因。然而，从原则上来说，无法足够准确地测定既往病史。
[0007]本发明的根本目的是提供方法，通过所述方法可以高度精确地、时间分辨地(time-resolved)测定酶的代谢能力。此外，还应提供适合于该方法的底物。
[0008]用具有权利要求1之特征的方法实现了该目的。这种用于测定至少一种酶之代谢能力的方法包括下文中阐明的步骤:
[0009]首先，进行个体呼出的空气中产物之浓度的时间分辨测定。此处，该产物是由预先施用于个体的底物经个体的至少一种酶代谢而产生的。通常，整个酶系统都参与相应底物的代谢。测定产物浓度至少直至达到个体所呼出空气中最大产物浓度。
[0010]随后，用模型函数拟合所测量的产物浓度值，这些值是通过起始时间至结束时间之间的产物浓度的时间分辨测定而获得的。换言之，用数学函数拟合所获得的经验测量值，该数学函数可用方程式说明。
[0011]最后，基于说明模型函数的模型函数参数来测定酶的代谢能力。为此，基本上可以使用模型函数的多种参数。
[0012]所要求保护之方法的特别之处在于:酶代谢能力的测定是基于模型函数的至少两个参数进行的。然而，这些参数不可以同时为该模型函数的最大值和该模型函数的时间常数，特别是当该模型函数为单指数函数时也是如此。此外，不可以选择模型函数的起始时间t0和/或结束时间tm作为参数。
[0013]当满足这些基本条件之后，可以分析多种底物的不同进程中的代谢动力学，并且因此可以分析多种产物之产生的动力学，从而最终能够测定酶或酶系统的代谢能力。模型函数的所选参数允许直接得出关于酶之代谢能力的结论。酶的代谢能力可用作就特定身体机能而言地定量测定个体之健康状态的基础。这可以在所述过程的后续步骤中进行，这些后续步骤并非所要求保护之方法的一部分。由于酶存在于身体的多种器官或隔室(compartment)内，所以本方法适合作为多种后续检验的基础。优选地，本方法可成为分析肝状况(例如，表征为肝功能能力或肝中的微循环)的基础。
[0014]为了获得所测定的酶代谢能力之可靠且重要的数据，十分有利的是确保底物在个体血中的快速可得性。口服底物一般不适合这个目的。
[0015]将血中底物浓度(无代谢)的时间依赖(temporal dependency)表不为函数S(t)。为了给出血中底物的可得性或释放之更为准确的定义，此处定义释放期(releaseperiod)FZ0设Cmax为血中的预期最大底物浓度(无代谢)，t0为血中底物浓度升高至Cmax的4%至6%时所处的时刻，tm为血中底物浓度升高至Cmax的40%至60% (特别地血中底物浓度大于Cmax的40%、大于Cmax的50%或大于Cmax的60%)时所处的时刻，那么释放期FZ由tm与tQ之间的时间差给出换言之，释放期为血中底物浓度(基于这样的假设:该浓度稍大于Cmax的0%，但仍然处于Cmax的个位数百分比范围内)达到升高10倍、特别地12倍、特别地15倍以及尤其是20倍所需的时间长度。
[0016]底物的标准经口施用的释放期通常为大于5分钟，并且随着时间进展而在个体间差异很大。因此，以长释放期施用导致歪曲的结果(distorted result)，因为这些测量结果使函数S(t)变得复杂，因未知的函数而变得“模糊(blurred)”。
[0017]从现有技术已知，长释放期和在随后测定酶代谢能力时所伴随的缺点可通过个体的代谢装置的靶向诱导来避免，即通过非外科施用底物来检验。就靶向诱导而言，底物的剂量是预定的，因此在随后的阐明步骤中可以估算关于底物剂量的代谢装置的反应。优选地，单独将气体作为产物来检验，气体的浓度通过因施用底物而引起的代谢装置之诱导来改变。由底物引起的代谢装置之诱导以及在其之后迅速速代谢应答是所要求保护之方法的后续应用的关键点。
[0018]在一个实施方案中，所解释的代谢装置之靶向诱导是本方法的一部分，其在产物浓度的时间分辨测定步骤之前进行。
[0019]底物的施用和释放(其取决于施用的种类和方式)最好以这样的方式进行:释放期(并且因此血中底物的可得性)小于60秒，特别地小于50秒，特别地小于40秒，特别地小于30秒，特别地小于20秒，尤其是小于10秒。
[0020]因此，底物最好以能使个体血中底物的释放时间在上述时间以内的剂型施用。这样的短释放期基本上可以通过多种施用或应用形式来实现。此处提供几种方法(不作为限制性的阐明):a)吸入含有底物的气雾剂；b)经皮肤施用，例如用高效纳米载体；c) 口服通过能量吸收而释放的可切换(特别是可活化)底物。经口施用后，所述底物(其处于束缚态，不可降解)可因此通过施用能量(特别是光)而在一秒内完全释放。这样的处于束缚态的底物在技术术语中也被称为笼锁化合物(caged compound)ο使用这样的笼锁化合物允许相应可代谢底物的超迅速且选择性的释放，所述释放可在任意时间诱导。
[0021 ] 血中底物的迅速可得性保证了待检验代谢能力之酶的底物的迅速可得性。
[0022]当底物存在于血中并且位于酶处时，其可被酶代谢。从而产生一种或更多种产物(在下文中仅将其称为单个产物)。代谢步骤必须十分迅速，最好是在10秒内、特别地在5秒内、特别地在I秒内、特别地在0.1秒内、特别地在0.0I秒内、特别地在0.001秒内完成。这在底物可得性的时间标度上保证了几乎是瞬时的代谢。在底物代谢期间形成的产物P溶解在血中并经肺呼出，使得其之后可以在由个体呼出的空气中被检测到。即使仅提及一种产物,从而也还包括这样的本方法的实施方案,其中不是检测到单个产物,而是检测到多种产物。
[0023]可使用多种拟合函数的不同参数来说明酶的代谢能力。合适的参数之实例是来自包括以下之组的参数:模型函数的最大值、模型函数的第i矩(moment)(其中i=l、2、3、4...)、模型函数的第j中心矩(其中j=l、2、3、4...)、模型函数的标准差、模型函数的时间常数、时间常数的重心、时间常数与重心之间的平均偏差、时间常数的变异(variation)、时间常数的分布、时间常数的权重、时间常数之分布的权重、时间常数之变异的权重。
[0024]模型函数的矩在例如Bronstein 和 Semendjajew 的 Handbook of mathematics(665至668页，第25版，1991)中阐明。在该参考文献中，还能找到许多可以在本发明范围内单独使用或彼此组合使用的其他模型函数和模型参数。
[0025]十分适合说明模型函数的两个参数的实例是呼吸空气中产物P的最大浓度或量Pmax和模型函数的从h到tm的第一矩(f irst moment)。第一矩M1定义为:
【权利要求】
1.用于测定至少一种酶之代谢能力的方法，其包括以下步骤: ?对个体呼出空气中产物的浓度进行时间分辨测定，其中所述产物通过所述个体的至少一种酶对预先施用于所述个体之底物的代谢而产生，并且其中对所述产物浓度的测定至少进行到达到所述个体呼出空气中的最大产物浓度； ?使模型函数拟合所述产物浓度的测量值，所述产物浓度的测量值通过开始时间与终止时间之间所述产物浓度的时间分辨测定而获得；以及 ?基于说明所述模型函数的所述模型函数之参数来测定所述酶的代谢能力， 其特征在于， 基于所述模型函数的至少两个参数进行测定所述酶的代谢能力，前提是如果所述模型函数为单指数函数，则模型函数的最大值和模型函数的时间常数不被同时选作参数，以及另一个前提是起始时间和/或终止时间不被选作参数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述参数选自包含以下的组:所述模型函数的最大值；所述模型函数的第i矩，其中i=l，2，3，4，...；所述模型函数的第j中心矩，其中j=l，2，3，4，...；所述模型函数的标准差；所述模型函数的时间常数；所述时间常数的重心；所述时间常数与所述重心之间的平均偏差；所述时间常数的变异；所述时间常数的分布；所述时间常数的权重；所述时间常数之分布的权重；所述时间常数之变异的权重。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述模型函数是一阶微分方程的解函数、二阶微分方程的解函数、三阶微分方程的解函数、多种阶的微分方程之组合的解函数或作为时间之函数的多指数函数。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，以流过的方式进行所述产物浓度的测定。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，测定所述呼出空气流经用于测定所述浓度之测量装置的流率。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，使用测量装置以测定所述产物浓度，所述测量仪器的呼吸阻力小于100毫巴。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，将所述个体的至少一次呼吸的全部呼出空气用作呼出空气。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在所述个体基本处于静息位时测定所述产物浓度。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在所述个体处于卧位或坐位的位置时测定所述产物浓度，其中，与预定位置相比，所述个体的腿和/或身体上部的位置改变小于45度，特别地小于30度，尤其是小于15度。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述产物浓度的测定基本进行到达到所述呼出空气中所述最大产物浓度。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过红外吸收光谱、质谱、计算机断层显像和/或核磁共振波谱测定所述产物浓度。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述模型函数可由以下公式表不:
MetPow=cal* [F (产物，t) -f (产物，t)nat] *g (P) *h (n) *L (η/Μ) * (η/Μ2) *V (η/Μ),其中: MetPow是指代谢能力； cal是考虑了校正的常数； F(产物，t) 是表示呼出产物之动力学的函数； f(产物，t)nat 是表示所述个体在施用底物之前呼出空气中产物天然丰度的函数； g(P)是表示所述个体的产物产生速率P对所述个体活动状态之依赖性的函数； h(n)是表示每分子底物所产生的产物分子数的函数； L (η/Μ)是表示代谢能力依赖于所施用底物分子数η之非线性行为的函数，其中M代表所述个体的体重；以及 V(η/Μ)是表示因不同的底物施用过程而产生的依赖性的函数。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，g(P)=P和/或h(n)=l和/或V(n/M)=l。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述模型函数可由以下公式来表示:
MetPow=cal* [F (13CO2, 12CO2, t) -f (13CO2,12CO2, t) n J *g (Pc02) *h (n) *L (η/Μ) * (η/Μ2) *V (n/Μ), 其中: MetPow是指代谢能力； cal是考虑了校正的常数； F (13CO2,12CO2, t) 是表示作为产物之呼出13CO2的动力学的函数或表示呼出13co2/12co2比值之动力学的函数； f (13CO2,12CO2, t)nat是表示所述个体在施用底物之前呼出空气中13CO2和12CO2的天然丰度的函数； g (Pc02)是表示所述个体的CO2产生速率Pro2对所述个体之活动状态的依赖性的函数； h(n)是表示每分子底物所产生的CO2分子数的函数； L(η/Μ)是表示代谢能力依赖于所施用底物分子数η的非线性行为的函数，其中M代表所述个体的体重；以及 V(η/Μ)是表示因不同的底物施用过程而产生的依赖性的函数。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，g(Pc02) =Pc02和/或h (n) =1和/或V (n/M)=l。
16.13C标记的美沙西汀、非那西汀、氨基吡啉、咖啡因、红霉素和/或乙氧基香豆素，其用作在根据前述权利要求中任一项所述的方法中的底物。
17.13C-美沙西汀与增溶剂的水溶液，其用作在根据权利要求1至15中任一项所述的方法中的底物。
18.根据权利要求17所应用的13C-美沙西汀与增溶剂的水溶液，其特征在于，所述增溶剂的浓度为10至100mg/ml，所述13C-美沙西汀的浓度为按重量计0.2%至0.6%。
19.根据权利要求17所应用的13C-美沙西汀与增溶剂的水溶液，其特征在于，所述13C-美沙西汀的浓度按重量计大于3%。
【文档编号】A61B5/083GK103547215SQ201280024565
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年4月13日 优先权日:2011年4月13日
【发明者】卡斯滕·海涅, 梅尔廷·施托克曼, 汤姆·鲁宾 申请人:休姆迪奇有限责任公司