用于治疗代谢疾病的融合蛋白的制作方法

用于治疗代谢疾病的融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及鉴定具有改善的药学性质的包含成纤维细胞生长因子(FGF1)的多肽和蛋白质变体的融合蛋白。还公开了用于治疗FGF21相关病症，包括代谢病况的方法。
【专利说明】用于治疗代谢疾病的融合蛋白
发明领域
[0001]本发明涉及包含已知改善施用对象的代谢谱的成纤维细胞生长因子21 (FGF21)的新型融合蛋白。
[0002]发明背景
[0003]成纤维细胞生长因子(FGF)家族的特征是22种遗传上有区别的同源配体，被分为7个亚家族。FGF-21与FGF-19和FGF-23最密切相关，并形成亚家族。该FGF亚家族调控多种对经典FGF而言不常见的生理学过程，即，能量和胆酸的内稳态、葡萄糖和脂类代谢，以及磷酸盐和维生素D的内稳态。此外，与其他FGF不同，该亚家族以内分泌的方式发挥作用(Moore, D.D.(2007) Science316, 1436-8) (Beenken 等人(2009) Nature Reviews DrugDiscovery8, 235)。
[0004]FGF21是209个氨基酸的多肽，含有28个氨基酸的前导序列(SEQ ID N0:5)。人FGF21与小鼠FGF21具有约79%氨基酸同一性，与大鼠FGF21具有约80%氨基酸同一性。成纤维细胞生长因子21(FGF21)被描述为用于治疗缺血性血管病、创伤愈合、和与肺、支气管或肺泡细胞功能丧失相关的疾病(Nishimura等人(2000)Biochimica et BiophysicaActa, 1492:203-206 ;专利公开 W001/36640 ;和专利公开 W001/18172)。虽然 FGF-21 激活FGF受体和下游信号传递 分子，包括FRS2a和ERK，但尚未检测到FGFR与FGF-21的直接相互作用。研究已鉴别了在肝脏、脂肪细胞和胰腺中高表达的β-klotho是FGF-21细胞应答的决定子，也是通过FGFR介导FGF-21信号传递的辅助因子(Kurosu，H.等人(2007) JBiolChem282, 26687-95)。FGF21 是 FGFRl (IIIc)、FGFR2 (IIIc)和 FGFR3 (IIIc) β -klotho 信号传递复合物的强力激动剂。
[0005]FGF-21已表现出诱导不依赖胰岛素的葡萄糖摄入。FGF-21还表现出减轻多种糖尿病啮齿类模型中的高血糖。此外，发现过表达FGF-21的转基因小鼠耐受膳食诱导的代谢异常，并且表现出减少的体重和脂肪质量，和胰岛素敏感性的增强(Badman，M.K.等A (2007)Cell Metab5，426-37)。向糖尿病的非人灵长类施用FGF-21导致空腹血浆葡萄糖、甘油三酯、胰岛素和胰高血糖素水平减少，并导致脂蛋白谱的显著改善，包括HDL胆固醇增加几乎 80% (Kharitonenkov, A.等人(2007) Endocrinologyl48, 774-81)。目前的研究探讨了 FGF21作用的分子机制，已经鉴别FGF21是帮助控制适应空腹状态的重要内分泌激素。(Badman 等人(2009)Endocrinologyl50, 4931) (Inagaki 等人(2007)CellMetabolism5,415)这提供了之前缺乏的PPAR α下游的关联，肝脏藉此与身体的其余部分在调控能量内稳态生物学中沟通(Galman等人(2008)Cell MetaboIism8, 169) (Lundasen等人(2007) Biochemical and Biophysical Research Communications360, 437)。
[0006]FGF21通过激活AMPK/SIRT1/PGC1 α通路，抑制PPAR y表达和增加线粒体功能，来调控脂肪细胞内稳态(Chau等人(2010)PNAS107，12553)。如培养的人肌管和分离的小鼠组织中测量的，FGF21还增加骨骼肌的葡萄糖摄入。啮齿类胰岛细胞的FGF21治疗导致通过激活ERK1/2和Akt通路的改善的功能和存活。(Wente等人(2006)Diabetes55，2470)FGF21治疗还导致啮齿类肝脏中关于脂肪发生和脂肪酸氧化酶的基因表达改变，可能是通过HNF4a和Foxa2信号传递。
[0007]与使用FGF-21直接作为生物治疗剂相关的困难是其半寿期非常短。(Kharitonenkov, A.等人(2005) Journal of Clinical Investigationll5:1627-1635)在小鼠中，人FGF21的半寿期是0.5至I小时，而在食蟹猴中，半寿期是2至3小时。FGF21可以作为多用途的、无菌药物制剂使用。然而，已确定防腐剂，即，间甲酚，在上述条件下对其稳定性具有不利影响。
[0008]在研发用作治疗I型和2型糖尿病和其他代谢病况的治疗剂的FGF21蛋白中，半寿期和稳定性的增加是理想的。具有增强的半寿期和稳定性的FGF21蛋白将允许对要施用所述蛋白质的患者频率较低的给药。明显的，需要研发用于治疗性蛋白质FGF21的稳定的水性蛋白质制剂。
[0009]此外，在研发FGFG21作为蛋白质药剂中的重大挑战是解决其物理和化学的不稳定性。蛋白质的组成变化和特征定义了特殊的行为，如折叠、构象稳定性和解折叠/变性。当目标是利用水性的蛋白质溶液使研发药物制剂条件过程中的蛋白质稳定时，应该解决这类特征(Wang, ff.，Int.J.0f Pharmaceutics, 18，(1999))。稳定目标治疗蛋白(例如本发明的蛋白质)的理想效果是增加对蛋白水解和酶促降解的耐受性，从而改善蛋白质稳定性和降低蛋白质聚集。
[0010]发明概述
[0011]本发明涉及鉴别新型融合蛋白，所述融合蛋白包含成纤维细胞生长因子21 (FGF21)，并且在药剂制剂条件下，具有相比野生型FGF21和其变体改良的药剂特性，例如更稳定、具有改善施用对象的代谢参数的能力、对蛋白水解和酶促降解更不易受、更不可能聚集和形成复合物。本发明的融合蛋白包含FGF21的截短形式、突变和变体。
[0012]还公开了这样的方法，所述方法用于治疗FGF21相关疾病，以及其他代谢的、内分泌的和心血管的病症，如肥胖、I型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂异常、非醇型脂肪肝病(NAFLD)、非醇型脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素耐受、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖、代谢综合征、急性心肌梗塞、高血压、心血管病、动脉粥样硬化、外周动脉病、中风、心脏衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病、胃轻瘫、与胰岛素受体的严重失活突变相关的病症、和其他的代谢病症，和降低垂危患者的死亡率和发病率。
[0013]本发明的融合蛋白可以用作每周一次可注射剂、单独或与口服抗糖尿病剂组合，这将改善I型和2型糖尿病患者的血糖控制、体重和脂类谱。蛋白质还可用于治疗肥胖或其他FGF21相关性病况。
[0014]本发明的融合蛋白通过呈递蛋白质克服了与蛋白质治疗剂相关的，包括例如与施用野生型FGF21相关的生理学不稳定性的显著障碍，所述呈递的蛋白质在药物制剂条件下，比野生型FGF21更稳定、对蛋白水解和酶促降解更不易受、并且更不可能聚集和形成复合物。
[0015]在第一个方面，本发明提供了成纤维细胞生长因子21(FGF21)融合蛋白，所述融合蛋白包含表1列举的，和本文进一步描述的一条或多条序列。表1列举的FGF21序列可以是野生型FGF21序列的变体，例如，具有NCBI参考号NP_061986.1的野生型FGF21序列，并可见于专利公开中，例如属于Ch iron Corporation的US6, 716, 626B1。
[0016]所述融合物可以是在例如变体FGF21序列(例如表1的序列)，和其他分子(非FGF21部分)之间，所述其他分子例如IgG恒定结构域或其片段(例如Fe区)、人血清白蛋白(HAS)或白蛋白结合多肽。在优选的实施方案中，分子的非FGF21部分是Fe区。
[0017]其他实施方案涉及编码本发明的融合蛋白的多核苷酸，含有所述多核苷酸的载体和携带所述载体的宿主细胞。
[0018]本文提供了用于生成本发明的融合蛋白的方法，其中所述方法涉及通过例如在野生型FGF21蛋白的目标位置上位点特异性地掺入氨基酸来修饰野生型FGF21蛋白，以及在分子的FGF21部分与其他分子之间的融合，所述其他分子例如IgG恒定结构域或其片段(例如Fe区)、人血清白蛋白(HSA)或白蛋白-结合多肽。所述修饰和融合增强了本发明的融合蛋白相对于蛋白质的野生型形态的生物学特性，以及在一些情况下，作为例如标签和蛋白质半寿期延长活性剂的连接点，并用于将所述变体固定在固体支持物的表面的目的。本发明的相关实施方案是生产能够生产本发明的所述蛋白质的细胞的方法，和生产能够生产含有编码所述变体和融合物的DNA的载体的细胞的方法。[0019]在多个实施方案中，本文公开的本发明的融合蛋白可包含FGF21野生型序列的一个或多个片段，包括长度小至8-12个氨基酸残基的片段，并且其中多肽能够降低哺乳动物中的血糖。在多个实施方案中，本文公开的本发明的融合蛋白可包括FGF21野生型序列的一个或多个变体，例如，相对于其野生型序列具有一个或多个氨基酸缺失、插入、添加或取代。
[0020]在一些实施方案中，本文公开的本发明的融合蛋白可以与一种或多种聚合物共价连接，例如聚乙二醇(PEG)或多聚唾液酸，不论是在相对于野生型FGF21进行位点特异性氨基酸修饰的位置上，还是在与这些蛋白质的野生型形态通常共享的氨基酸位置上。PEG基团是以这样的方式连接的，所述方式增强，和/或不干扰本发明的融合蛋白的构件部分(例如，FGF21蛋白变体)的生物学功能。在其他实施方案中，本发明的多肽可以与异源氨基酸序列融合，任选通过接头，如GS、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID N0:6)。异源氨基酸序列可以是IgG恒定结构域或其片段(例如Fe区)、人血清白蛋白(HSA)或白蛋白结合多肽。本文公开的这类融合蛋白也可以形成多聚物。
[0021]在一些实施方案中，异源氨基酸序列(例如，HSA、Fe等)与本发明的融合蛋白的氨基端融合。在其他实施方案中，融合异源氨基酸序列(例如，HSA、Fc等)与本发明的蛋白质的羧基端融合。
[0022]另一个实施方案涉及治疗患者的方法，所述患者表现出一种或多种FGF21相关疾病，如肥胖、2型糖尿病、I型糖尿病、胰腺炎、血脂异常、非醇型脂肪肝病(NAFLD)、非醇型脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素耐受、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖、代谢综合征、急性心肌梗塞、高血压、心血管病、动脉粥样硬化、外周动脉病、中风、心脏衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病、胃轻瘫、与胰岛素受体的严重失活突变相关的病症、和其他的代谢病症，所述方法包括向所述需要这类治疗的患者施用治疗有效量的一种或多种本发明的蛋白质或其药物组合物。
[0023]本发明还提供了包含本文公开的本发明的融合蛋白和可药用的配制剂的药物组合物。这类药物组合物可用于治疗代谢病症的方法中，并且方法包括向所述有需要的人类患者施用本发明的药物组合物。可以治疗的代谢病症的非限制性例子包括I型和2型糖尿病，以及肥胖。[0024]在本发明的下列详细说明中，阐明了在本发明的这些和其他方面。
附图简介
[0025]图1A-1D显示了 V188在ob/ob糖尿病小鼠模型中具有相比V76改善的效果。当施用I毫克/千克(mpk)时，V188表现出比施用5毫克/千克V76更好的结果。图1A显示了餐后血浆葡萄糖的读数(圆圈代表载体(PBS-磷酸缓冲盐溶液)、方块代表5mpk的V76，三角代表1mpk的V188)。图1B显示了餐后血浆胰岛素的读数(从左至右:载体、5mpk的V76，和Impk的V188)。图1C显示了体重的读数(从左至右:载体、5mpk的V76，和Impk的V188)。图1D显示了肝脏脂含量的读数(从左至右:载体、5mpk的V76，和Impk的V188)。
[0026]图2A-2D显示了 VlOl在ob/ob糖尿病小鼠模型中具有相比V76改善的效果。当施用I毫克/千克(mpk)时，VlOl表现出比施用5毫克/千克V76更好的结果。图2A显示了餐后血浆葡萄糖的读数(圆圈代表载体(PBS-磷酸缓冲盐溶液)、方块代表5mpk的V76，三角代表1mpk的V101)。图2B显示了餐后血浆胰岛素的读数(从左至右:载体、5mpk的V76，和Impk的V101)。图2C显示了体重的读数(从左至右:载体、5mpk的V76，和Impk的V101)。图2D显示了肝脏脂含量的读数(从左至右:载体、5mpk的V76，和Impk的V101)。 [0027]图3A-3D显示了 V103在ob/ob糖尿病小鼠模型中具有相比V76改善的效果。当施用I毫克/千克(mpk)时，V103表现出比施用5毫克/千克的V76更好的结果。图3A显示了餐后血浆葡萄糖的读数(圆圈代表载体(PBS-磷酸缓冲盐溶液)、方块代表5mpk的V76，三角代表1mpk的V103)。图3B显示了餐后血浆胰岛素的读数(从左至右:载体、5mpk的V76，和Impk的V103)。图3C显示了体重读数(从左至右:载体、5mpk的V76，和Impk的V103)。图3D显示了肝脏脂含量的读数(从左至右:载体、5mpk的V76，和Impk的V103)。
[0028]图4A-4D证实了本发明的融合蛋白具有的相比现有技术中的FGF21融合蛋白更优秀的药代动力学和热动力学的特性。图4A显示了在小鼠中IV注射描述为Fc-L(15)-FGF21(L98R、P171G)和 Fc-L (15)-FGF21 (L98R、P171G、A180E)的 PCT 公开W010/129600中的发明的融合蛋白后，所述融合物的血浆浓度。图4B显示了如抗Fc-ELISA所测定的小鼠单次IV给药后本发明的融合蛋白(V101、V103&V188)的药代动力学特性，与之前使用抗FGF21抗体ELISA的研究中在小鼠中生成的V76药代动力学数据相比。图4C显示了本发明的融合蛋白在抗FGF21Western印迹中的抽样调查，与120小时和15天时的抗Fc-ELISA数据一致。印迹中的样品如下:A代表V101，B代表V103，C代表V188。对照是VlOl和血清。图4D证实了本发明的融合蛋白相比V76显著增加的热动力学稳定性。从上至下的图代表了 VlOl、V103和V188，都具有相比776(1^501:(未显示))和野生型FGFZlOm=46.5 C 土 0.3(未显不))改善的溶解温度(Tm)。
[0029]发明详述
[0030]本发明的蛋融合白质代表了如本领域已知的全长野生型FGF21多肽的修饰的形态。以FGF21野生型序列作为参考序列(SEQ ID NO:1)，例如当需要比较FGF21野生型序列和蛋白质变体时。FGF21野生型序列具有NCBI参考序列号NP_061986.1，并且可见于这类公开的专利中，例如属于 Chiron Corporation 的 US6, 716，626B1 (SEQ ID NO:1)
[0031]
【权利要求】
1.包含FGF21变体和Fe区的融合蛋白。
2.权利要求1的融合 蛋白，其中所述蛋白质的序列选自表1中列举的序列。
【文档编号】A61K47/48GK103945871SQ201280057789
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年9月26日 优先权日:2011年9月26日
【发明者】B·R·贝彻, S·L·卡普兰, D·S·丹尼尔斯, 滨松纪夫, S·利基, S·C·韦尔登 申请人:诺华股份有限公司