用含蠕虫衍生的聚糖的化合物治疗脂肪肝病的方法
【专利摘要】本发明涉及一种包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物(例如包含Lewisx抗原(例如LNFPIII)、非-Lewisx抗原(例如LNnT、LDN和LDN衍生物)或Lewisx和非-Lewisx抗原混合物(例如SEA)的化合物)，其可用作治疗或预防肝脏中与脂肪积累相关的疾病的治疗化合物。本发明化合物用于在患有所述疾病或具有发展成所述疾病风险的受试者中治疗或预防脂肪肝病的发展，并抑制肝细胞中脂肪生成。本发明还涉及通过对患有脂肪肝病的受试者给药包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物，或通过将肝细胞与包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物接触，来调节Erk-c-fos/AP-1-FXRα信号通路的方法。
【专利说明】用含蠕虫衍生的聚糖的化合物治疗脂肪肝病的方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2011年9月23日提交的题目为“用含蠕虫衍生的聚糖化合物治疗月旨肪月干病的方法(Methods of Treating Fatty Liver Disease with Helminth-DerivedGlycan-Containing Compounds)的美国临时申请N0.61/538629的优先权，其全部内容引入本文作为参考。
[0003]发明背景
[0004]在工业化国家的成人和儿童中，以肝脏中脂肪积累为特征的疾病日益盛行，在很大程度上是由于不健康的饮食习惯和肥胖。由慢性过度饮酒导致的酒精性脂肪肝病(AFLD)，基本上遵循一种涉及脂肪变性、脂肪性肝炎(ASH)、炎症、肝硬化，以及在一些情况下涉及肝细胞癌的病理过程。非酒精性脂肪肝病(NAFLD)被认为是最常见的肝脏疾病，其是一个包含一系列类似于AFLD的肝脏病理的术语，所述病理按严重程度排序为从肝细胞脂肪变性(在肝脏中脂肪的积累)、肝硬化、到肝癌。因此，在无酗酒史的患者中，NAFLD呈现AFLD的组织学特征。AFLD和NAFLD的各个阶段具有共同的肝细胞脂肪积累(Reddy等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol2006 ;290:G852_8)。
[0005]美国人口估计有三分之一受到NAFLD的影响(Grattagliano等人，Can FamPhysician2007 ；53:857-863)。NAFLD的发展似乎存在性别偏向，即男性相比于女性更可能患上这种疾病，并且 在更早的年龄患病(Browning等人，Hepatology2004 ；40:1387-95)。NAFLD可逐步从肝脏脂肪变性恶化到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，NASH的特征在于，肝损伤的发展是由肝细胞损伤、炎症细胞的浸润或纤维化证明的。进而，NASH可发展成与用疤痕组织替换的肝细胞相关的肝硬化，并在更恶化阶段，发展成肝细胞癌。NAFLD被认为是肝硬化和肝功能衰竭的重要且常见的病因(Wanless等人，H印atologyl990 ; 12:1106-10)。NAFLD被认为是代谢综合征(MetS)的一部分。与MetS患者类似，大于80%患有NAFLD的个体超重，其中约30%为肥胖(Grattagliano等人，2007)。此外，那些NAFLD患者也常常并发高脂血症、2型糖尿病(T2DM)，并且患有高血压。
[0006]肝脏脂肪变性的特征在于增加的肝脏甘油三酯的积累，甘油三酯的主要来源包括饮食、脂肪酸的从头合成和脂肪组织(Cohen等人，Science2011 ;332:1519-23)。甘油三酯的这种积累进而可以导致胰岛素耐受(Macias-Rodriguez等人，Rev Invest Clin2009 ；61:161-72)。根据多点打击假说，从肝脏脂肪变性到NASH的转变需要多点打击(Day等人，Gastroenterology 1998 ；114:842-5)。由受损的胰岛素敏感性导致的肝脏游离脂肪酸水平的增加可作为第一次打击，其导致了胰岛素耐受、脂肪变性、脂质过氧化作用和增加的炎症细胞积累和活化(Schuppan 等人，Liver International2010 ;30:795-808)。进而，这可能会导致脂毒性和肝细胞生长停滞或凋亡(同上；Feldstein等人，Gastroenterology2003 ；125:437-43)。许多遗传性障碍与肝脏脂肪变性相关，例如Ia型糖原累积病、柠檬素缺乏症和先天性全身性脂肪代谢障碍(Hooper等人，J Lipid Res2011 ;52:593_617 ;Bandsma等人，Pediatr Res2008 ；63:702-7 ;Komatsu 等人，J Hepatol2008 ;49:810-20)。此外，在甘油三酯动态平衡中发挥功能的基因突变也在肝脏脂肪变性的发展中起到一定的作用(Cohen等人，同上)。
[0007]目前尚缺乏已建立的NAFLD治疗，而且大多数治疗取决于对相关疾病，例如肥胖、糖尿病和高脂血症的处理(Angulo等人,Sem Liver Dis.2001 ;21 (I): 81-8)。NAFLD的其他治疗主要针对生活习惯，例如运动和饮食。旨在针对减肥和胰岛素耐受的药物干预疗效是有限的(Mishra等人，Curr Drug Discov Technol2007 ;4:133-40)。然而，一些研究显不出减肥后脂肪变性逆转的迹象，其表明所述病症可能是可逆的，并为发展针对涉及NAFLD发病机制的途径以逆转疾病进程的治疗提供了希望(Eriksson等人，Acta Med Scand.1986 ；220:83-88 ；Sheth 等人，Ann Intern Medl997 ；126(2): 137-45)。AFLD 的主要治疗涉及戒酒(Scaglioni 等人，Dig Dis2011 ;29:202_10)。
[0008]鉴于目前缺乏针对在肝脏中增加的脂肪积累相关的一系列疾病的有效治疗，以及估计未来在世界范围内肥胖和胰岛素耐受患病率的增长，迫切需要发展预防和治疗这些疾病的新方法。缺乏对涉及这些疾病的发病机制清晰的认识进一步加剧了这个问题。更好地了解涉及例如肝脏脂肪生成或AFLD和NAFLD的发展的分子途径将会为制定有针对性的以药物为基础的治疗提供途径。
[0009]发明概述
[0010]本发明是基于，至少部分基于以下发现:包含蠕虫衍生的聚糖的化合物，例如LNFPIII，降低了肝脏炎症并抑制了肝细胞和肝脏的脂肪积累。
[0011]在一个方面中，本发 明提供一种治疗与肝脏中脂肪积累相关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物给药治疗有效量的包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物。
[0012]在另一个方面中，本发明提供一种预防与肝脏中脂肪积累相关的疾病的方法，所述方法包括向有发展成所述疾病风险的哺乳动物给药预防有效量的包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物。
[0013]在一些实施方案中，根据本发明方法治疗或预防的疾病是FLD、NAFLD或AFLD。在一些优选的实施方案中，所述疾病是肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎或酒精性脂肪性肝炎。在另一个实施方案中，所述疾病是代谢综合征。
[0014]在一些实施方案中，本发明方法中使用的包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物降低了哺乳动物中甘油三酯的水平。在相关的实施方案中，包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物阻抑或抑制在哺乳动物的肝脏中的脂肪生成。在其他相关的实施方案中，包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物增加了 FXRa的产生和/或减少肝细胞中SREBP-1c的产生。
[0015]在本发明方法的一些实施方案中，包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物是胃肠外给药，优选腹膜内或静脉给药。在另一个实施方案中，所述化合物是口服给药。
[0016]在另一个方面中，本发明提供一种减少肝细胞中脂肪生成的方法，包括将所述肝细胞与足够量的包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物接触。
[0017]在另一个方面中，本发明提供一种增加细胞(例如肝细胞)中FXRa产生的方法，包括将所述细胞与包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物接触。在一个优选的实施方案中，FXRa是FXR a 3/a 4。在另一个优选的实施方案中，FXR a是FXR a I/a 2。
[0018]在另一个方面中，本发明提供一种增加FXRa转录诱导的基因产物的产生的方法，包括将肝细胞与足够量的包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物接触。在优选的实施方案中，所述基因产物是SHP、OATP1、PLTP和/或BSEP。
[0019]在另一个方面中，本发明提供一种增加肝细胞中Erk-c-fos/APl-FXRa途径活化的方法，包括将肝细胞与足够量的包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物接触。在一个优选的实施方案中，Erk-c-fos/APl-FXRa途径的活化伴随着脂肪生成的减少。
[0020]在一些实施方案中，本发明方法中使用的化合物包括至少一种，或至少两种，蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。在一些实施方案中，蠕虫衍生的聚糖包含Lewisx抗原，非-Lewisx抗原或其组合。在一些优选的实施方案中，本发明方法中使用的化合物包括LNFPII1、LNnT、LDN、LDNF、SEA 或其组合。
[0021]在其它实施方案中，在本发明方法中使用的蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子交联。在一些优选的实施方案中，两种或多种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子交联。在优选的实施方案中，交联的蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物和载体分子的分子量优选为约5，000-100, 000道尔顿，更优选约10，000-40, 000道尔顿。在其它优选的实施方案中，所述交联的缀合物的每个载体分子具有2-200个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子，更优选每个载体分子具有10-100个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子，及甚至更优选每个载体分子具有20-50个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。在一些优选的实施方案中，所述载体是碳水化合物聚合物(例如葡聚糖)、蛋白质(如人血清白蛋白)或聚丙烯酰胺。
[0022]在一个相关的方面中，本发明还提供一种药物组合物，其包含一种或多种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物，其量足够治疗与肝脏中脂肪积累有关的疾病或障碍。本发明也包括包含本发明组合物的试剂盒。 [0023]本发明的其它特征和优点从下面详细的描述和权利要求书中是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1A描绘了用载体、LNFPIII或SEA治疗的小鼠的肝脏切片的显微照片。在实验持续时间内，将雄性C57BL/6J小鼠(8-10周龄)置于高脂肪、高碳水化合物饮食。进行6周该饮食后，对小鼠注射25 μ g葡聚糖(载体hZSygLNFPII1-葡聚糖(LNFPII1-DEX)或25 μ g SEA(0.9%NaCl中)，每周2次，如所示。SEA实验的载体是0.9% NaCl。治疗的第6周处死小鼠以进行组织采集和组织学研究。
[0025]图1B是描绘用载体或LNFPIII治疗小鼠(左图)或用SEA(25 μ g在0.9% NaCl中)治疗小鼠(右图)的肝脏中的甘油三酯水平的柱状图。结果表示为平均值土标准差。*Ρ〈0.05。
[0026]图1C是描绘用载体或LNFPIII治疗小鼠(η = 5/组)的肝脏中参与炎症、脂肪生成和氧化的基因的相对mRNA表达的柱状图，其是用实时q-PCR评估的。结果表示为平均值土标准差。*P〈0.05。
[0027]图1D是描绘在用载体或LNFPIII治疗的小鼠的循环中天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平的柱状图。结果表示为平均值土标准差。*P〈0.05。
[0028]图1E是描绘在用载体或SEA治疗的小鼠的循环中AST和ALT水平的柱状图。结果表示为平均值土标准差。*p〈0.05。[0029] 图2k是显示在体外用载体(20 μ g/ml)或LNFPIII (20 μ g/ml)处理24小时的原代肝细胞中脂肪生成程度(左图)或β_氧化作用(右图)的柱状图。结果表示为平均值土标准差。*ρ〈0.05。
[0030]图2Β是描绘用载体或LNFPIII处理24小时的原代肝细胞中所示基因的mRNA表达水平的柱状图。LNFPIII增加FXRa和SHP的表达，但下调脂肪生成基因。结果表示为平均值土标准差。*P〈0.05。
[0031]图2C是FXRa启动子基因组结构的示意图，该启动子显示用于驱动人FXRa I/a 2表达(启动子I)和FXRa 3/a 4(启动子2)的替代启动子。
[0032]图2D和图2E是描绘在用载体或LNFPIII (图2D) (η = 5/组)或载体(0.9% NaCl)和SEA (25 μ g在0.9% NaCl中)(图2Ε)治疗的小鼠的肝脏中，在FXR α信号通路中发挥功能的基因的mRNA表达水平的柱状图，其是用实时q-PCR评估的。结果表示为平均值土标准差。*P〈0.05。
[0033]图2F是描绘在用载体或LNFPIII (η = 6/组)治疗的FXRa +小鼠的肝脏中涉及脂肪生成和β -氧化的基因的相对mRNA表达的柱状图，其是用实时q-PCR评估的。
[0034]图2G是描绘从用载体、LNFPIII或SEA治疗的野生型或FXR a +小鼠的原代肝细胞中分离的脂肪生成和β_氧化的柱状图。将所述细胞处理24小时。结果表示为平均值土标准差。*P〈0.05。LNFPIII和SEA在肝细胞中抑制脂肪生成和增加β-氧化作用的能力依赖于FXRa。
[0035]图2Η是描绘用或不用LNFPIII治疗(η = 6/基因型)的野生型和FXR+小鼠中的肝甘油三酯浓度的柱状图。结果表示为平均值土标准差。*Ρ〈0.05 (LNFPIIIvs.载体对照)。
[0036]图21是描绘用或不用LNFPIII治疗(η = 6/基因型)的野生型和FXR+小鼠中的血清AST和ALT浓度的柱状图。结果表示为平均值土标准差。*Ρ〈0.05 (LNFPIII vs.载体对照)。
[0037]图3A是人、大鼠和小鼠FXRa下游启动子(启动子2)的5’近端调控区的序列比对。显示了假定的C/EBP (位点I)和AP-1 (位点2和3)的结合位点和进行报告基因分析的突变序列。
[0038]图3B是描绘用或不用LNFPIII (20 μ g/ml)或SEA (2 μ g/ml)处理的由人FXR α启动子I的2kb片段或人FXR α启动子2的0.13kb驱动的荧光素酶报告构建体转染的H印G2细胞的荧光素酶报告基因分析的柱状图。结果表示为平均值土标准差。*P〈0.05。
[0039]图3C是描绘用或不用LNFPIII (20 μ g/ml)或SEA(2 μ g/ml)处理的原代肝细胞中内源性FXR a I/ a 2和FXR a 3/ a 4基因的mRNA水平的柱状图。结果表示为平均值土标准差。*Ρ〈0.05。
[0040]图3D (上图)是显示FXRa启动子2 (p2_0.13kb)或突变体(p2_0.13kb_M)结构的示意图。指定转录起始位点为I。显示了两个重叠的APl结合位点和引入的突变的序列。图3D (下图)是描绘在存在或不存在Erk抑制剂Η)98059(10μΜ)的情况下，在用或不用载体或LNFPIII处理的H印G2细胞中使用所示构建体进行的荧光素酶报告基因分析的柱状图。细胞在过夜LNFPIII处理前用PD98059预处理一小时。结果表示为平均值土标准差。*Ρ〈0.05。[0041]图3E是描绘在用载体或SEA处理的HepG2细胞中使用位点I突变体、位点2突变体或位点3突变体荧光素酶报告构建体进行的荧光素酶报告基因分析的柱状图。位点如图3A中定义。结果表示为平均值土标准差。*P〈0.05。FXRa启动子2的诱导是由位点3的APl结合序列介导的。在位点I和2的突变没有影响。用LNFPIII获得了类似的结果(数据未显示)。
[0042]图3F (上图)是在从用载体或LNFPIII治疗的小鼠(η = 5，显示代表性的3个样品/治疗)制备的肝裂解物中磷酸-Erk(p-Erk)和总Erk(t-Erk)水平的免疫印迹。肌动蛋白水平作为加载对照。图3F(下图)是描绘图3F(上图)的免疫印迹的光密度分析的柱状图。结果表示为平均值土标准差。*P〈0.05。
[0043]图3G(左图)是在用载体、LNFPII1、PD90859或LNFPIII+PD90859处理的原代肝细胞中磷酸-Erk(p-Erk)和总Erk(t-Erk)水平的免疫印迹。细胞在过夜LNFPIII处理前用PD98059预处理I小时。肌动蛋白水平作为加载对照。图3G(右图)是描绘图3G(左图)的免疫印迹的光密度分析的柱状图。结果表示为平均值土标准差。
[0044]图3H是在用载体、SEA或SEA+PD98059处理的原代肝细胞中p_Erk和t_Erk水平的免疫印迹。细胞在过夜SEA处理前用TO98059预处理一小时。肌动蛋白水平作为加载对照。
[0045]图31 (左图)是描绘在用载体、LNFPII1、PD98059或LNFPIII+PD98059处理的WT和FXRa +肝细胞中脂肪生成活性的柱状图。细胞在过夜LNFPIII处理前用PD98059预处理I小时。结果表示为平均值土标准差。*P〈0.05。LNFPIII抑制肝细胞中脂肪生成的能力依赖于Erk活性和FXRa。图31( 右图)是描绘在用载体、LNFPII1、PD98059或LNFPIII+PD98059处理的WT和FXRα +肝细胞中β-氧化作用的柱状图。如脂肪形成试验中所述对细胞进行处理。结果表示为平均值土标准差。*P〈0.05。LNFPIII增加肝细胞β-氧化作用的能力依赖于Erk活性和FXRa。
[0046]图3J是描绘在用载体、SEA或SEA+PD98059处理的肝细胞中脂肪生成活性的柱状图。细胞在过夜SEA处理前用PD98059预处理I小时。结果表示为平均值土标准差。*Ρ〈0.05。SEA抑制肝细胞中脂肪生成的能力依赖于Erk活性。
[0047]图4Α是描绘在用载体(第一栏)、5 μ g LNnT (第二栏)或20 μ g LNnT (第三栏)处理的肝细胞中脂肪生成活性的柱状图。结果表示为平均值土标准差。*P〈0.05。
[0048]图4B (上图)是显示用于驱动人FXR a I/a 2和FXR a 3/a 4表达的替代启动子的FXRa启动子结构示意图。图4B(下图)是描绘用带或不带LNnT的人FXRa I/a 2启动子或FXRa 3/ a 4启动子驱动的荧光素酶报告构建体转染的HepG2细胞的荧光素酶报告分析的柱状图。结果表示为平均值土标准差。*P〈0.05。
[0049]图5是Erk-c-fos/APl-FXRa轴信号通路的示意图。
[0050]发明详述
[0051]在本发明之前，已知包含Lewis抗原(例如LNFPIII)的化合物能够通过免疫细胞调节细胞因子的产生(如IL-10、IL-4和IL-5)，所述免疫细胞可使Thl或Th2反应的发展偏离，该反应已知对于许多疾病状态，例如自身免疫性疾病、癌症和感染性疾病的发展和进行是至关重要的。例如，已显示Lewis抗原化合物的刺激性形式引发抗原特异性免疫应答(IgG应答)，而抑制性形式抑制过敏性反应(IgE应答)(例如，参见美国专利号6，540，999、6，841，543和7，799，755)。然而，含Lewis抗原化合物(例如LNFPIII)在其它临床方面的作用和这些化合物靶向的信号通路基本上是未知的。
[0052]因此，本发明是基于，至少部分地基于意外的发现，即包含蠕虫衍生的聚糖或其糖缀合物的化合物(例如，包含Lewisx抗原(例如LNFPIII)、非-Lewisx抗原(例如LNnT、LDN、其衍生物)或Lewisx和非-Lewisx抗原的混合物(例如SEA)的化合物)可以激活Erk，随后激活AP-1转录复合物，诱导FXRa和FXR α靶向基因的表达，并由FXRa介导抑制肝细胞中脂肪生成。脂肪生成基因表达的减少伴随着肝细胞和肝脏中甘油三酯水平的减少和脂肪酸β_氧化作用的增加。
[0053]因此，本发明提供了一种用包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物(例如，包含Lewis抗原的化合物，如LNFPIII和SEA)的化合物来治疗或预防以在肝脏中炎症的增加和脂肪积累为特征的疾病的方法。本发明方法可用于治疗或预防在患有或有发展疾病的风险的受试者中脂肪肝病(FLD)的发展，和用于抑制肝细胞中的脂肪生成。本发明还提供通过给患有脂肪肝病的受试者施用包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物，或使肝细胞与包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物接触来调节Erk-c-fos/AP-1-FXRa信号通路的方法。
[0054]Erk属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)亚家族,其通过连续磷酸化的活化是继发于细胞外刺激与其细胞表面受体的结合。活化时，Erk磷酸化并活化各种细胞质和细胞核蛋白，并介导多种生物学反应，包括那些控制细胞生长和分化的反应。在本发明的内容中，用包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物(例如，包含Lewis抗原如LNFPIII和SEA的化合物)来治疗肝细 胞或受试者，增加了 Erk的活性。
[0055]AP-1复合物是通过c-fos，一种bZIP型转录因子，与c_jun的二聚化形成的。AP-1复合物是由响应于细胞外信号的MAPK信号级联激活的。在本发明的内容中，用包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物(例如，包含Lewis抗原如LNFPIII和SEA的化合物)来治疗肝细胞或受试者，增加了 AP-1的活性。
[0056]FXR，或胆酸受体，是一种在肝和肠中高度表达的核受体。FXR是负责调节胆酸平衡的关键的转录因子中的一个(Forman等人，Celll995 ；81:687-93)。活化时，FXR转位到细胞核，与结合配体二聚化，并结合到DNA上的激素效应元件上。FXR的靶向基因可以是直接的或间接的。靶向基因的直接调控可通过直接结合于DNA上的激素效应元件而发生。转录靶点的间接调控可通过中间体发生。例如，FXR可诱导小异二聚体伴侣(SHP)蛋白的表达，其随后可以抑制靶向基因的转录。在机理上，已证明FXR介导的SHP的诱导可降低主要脂肪生成调节因子 SREBP-1c 的表达(Watanabe 等人，J Clin Invest2004 ；113:1408-18)。FXRa靶向基因的一些实例包括SHP、有机阴离子转运蛋白I (OATPl)、磷脂转运蛋白(PLTP)和胆汁盐排泄泵(BSEP)。在本发明的内容中，用包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物，例如LNFPIII和SEA的化合物对肝细胞或受试者进行的治疗增加了 FXRa，特别是对FXRa 3/a 4的产生。用SEA对肝细胞或受试者进行的治疗增加了 FXR a I/ a 2和FXR a 3/ a 4的产生。
[0057]针对用包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物(例如，包含Lewis抗原如LNFPIII和SEA的化合物)治疗而下调的脂肪生成基因，其包括SREBP-1c以及其下游的转录靶向基因[例如，脂肪酸合酶(FAS)、乙酰-辅酶A羧化酶-1 (ACCl)、乙酰-辅酶A羧化酶-2 (ACC2)、硬脂酰辅酶A去饱和酶I (S⑶I)]。SREBP-1c为甾醇调节因子结合蛋白(SREBPs)的成员，其是属于bHLH-Zip家族的转录因子(Yokoyama等人，Celll993 ；75:187-97)。这些转录因子结合到留醇调节因子(SRE)上，其存在于编码酶的基因上，该酶参与胆固醇或脂肪酸生物的合成(Rawson等人，MCB2003 ；4:631-40)。
[0058]本发明的各种组合物和方法在下文中进行了详细地描述。虽然在本文中例举了具体组合物和方法，可以理解的是，任何替代的组合物和方法均是适用的并适用于本发明的实施。
[0059]定义
[0060]除非另有说明，否则本文使用的所有术语具有与本领域技术人员已知的意思相同的含义，并且本发明的实施将采用微生物学和重组DNA技术的常规技术，其是在本领域技术人员的知识范围内的。除非另有说明，本发明的实践将采用本领域技术范围内的病毒学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法。这些技术在文献中得到充分说明。参见，例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (目前版)，DNA Cloning:A Practical Approach, vol.1&II(D.Glover 编)；01igonucleotideSynthesis (N.Gait 编，目前版)；Nucleic Acid Hybridization (B.Hames&S.Higgins 编，目前版)！Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins编，目前版)；CRC Handbookof Parvoviruses, vol.1&II (P.Ti jssen编)！Fundamental Virology,第二版,vol.1&II (B.N.Fields 和 D.M.Knipe 编)
[0061]本文所用术语“Lewis抗原”是指包括具有乳I型结构{Gal ( β 1_3) GlcNac}或乳II型结构{Gal(i3 l-4)GlcNac}作为核心序列的碳水化合物，其被一个或多个岩藻糖残基取代。Lewis抗原可以包含单取代的核心序列或重复序列取代的核心序列。此外，核心序列可以存在于一个较大的糖内。因此，含Lewis抗原的寡糖可以是，例如，三糖、四糖、五糖等。Lewis抗原的类型包括Lewisx、Lewisy、Lewisa和Lewisb寡糖及其衍生物。这些保留本文所述的免疫调节能力的碳水化合物的合成的结构同系物也旨在通过术语“Lewis抗原”所涵盖。
[0062]本文所用术语“Lewisx寡糖”是指包含结构:{Gal ( β 1-4) [Fuc ( α 1-3) ]GlcNac}的乳II型碳水化合物。
[0063]本文所用术语“Lewis7寡糖”是指包含结构:{Fuc ( α 1-2) Gal (β 1-4)[Fuc (a 1-3)] GlcNac}的乳II型碳水化合物。
[0064]本文所用术语“Lewisa寡糖”是指包含结构:{Gal ( β 1-3) [Fuc ( α 1-4) ]GlcNac}的乳I型碳水化合物。
[0065]本文所用术语“Lewisb寡糖”是指包含结构:{Fuc ( α 1-2) Gal ( β 1-3)[Fuc (a 1-4)] GlcNac}的乳I型碳水化合物。
[0066]如本文所用的，Lewis寡糖的“衍生物”是指具有一个或多个额外的取代基的Lewis寡糖。衍生物的实例包括Lewis寡糖的末端唾液酸化形式(例如，唾液酸化-Lewisx、唾液酸化-Lewis'唾液酸化-Lewisa、唾液酸化-Lewisb)、Lewis寡糖的硫酸化形式以及Lewis寡糖的磺基-唾液酸化的形式。
[0067]本文所用术语“SEA”是指血吸虫卵抗原或可溶性卵抗原，其包含Lewisx和非-Lewisx抗原。“SEA-衍生的聚糖”是指存在于SEA的各种不同的多糖种类，例如但不限于，LNFPII1、LNnT、LDN 和 LDNF。
[0068]本文所用术语“LN”是指具有结构:{Gal(P l_4)GlcNAc}的糖。
[0069]本文所用术语“LNFPIII” 是指具有结构:{Gal(P 1_4) [Fuc ( α 1-3)]GlcNAc (β 1-3) Gal (β 1-4) Glc}并包含 Lewisx 抗原的化合物。
[0070]本文所用术语“LNnT”(乳_N_新四糖)是指具有核心结构:{Gal ( β 1-4)GlcNAc (β 1-3) Gal(^ 1-4) Glc}的聚乳糖胺糖。LNnT是LNFPIII的非岩藻糖基同系物。
[0071]本文所用术语“LDN”(LacdiNAc)是指具有结构:{GaINAc ( β l_4)GlcNAc}的糖。岩藻糖基LDN，即本文中称为“LDNF”具有结构:{GalNac ( β 1-4) (Fuc α 1-3)GlcNAc β 1}。LDN的其他岩藻糖基衍生物包括但不限于，LDN-DF {GalNAc ( β 1-4)[Fuc ( α 1-2) Fuc ( a 1-3)] GlcNAc β I}、F-LDN {Fuc ( α 1-3) GalNAc (β 卜 4) GlcNAc β I}、F-LDN-F{Fuc(α 1-3)GalNAc(β 1-4)[Fuc(α 1-3)]GlcNAcβ 1}和 DF-LDN-DF{Fuc(α 1-2)Fuc ( α 1-3)GalNAc(β 1-4)[Fuc(α 1-2)Fuc(α 1-3)]GlcNAc β 1}(Peterson 等人，Int JParasitology2009 ;39:1331-44 ;Hokke 等人，Exp Parasitology2007 ;117:275-83)。LDN及其岩藻糖基衍生物均被认为是在本发明的范围之内。
[0072]本文所用术语“蠕虫衍生的聚糖”指的是存在于在真核寄生虫中的聚糖种类，该寄生虫被分类为螺虫，如Jonhston等人，Parasitology2009 ；136:125-47和Die和Cummings, Glycobiology2010 ;20:2-12所述(例如但不限于血吸虫属，例如曼氏血吸虫；肝片吸虫属,例如肝片形吸虫；棘球绦虫属,例如房棘球绦虫的蠕虫)。该聚糖包括含Lewisx抗原(例如LNFPIII)、非-Lewisx抗原(例如LNnT和LDN(和LDN衍生物))的化合物、或Lewisx和非-Lewisx抗原 的混合物(例如SEA)。本文所用的“糖缀合物”是指与载体分子交联的聚糖分子，例如缀合于，例如脂质(例如糖脂、磷脂)、蛋白的蠕虫衍生的聚糖。
[0073]本文所用术语“多价蠕虫衍生的聚糖或其糖缀合物”意指合成的构建体，其包含含有一种或多种蠕虫衍生多糖的寡糖的多个拷贝，例如一种形式，其中多个含有LNFPIII的寡糖缀合至载体分子。“多价蠕虫衍生的聚糖或其糖缀合物”也可以指一种形式，其中多种不同的蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物种类缀合至载体分子。在一个非限制性的实施例中，一个载体分子可结合有两个或更多的LNFPII1、LNnT、LDN和LDNF。
[0074]本文所用术语“脂肪肝病”(FLD)旨在包括酒精性脂肪肝病(AFLD)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
[0075]本文所用术语“酒精性脂肪肝病”旨在包括酒精性肝脂肪变性(ASH)和酒精性脂肪性肝炎。AFLD是由饮酒史引起的肝细胞中脂肪积累导致的(Reddy等人，同上)。
[0076]如本文所用的，“非酒精性脂肪肝病”意指没有过度饮酒史的个体的肝细胞中脂肪积累导致的病症谱。最轻的形式的NAFLD是指肝细胞脂肪变性。术语NAFLD也旨在包括更严重和高级形式的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝细胞癌和病毒诱导的(例如HIV，肝炎)脂肪肝病。
[0077]本文所用术语“受试者”或“个体”或“患者”是指包括患有或有发展FLD风险的人类和非人类动物。本发明的术语“哺乳动物”包括所有脊椎动物，例如人类、非人类灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、啮齿类动物和转基因非人类动物。术语“受试者”、“个体”和“哺乳动物”是可互换的。
[0078]本文所用术语“接触”(即将细胞与化合物接触)是指包括在体外将化合物和细胞一起培养(例如，将化合物加至培养中的细胞)以及将化合物给药至受试者，使得该化合物与受试者的细胞在体内接触。
[0079]如本文所用的术语“治疗”是指对受试者施用或给药含蠕虫衍生的聚糖、含蠕虫衍生的聚糖的糖缀合物或其组合的组合物，以减少、减轻、抑制FLD的发展或部分地或全部地消除FLD的一种或多种病症或症状(治疗)。本文所用术语“治疗”是指治疗的行为。
[0080]如本文所用的术语“预防”或“防止”是指对受试者施用或给药包含蠕虫衍生的聚糖、包含蠕虫衍生的聚糖的糖缀合物或其组合的组合物，以抑制、避免或消除疾病的发作或发展(预防)。
[0081]如本文所用的术语“足够量”或“有效量”可互换使用，是指达到所需结果所必需的量。例如，足够量或有效量的含蠕虫衍生的聚糖、糖缀合物的化合物(例如，SEA、LNFPII1、LnNT, LDN或LDNF)或其组合导致以下的一种或多种:与载体或对照相比，体外肝细胞或体内肝脏中，涉及脂肪生成的一种或多种基因的表达减少、Erk磷酸化增加、c-fos/APl转录活性增加、FXRa基因转录增加和/或FXRa基因转录靶点的产生增加。有效量或足够量的含蠕虫衍生的聚糖、糖缀合物的化合物(例如，SEA、LNFPII1、LnNT、LDN或LDNF)或其组合的也指无论是单独使用或与药学上可接受的载体组合使用，有效治疗或预防一种或多种与FLD有关的症状或病症的量。这些效果可以通过使用本领域已知的常规诊断技术来确定，并可能表现为受试者存活的延长、受试者遭受的症状的减轻或受试者疾病发作的预防。
[0082]类似地，术语“治疗有效量”是指在剂量和必需的时间周期达到所需治疗效果的有效量。包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物(例如，包含Lewis抗原，如LNFPIII和SEA的化合物)的治疗有效量可根据因素，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及载体在个体中引发所需应答的能力而变化。治疗有效量也是治疗有益效果胜过任何毒性或有害作用的量。例如，治疗有效量是在剂量和必需的时间周期上实现肝脂肪含量减少，从而影响特定疾病状态的治疗进程的有效量。本文所用术语“预防有效量”是指在剂量和必需的时间周期达到理想的预防效果(例如，作为预防目的来减少或抑制肝脏中的脂肪积累)的有效量。通常，由于预防剂量是在受试者发病之前或在疾病的早期阶段使用，因此预防有效量小于治疗有效量。
[0083]在下面的小节中进一步详述本发明的各个方面。
[0084]1.用于治疗或预防FLD的化合物
[0085]可在本发明方法中使用的化合物通过抑制肝细胞中脂肪生成和/或防止肝脂肪变性来抑制肝脏中脂肪的积累。
[0086]在一个实施方案中，在本发明方法中使用的化合物包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物，例如，包含Lewis抗原的化合物。Lewis抗原可以是,例如，Lewis\ Lewisy>Lewisa或Lewisb寡糖,或其衍生物。在治疗肝细胞的一些实施方案中，Lewis抗原优选是Lewisx。Lewis抗原也可以存在于较大的碳水化合物结构中。例如，所述化合物的碳水化合物部分可以是乳-N-岩藻五糖III (LNFPIII)，其具有结构:{Gal(i3 1_4) [Fuc ( a 1-3)]GlcNAc (β 1-3) Gal (β 1-4) Glc}并包含 Lewisx 寡糖。
[0087]非Lewis多糖包括但不限于，IacdiNAc (LDN)，其具有结构:{GalNAc ( β 1-4)GlcNAc};和岩藻糖基 LacdiNAc (LDNF)，其具有结构:{GalNAc ( β 1-4) (Fuc α 1-3)GlcNAcPl}。在另一个实施方案中，所述化合物可以包含SEA-衍生的聚糖。在另一个实施方案中，蠕虫衍生的聚糖是乳-N-新四糖(LNnT)，其具有核心结构:{Gal (β 1-4)GlcNAc(β 1-3)Gal(β 1-4)Glc}。
[0088]适合用作本发明化合物的包含Lewis或非-Lewis抗原的其他相关的碳水化合物对于本领域技术人员将是显而易见的。在一个优选的实施方案中，蠕虫衍生的聚糖是LNFPIII。在另一个实施方案中，在本发明方法中使用的化合物可以同时或分开地组合给药。
[0089]在具体实施方案中，在本发明方法中通常使用的含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物，其碳水化合物结构是以多价交联的形式存在的。在一个优选的实施方案中，包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物是载体分子与表达蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的多种碳水化合物分子的缀合物。例如，碳水化合物分子可以缀合至蛋白载体，例如人血清白蛋白(HAS)和Lewisx寡糖的缀合物(本文中称为HSA-Lewisx)。当将糖-载体蛋白缀合物给药至受试者，应选择在受试者中不会刺激载体蛋白产生免疫反应的载体蛋白(例如，应对人受试者使用人载体蛋白，等等)。
[0090]替代载体蛋白，表达Lewis或非-Lewis抗原的碳水化合物分子可缀合至其他载体分子，例如保护该化合物免于从体内快速消除的载体，如控释制剂，其包括移植物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见。所述材料也可从商业途径获得，例如，Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc.。脂质体混悬液(包括靶向被单克隆抗体感染的细胞至病毒抗原的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的，例如美国专利第4，522，811号所描述的方法制备。
[0091]其它优选的载体包括聚合物，例如碳水化合物或多糖聚合物。优选的碳水化合物聚合物是葡聚糖。通常，用作载体分子的碳水化合物或多糖具有约5，000-100, 000道尔顿的分子量，优选在约8，000-80，000道尔顿之间，更优选约10，000-50，000，或10，000-40, 000 道尔顿。
[0092]相对于缀合到载体的糖的密度，所述糖分子优选包含缀合物按重量计的至少10%，更优选缀合物按重量计的至少15%，甚至更优选缀合物按重量计的至少20%和甚至更优选缀合物按重量计的至少25%或缀合物按重量计的至少30%或缀合物按重量计的至少35 %或缀合物按重量计的至少40 %或缀合物按重量计的至少45 %。在具体实施方案中，所述糖分子包含缀合物按重量计的约10-25%，缀合物按重量计的约15-25%或缀合物按重量计的约20-25%或缀合物按重量计的约30-35%或缀合物按重量计的约35-40%或缀合物按重量计的约40-45%。在一些实施方案中，缀合物包含10-11、12-13、14-15、16-17、18-19或20个或更多的糖/缀合物。甚至更优选地，包含表达Lewis抗原的碳水化合物的化合物是包含25、30、35、40、45、50或更多糖/缀合物的缀合物。在一个优选的实施方案中，包含表达Lewis抗原的碳水化合物的化合物是表达Lewis抗原的多种碳水化合物分子和载体聚丙烯酰胺的缀合物。更优选地，所述聚丙烯酰胺缀合物包含25-30(或更多)的糖/缀合物，其中所述缀合物的平均分子量是约30KD。可选地，化合物或与Lewis抗原组合，可以包含表达非-Lewis抗原的碳水化合物。
[0093]除了上述包含含有Lewis和/或非-Lewis抗原的糖的缀合物,其它包含Lewis和/或非-Lewis抗原的化合物包括分离的蛋白，该蛋白天然地以适于抑制脂肪形成和预防或治疗FLD的形式包含Lewis和/或非-Lewis抗原。这样的蛋白的一个实例是血吸虫卵抗原(SEA)，其表达Lewisx和非-Lewisx寡糖。SEA可以从各种物种中分离。该血吸虫属包含具有不同生命周期的21种蠕虫。其中的三个认为是导致人类血吸虫病的主要种类-曼氏血吸虫、日本血吸虫和埃及血吸虫。已经显示这三种蠕虫的卵诱导人的Th2表型。这三种蠕虫的抗原包含模拟宿主多糖的多糖。其包括，例如，Lewis'伪Lewis7、LDN，LDNF、高甘露糖型和LN多糖。在大多数种类的血吸虫卵中发现类似结构的多糖。曼氏血吸虫和日本血吸虫是肝脏寄生虫，表明它们在肝脏和肝循环中产卵。已经报告了的表达Lewis抗原的其他蛋白包括肿瘤相关抗原(参见例如，Pauli等人，Trends in Glycoscience andGlycotechnology1992 ；4:405-14 ；Hakomori, Adv Cancer Resl989 ;52:257-331)和 HIVgpl20(Adachi 等人，J Exp Medl988 ; 167:323-31)。
[0094]用于本发明方法的化合物可市售购得的或者可以通过标准方法纯化或合成。例如，含Lewis抗原的糖和载体蛋白(例如HSA)的缀合物可从Accurate Chemicals,Westbury, N.Y.购买。含Lewis抗原的糖和聚丙烯酰胺的缀合物可从GlycoTech,Rockville, Md 购买。LNFPIII 可从 Sigma-Aldrich (USA)购买。血吸虫卵抗原(SEA)可以如Harn等人，(1984) J.Exp.Med.159:1371-1387描述的从曼氏血吸虫卵纯化。含Lewis抗原的糖或其衍生物可以通过标准方法，例如使用化学交联剂，将其缀合至载体分子。各种双官能团或多官能团的交联剂，无论是同种和异种功能的，都是本领域已知的并且是商购的(例如，Pierce Chemical C0.,Rockford, 111.)。可以将多于一种螺虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物缀合到单一载体上。在一个非限制性的实施方案中，可以将一个或多个LNFPII1、LnNT、LDN和LDNF缀合到相同的载体分子上。可以通过将蠕虫衍生的聚糖的混合物，而不是单一的蠕虫衍生的聚糖缀合到载体分子上实现这样的缀合。
[0095]可以使用标准方法生成蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的多价形式。例如，使用本领域已知的技术将蠕 虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖部分结合到多价载体上从而形成缀合物，其中寡糖的多于一个的单一分子共价结合到多价载体上。多价载体是足够大的，以提供多价分子寡糖部分的2-1，000 (即P = 2-1，000的整数)，优选2-200，优选2-100，更优选10-100，更优选为2-50，更优选10-50，甚至更优选20-50个分子结合到所述多价载体上。在具体优选的实施方案中，13、25、35、45、50、100或200个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的分子，例如LNFPIII结合到多价载体上。
[0096]合适的多价载体包括具有多个结合位点的化合物，该结合位点能够与末端连接基团形成键(该末端连接基团能够结合到还原性末端糖上)，或该结合位点能够与葡萄糖或N-乙酰葡萄糖胺残基的Cl糖苷氧形成键。实例包括但不限于，多元醇、多糖、多聚赖氨酸抗生物素蛋白、聚丙烯酰胺、碳水化合物(例如葡聚糖)、脂质、脂质乳剂、脂质体、树枝状聚合物、蛋白质(例如人血清白蛋白(HAS)、牛血清白蛋白(BSA))或环糊精。
[0097]构建多价分子和将寡糖连接到所述多价载体所必需的化学是连接化学领域公知的。本发明连接化学的非限制性实施方案包括美国专利第5，736，533号，Stowell等人(Stowell 等人，Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry1980 ；37:225)和 Smith 等人(Smith 等人，(1978) Complex Carbohydrates part C, Methods inEnzymology, volume L, Ed.by V.Ginsburg, pg.169)描述的方法，每一种方法全部引入本文作为参考。
[0098] 例如，还原性末端糖与载体分子之间的键可以通过以下形成:将还原性末端糖Cl的醛或羧酸或由氧化引入的还原性末端糖的任何醛或羧酸基团与载体分子反应，以形成一个合适的键，例如一NH--、--N(R’)_，其中R’是C1-20烷基、羟基烷胺、酰胺、酯、硫酯、硫代酰胺。还原性末端糖与载体分子之间的键也可以通过如下形成:将吡喃糖形式的Cl羟基与酰化剂和分子卤反应，接着与亲核试剂反应以形成合适的键，例如形成一NH--、--N(R’)一、其中R’是C1-20烷基(如Stowell等人所述，同上)。该寡糖部分可以通过还原性末端糖的自由异头碳结合到多价载体上。或者，还原性末端糖可以通过Smith等人所述的苯乙胺-异硫氰酸酯衍生物进行结合。可用于形成多价缀合物的各种其它的双官能和多官能交联剂是本领域已知的并且易于获得(例如，Pierce Chemical C0., Rockford, 111.)。
[0099]I1.分析
[0100]通过本领域中已知的方法可以容易地确定本发明方法中包含任何Lewis和/或非-Lewis抗原的化合物的有效性，该方法测量脂肪生成的一个以上的特性。
[0101]例如,可以使用体外分析法,其中将肝细胞与包含Lewis和/或非-Lewis抗原的化合物接触，然后进行测试以确定该化合物是否抑制脂肪生成。本文所使用的脂肪形成的抑制是指与载体或对照处理的样品或动物，或治疗前的对照相比，给药包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物或组合物(例如包含Lewis抗原，如LNFPIII和SEA的化合物)，甘油三酯浓度降低，和/或脂肪生成基因表达和活性降低。
[0102]在具体实施方案中，在本发明方法中有用的包含蠕虫衍生的聚糖和/或糖缀合物的化合物导致一种或多种脂肪酸，优选甘油三酯水平的降低。在优选实施方案中，甘油三酯的水平降低至少10 %，至少20 %，至少30 %，至少40 %，至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80%或至少90%或更多。可以使用从例如,Sigma-Aldrich (USA)市售的试剂盒并按照制造商的说明，对甘油三酯水平进行酶学分析。用于甘油三酯水平分析的肝组织的制备可以如例如Hong等人(Hepatology204 ；40:933-941)所公开的进行。使用市售的试剂盒(例如，Sigma, USA ；Bayer Diagnostics, USA)并按照制造商的说明可以测定循环的AST和ALT水平。培养的肝细胞或肝组织中脂质积累的水平可以使用本领域公认的方法，例如，油红O染色(例如，Rector等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol2008 ；294:G619-G626)进行测定。
[0103]在具体实施方案中，在用本发明方法的包含Lewis抗原的化合物治疗时，在本发明方法中有用的包含蠕虫衍生的聚糖和/或糖缀合物的化合物降低了一种或多种脂肪生成基因(例如，SREBP-1c、FAS、ACCl、ACC2、SCDI)的表达至少10%、至少20%、至少30%,至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多。测定mRNA或表达蛋白的水平的方法可以通过本领域认可的方法进行，包括但不限于，例如Western印迹、ELISA、斑点印迹、放射免疫分析和流式细胞术、Northern印迹、RT-PCR和实时qPCR。
[0104]在一个实施方案中，包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物在调节Erk-c-fos/APl-FXRa信号轴中的有效性可以通过本领域已知的方法，例如实施例中描述的方法容易地确定。例如，培养的肝细胞可以用载体或包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物过夜处理、裂解，并将提取物进行处理用于免疫印迹和/或实时定量PCR分析。该途径的激活是通过以下来证明:Erk活性的增加(用磷酸-ERK抗体评估)、增加的FXR a mRNA和下游FXR α靶向基因的表达(用例如实时qPCR评估)、SREBPIc和其他脂肪生成基因mRNA表达的降低(用例如实时qPCR评估)、脂肪生成降低(通过例如14C-乙酸盐向由氯仿/甲醇(2:1)溶液提取的14C-脂质的转化来测定)以及增加的β-氧化(如在Reilly等人，Cell Metab2010 ;12:643_53描述的)。AP-1活性可以使用报告基因分析(例如荧光素酶报告分析)来确定，该分析采用合适的市售报告基因(例如购自QIAGEN，USA)或如实施例中所描述的FXRa 3/ a 4启动子。AP-1活性也可以通过凝胶移动检测或免疫沉淀来确定。
[0105]本发明方法中的包含蠕虫衍生的聚糖和/或糖缀合物的化合物的效力也可以在动物模型中测试，例如NAFLD、AFLD和NASH。可以将化合物(例如包含Lewis抗原如LNFPIII和SEA的化合物)给药至试验动物并且通过使用针对特定模型的标准方法(例如组织学、甘油三酯水平、生物标记物水平)监测该试验动物的疾病的进程。化合物的效力是通过以下证明的:疾病症状的减轻或改善，在用化合物处理的动物中，与未经处理的动物(或用对照化合物或载体处理的动物)相比，组织学、生物标记物水平(例如AST和ALT，这是由于肝细胞损伤泄漏到体循环的肝酶)或甘油三酯的改善。
[0106]NASH和NAFLD的非限制性的动物模型包括但不限于实施例中所述的高脂肪饮食诱导的肥胖模型；用CMF饮食(Oriental Yeast C0., Ltd, Japan)(美国2011/0003757.)饲喂的KK-Ay小鼠(CLEA Japan, Inc.);长埃文斯德岛肥鼠(Ota等人，Gastroenterology2007 ;32:282-93)、SREBP-1c 转基因小鼠(Nakayama 等人，Metabolism2007 ；56:470-75)、L-SACCl (CEA 相关的 CAM)基因敲除小鼠(Lee 等人，Gastroenterology2008 ; 135:2084-95)、LDL_R敲除+FXR敲除小鼠(Kong等人,J PharmacolExp Ther2009 ;328:116-22)和脂肪细胞 11 β-HSDl 转基因小鼠(Morton 等人，Front HormRes2008 ；36:146-64)。基于饮食的啮齿动物NASH模型包括用致动脉粥样硬化饮食饲喂的小鼠(Matsuzawa等人，Hepatology2007 ;46:1392-403)、用胃内高的多不饱和脂肪酸处理的大鼠(Baumgardner 等人，Am J Physiol Gsatrointest Liver Physiol2008 ；294:G27-38)、用蛋氨酸和胆碱缺乏(MCD)的饮食+高脂肪饮食(HFD)饲喂的小鼠、用MCD+反式脂肪+ 二乙基亚硝胺饲喂的大鼠(de Lima等人，JHepatol2008 ；49 =1055-1056)以及用胆碱缺乏的L-氨基酸定义的饮食(CDAA饮食)饲喂的大鼠(Hebbard等人，Nature ReviewsGastroenterology and Hepatology2011 ;8:35_44)。另一个NASH模型是肥胖的 Zucker 大鼠(OZR)，它是指具有脂肪性肝炎和饮食过量、高胰岛素血症和高脂血症的自发性遗传性肥胖模型(Kitade 等人，Hepatology2006 ；44:983-91)。
[0107]AFLD的动物模型的非限制性实例已经描述于,例如Gyamfi等人(Exp Biol andMed2010 ；235:547-60)和 Lieber-DeCarli 流食和 Tsukamoto-French 胃内管饲喂模型(French.J Biomed Sci2001 ;8:20-7 ;Lieber 等人，Hepatologyl989 ; 10:501-10)。
[0108]MetS中非限制性动物模型的肝脂肪积累可以在例如，Panchal等人(JBiomed Biotechnol2011 ；2011:351982)描述的MetS动物模型；高脂肪饮食饲喂大鼠(Buettner 等人，J Mol Endocrinol2006 ；36:485-501);高果糖、高脂肪诱导的大鼠(Wada等人，Endocrinology2010 ; 151:2040-9);高鹿糖、高脂肪诱导的大鼠(Sato等人，Diabetes2010 ;59:2495-504) JPNile Grass 大鼠(Noda 等人，FASEB Journal2010 ；24:2443-53)中进行测定。[0109]此外，用于本发明方法的包含蠕虫衍生的聚糖和/或糖缀合物的化合物的毒性和治疗效果可以通过在细胞培养或实验动物中的标准药学程序确定，例如，确定LD50 (群体中50%的致死剂量)和ED50 (在群体50%中的治疗有效剂量)。毒性和治疗效果的剂量比是治疗指数，其可以表示为LD50/ED50的比率。表现出高治疗指数的化合物是优选的。尽管表现出毒副作用的化合物也可以使用，应小心设计将此类化合物靶向至受影响的组织部位的递送系统，使未感染细胞的潜在损害最小化并由此减少副作用。
[0110]可使用由细胞培养分析和动物研究获得的数据来配制用于人类的剂量范围。该类化合物的剂量优选在包括具有很少或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。该剂量可以根据采用的剂型和利用的给药途径在此范围内变化。对于在本发明方法中使用的任何化合物，最初可以通过细胞培养分析来估计其治疗有效剂量。剂量可以在动物模型中配制以达到包括细胞培养中测定的EC50(即达到最大反应一半的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地确定在人中的有效剂量。例如，可以通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。
[0111]II1.药物组合物
[0112]在治疗肝脏或肝细胞中与脂肪积累相关疾病的发明方法中使用的药物组合物通常包含含有一种或多种蠕虫衍生的聚糖、糖缀合物或其组合的化合物，优选包含Lewisx抗原，例如LNFPIII和SEA的化合物，以及药学上可接受的载体。
[0113]本文所用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂 和吸收延迟剂以及生理上相容的试剂。载体的类型可以根据给药的预定途径进行选择。在各种实施方案中，所述载体适于静脉内、腹膜内、皮下、肌内、经皮或口服给药。在一个优选的实施方案中，将所述组合物配制，使其适于静脉内给药。可以将本发明的药物组合物配制，使其适于具体的给药途径。例如，在各种实施方案中，本发明的药物组合物适于注射、吸入或吹入(通过口或鼻)或用于鼻内、粘膜、口服、口腔、胃肠外、直肠、肌内、静脉内、腹腔和皮下递送。
[0114]药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域熟知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂，其在本发明的药物组合物中的使用是可预期的。补充的活性化合物也可以并入组合物中。
[0115]通常治疗组合物在制造和储存的条件下必须是无菌和稳定的。所述组合物可以配制成溶液、微乳剂、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。例如，适当的流动性可以通过使用包衣如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所要求的粒径和通过使用表面活性剂来维持。在多数情况下，在组合物中优选包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现注射组合物的延长吸收。此外，调节剂可以在时间释放的制剂中给药，例如在包含缓释聚合物的组合物中。活性化合物可以与保护化合物免于快速释放的载体来制备，例如控释制剂，包括移植物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸的共聚物(PLG)。用于制备该制剂的许多方法都申请了专利或是本领域技术人员熟知的。[0116]无菌注射液可以通过如下进行制备:将所需量的活性化合物与以上列举的成分的一种或组合加至适当的溶剂中，随后过滤灭菌。通常，分散液通过将活性化合物加至含基本分散介质和以上列举的所需的其它成分的无菌载体来制备。针对用于制备无菌注射液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其得到的粉末是活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何其他所需成分。
[0117]根据给药途径，可将化合物包被于材料中以保护它免受酶、酸和其它可能灭活该化合物的自然条件的作用。例如，该化合物可在与酶抑制剂联合给药的合适的载体或稀释剂或在合适的载体，如脂质体中给药至受试者。药学上可接受的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DEP)和抑肽酶。脂质体包括水包油包水乳液以及常规脂质体(Strejan等人,J Neuroimmunol 1984 ;7:27)。分散剂也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制备。在储存和使用的常规条件下，这些制剂可包含防腐剂以防止微生物的生长。
[0118]组合物中的活性化合物优选在组合物中以治疗有效量进行配制。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。治疗有效量也是治疗有益效果胜过任何毒性或有害作用的量。
[0119]在另一个实施方案中，将活性化合物以预防有效量在组合物中配制。通常，由于预防剂量是在发病之前或在疾病的早期阶段对受试者使用，因此，预防有效量小于治疗有效量。
[0120]本发明化合物的治疗或预防有效量的非限制性范围是0.01nM-20mM,优选
0.1nM-1OmM,和更优选I μ M-lmM。或者，所述化合物可在体内以I μ g-100mg/kg体重,优选10 μ g-200mg/kg体重，更优选20 μ g-10mg/kg体重，和甚至更优选100 μ g-10mg/kg体重的量每周使用两次。所述化合物可在体外以0.01 μ g/mL-100 μ g/mL,更优选0.1 μ g/mL-50 μ g/mL,和甚至更优选2 μ g/mL-20 μ g/mL的量使用。应当注意的是，剂量值可以随着需要缓解的症状的严重程度和根据因素如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重发生变化。
[0121]应当进一步理解，对于任何特定的受试者，应当根据个体需要和给药或监督组合物施用的人的专业判断，随着时间调整具体剂量方案以提供最佳的治疗反应，而且本文所述的剂量范围仅是示例性的并不旨在限制请求保护的组合物的范围或实践。
[0122]例如，可以采用快速推注、几个分开的剂量可以在一段时间进行给药、或者剂量可以随着治疗情况的紧急程度按比例减少或增加。特别有利是将肠胃外组合物的配制成易于给药和剂量均匀的剂量单位形式。本文所用的剂量单位形式是指适于作为治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上分离的单位；每一单位包含预定量的活性化合物，该化合物经计算与所需的药物载体结合产生所期望的治疗效果。说明书中关于本发明的剂量单位形式受限于并直接依赖于(a)活性化合物的独特特征和要实现的具体治疗效果，和(b)治疗受试者敏感性的这样的活性化合物在配药技术中固有的限制。
[0123]可以将本发明包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物(例如包含Lewis抗原如LNFPIII和SEA的化合物)配制成药物组合物，其中所述化合物是其中的唯一活性化合物。或者，所述药物组合物可以包含额外的活性化合物。例如，多于一种的蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物(例如LNFPII1、LNnT、LDN或LDNF)可以联合使用。此外，多于一种的本发明的蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物可以与一种或多种用于治疗FLD的其它试剂联合，如双胍类(例如二甲双胍)、噻唑烷衍生物(例如吡格列酮盐酸盐)、α -葡糖苷酶抑制剂(如伏格列波糖)、胰岛素促泌剂(例如那格列奈)、维生素、二十碳五烯酸(EPA)、甜菜碱、N-乙酰半胱氨酸(NaC)、贝特类药物(例如苯扎贝特)、HMG-CoA还原酶抑制剂(例如阿托伐他汀)、普罗布考、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺酸、复方甘草甜素、多烯磷脂酰胆碱、血管紧张素II受体拮抗剂(例如氯沙坦)或bofutsushosan(东方草本)等。当联合使用时，药物可以在连续或在期望的时间间隔同时或分开给药。同时给药的制剂可以是混合或分开的形式。
[0124]在具体实施方案中，本发明的药物组合物为了特定目的，例如调节免疫应答，作为佐剂以调节过敏反应或调节自身免疫性疾病，可使用药物组合物的说明进行包装。
[0125]IV.治疗方法
[0126]为了在体内实施本发明方法，将化合物在药理学上可接受的载体(如上文所述)上以有效量给药至受试者以达到理想的效果，例如肝细胞中脂肪生成的减少、肝脏中脂肪积累的减少和/或肝甘油三酯水平的降低。适于实现所需效果的任何给药途径是本发明所考虑的。一种优选的给药所述化合物的途径是胃肠道给药。另一种优选的给药途径是口服给药。而另一种优选的给药途径是静脉给药。本发明方法治疗疾病病症的应用可能会导致与病症相关的症状的类型或数量的减少，无论是长期或短期的(即病症的改善)，或对受试者仅是短暂的有益效果。
[0127]在一个相关方面，本发明预防性地或治疗性地提供受试者使其预防或治疗疾病或障碍的方法。预防性地给药化合物(即本发明化合物)可在表现出不期望的疾病或障碍的症状之前发生，使得所述疾病或病症被预防，或使其进展被延迟。本发明的预防方法可以本文描述的治疗方法类似的方式进行。
[0128]所述治疗的治疗效果可以通过如下进行证明:用含Lewis抗原的化合物治疗的受试者的肝脏组织学的改善(例如通过肝脏的活检)、脂肪酸(例如甘油三酯)水平的改善和/或生物标记的水平(例如AST和ALT的循环水平)的改善。肝脏组织学和/或脂肪酸水平和/或生物标记物水平的变化可以在干预前后或与未治疗的受试者比较来确定。进行这些分析的方法如上文所述。
[0129]对于每种本文描述的治疗，与治疗前水平或与用安慰剂治疗的或与其它合适的对照受试者相比，测试受试者在例如，NAFLD、AFLD和MetS引起或相关的一种或多种症状或生物标记水平将表现出5 %、10 %、20 %、30 %、50 %或更大的降低，高达75-90 %或95 %或更大的减少。在一个特定实施方案中，在施用本发明的治疗的受试者中，一种或多种肝酶，优选ALT或AST的水平减少至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70%、至少80%或至少90%。在另一个实施方案中，在肝细胞或肝组织中一种或多种脂肪酸，优选甘油三酯的水平减少至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60%、至少70%、 至少80%或至少90%。
[0130]与肝脏脂肪积累相关的许多疾病病症已经被确定，并且在患有或有发展成所述疾病病症风险的个体中施用本发明化合物可能会有效。本发明化合物针对这样的疾病的应用在下文中进行了进一步详述。例如，可能从本发明方法受益的脂肪酸肝脏障碍可能由多种因素导致，包括但不限于肝炎、由病毒性或非病毒性感染剂引起的脂肪变性、药物(如他莫昔芬、解偶联蛋白抑制剂、异烟肼、利福平、贝特类、过氧化物酶体增殖物活化受体激动剂)诱导的脂肪变性、代谢原因(例如肥胖、多囊性卵巢综合征(PCOS)、糖尿病、胰岛素耐受和代谢障碍)、基于酒精的原因(例如酒精性脂肪肝病和酒精性脂肪性肝炎)、先天性代谢异常或遗传改变(例如柠檬素缺乏症、血色病、高铁蛋白血症)、遗传性障碍(如Ia型糖原累积病、柠檬素缺乏症和先天性全身性脂肪代谢障碍)、毒素诱导的脂肪变性或脂肪性肝炎、乳糜泻、脂肪营养障碍、减肥手术和肝移植。
[0131]A.NAFLD
[0132]本发明方法可用于治疗性地或预防性地治疗或预防肝脏中的脂肪积累。特别的是，本方法涉及治疗或预防NAFLD，该术语包括脂肪性肝炎和NASH。在有需要的受试者中用于治疗或预防NAFLD的优选的包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物是包含Lewisx抗原，例如LNFPIII和包含非-Lewisx抗原，例如LNnT和SEA的化合物。
[0133]已知一些生物标记物对于预测、诊断或分期NAFLD是有用的。将肝脂肪变性定义为肝TG水平超过第九五区间的瘦健康个体(即>55mg/g肝)或在5%以上的肝细胞中存在细胞质TG滴(Cohen等人，同上)。那些有从肝脂肪变性发展为NASH风险的NAFLD患者可以基于以下进行鉴别:不明原因的增加到AST水平、ALT水平或两者上限的>2.5倍、过重、T2DM、以及不明原因的肝肿大。其它标记包括增加的碱性磷酸酶、升高的铁蛋白水平、超过AST水平的ALT浓度、以及超重和肥胖者中血清转氨酶水平不明原因的增加(Grattagl iano等人，Can Fam Physician2007 ;53:857-86)。甘油三酯、AST和ALT水平可以使用下文描述的方法或商购的试剂盒容易地测定。可用于NASH的另一预测者是血清细胞角蛋白18，其水平与NASH活性相关(Wieckowska等人，Hepatology2006 ;44:27-33)。通过从具有发展NASH风险的受试者采血，使用市售的ELISA试剂盒(可购自例如，Axxora LLC (San Diego,CA))确定具有发展NASH风险的受试者血清中细胞角蛋白18的水平。
[0134]虽然单独确定生物标记水平可用于预测那些具有发展NAFLD风险的受试者或诊断那些患有NAFLD的受试者 ，但组织学评估(例如肝脏活检)或非侵入性成像方式可以补充这些标记物分析。本领域已知的用于评估NAFLD的非侵入性成像方式包括但不限于，磁共振成像(MRI)、弥散加权 MRI (Naganawa 等人，Magn Reson Med Sci2005 ；4:175-86)和超声弹性成像或 MRI 弹性成像(Friedrich-Rust 等人，Gastroenterology2008 ;134:960_74 ；Talwalkar等人,Hepatology2008 ；47:332-42)。这种非侵入性成像方法为确定NAFLD的存在和分期NAFLD进展提供了有用且无痛的替代方案。
[0135]其它用于确定哺乳动物患NAFLD的风险和/或确定哺乳动物是否具有轻度或重度NAFLD的非侵入性方法公开于，例如，美国专利公开第2009/0220986号(“ ‘986公布”)，其引入本文作为参考。例如，‘986公布公开:可将具有低血浆水平的DHEA相关化合物的人(例如每mL血液，〈0.45 μ gDHEA或DHEA-S，DHEA的硫酸化形式)归类为患重度NASH的风险增加,例如伴随更严重的肝纤维化的重度NASH。具有高血浆水平的DHEA相关化合物的患者(例如每mL血液，>0.45 yg DHEA-S)高度不可能患有重度NASH。使用本领域中已知的方法，包括市售放射免疫分析和市售ELISA试剂盒(Diagnostic Systems Lab, Webster, Tex.)可以容易地确定样品中DHEA相关化合物的水平。可以通过本领域任何已知的方法来分离样本，所述样本包括但不限于，血液、组织(例如肝脏)或血清。例如血液可以通过使用针或导管获得，而组织样本可以通过活检获得。
[0136]许多遗传性疾病都与严重肝脂肪变性相关，例如Ia型糖原累积病、柠檬素缺乏症、先天性全身性脂肪代谢障碍。许多与NAFLD全谱相关的基因组序列变体已经被确定并且其可用于确定那些处于发展该疾病风险的人(Cohen等人，同上)。此类变体包括在基因(例如ATGL、比较基因鉴定-58 (CG1-58)、羟酰-CoA转移酶、VLDL、微粒体TG转移蛋白、AP0B和 PNPLA3)上的突变或序列变体(Romeo 等人，Nat Genet2008 ；40:1461 ；Tanoli 等人，JLipid Res2004 ;45:941-7)。在一个实施方案中，一个人是否处于发展NAFLD的风险可以基于在PNPLA3基因上是否存在突变(例如Ile148 — Met148)来确定。DNA测序可以很容易地确定个体中的这种突变。其他确定的与肝脂肪变性相关的基因位点包括那些编码PPP1R3B、NCAN、GCKR、LYPLAL1 和 AP0C3 的基因(Speliotes 等人，PLoS Genetics2011 ；7:1-14 ；Cohen等人，同上)。因此，使用本领域已知的常规技术(即DNA测序、限制性片段长度多态性分析、遗传连锁研究)，处于发展NAFLD的风险的受试者可以被确定，并因此其可以用本发明化合物进行预防性治疗。
[0137]发展NAFLD的另一危险因素包括肝移植。高达70%由于NASH或隐源性肝硬化接受肝移植的患者在移植的肝脏中发展NALFD (Yalamanchili等人，Liver Transpl2010 ；16:431-9)。因此，接受肝移植的个体构成了处于发展NAFLD的风险的人群。
[0138]B.酒精性脂肪肝病(AFLD)
[0139]酒精性脂肪肝病具有NAFLD中观察到的相同的病理特征，不同之处在于，不像患有NAFLD的个体，患有AFLD的个体有酗酒史。针对AFLD的主要治疗中的一种涉及禁酒，虽然这可能难以实现。在有此需要的受试者中用于治疗或预防NAFLD的优选的包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物是包含Lewisx抗原，例如LNFPIII和包含非-Lewisx抗原，例如LNnT和SEA的化 合物。
[0140]许多因素可以被评估以确定ALD易感性，例如酒精摄入模式、性别、年龄和遗传多态性(Becker 等人，Hepatologyl996 ；23:1025-9 ；Crabb 等人，ProcNutr Soc2004 ；63:49-63 ；Konishi 等人，Exp Mol Pathol2003 ;74:183-9 ；Konishi 等人，Alcohol ClinExp Res2004 ;28:1145-52 ；Grove 等人，Hepatologyl997 ；26 ； 143-6 ；Ladero 等人，Scand.J.Gastroenterol2005 ；40:348-53 ；Savolainen 等人，Alcohol Clin Exp Resl996 ；20:1340-5)。Wan 等人，Genet Testl998 ；2:79-83)。那些 AFLD 患者可以使用例如，Tannapfel等人(Virchows Arch2011 ;458:511_23)所描述的组织学方法进行诊断。
[0141]因此，在一个实施方案中，通过评估已知与发展AFLD相关的遗传多态性的存在可以容易地确定那些有发展AFLD风险的人。与AFLD相关的遗传多态性的非限制性实例包括，例如，在 PPAR Y 2 (Rey 等人，World J Gastroenterol2010 ； 16:5830-7), mtDNA4997缺失(Zhuang 等人，CME, 2011IEEE/ICME Intl Conference Junel6, 2011，pp.127-31)和CYP2E1 (Maezawa 等人，Am J Gastroenterol 1994 ；89:561-5)中所确定的。
[0142]患有AFLD的个体可以在例如，各种标记物，包括嗜中性粒细胞、血清胆红素和肝转氨酶升高的水平的基础上进行确定，如Stickel等人综述的(Best Pract Res ClinGastroenterol2010 ；24:683-93)。可用于确定个体是否患有AFLD的其他因素是过度饮酒史和排除其它类似病因。但其他因素是病理生理的，例如增加的肝脂肪贮存、引发Kupffer细胞活化的肠源性内毒素的肝摄取增加和乙醇介导的高同型半胱氨酸血症。
[0143]C.代谢综合征
[0144]代谢综合征是估计影响了超过50万美国人的危险因素的集合。目前缺乏诊断代谢综合征的广为接受的标准，但是，那些受其影响的人表现出腹型肥胖、动脉粥样硬化血脂异常、升高的血压、胰岛素耐受或葡萄糖不耐受、血栓前状态和促炎性状态。具有代谢综合征的个体处于发展疾病风险，该疾病包括脂肪肝病、外周血管疾病、2型糖尿病和加速的动脉粥样硬化。
[0145]在本发明的一些实施方案中，处于发展NAFLD风险或患有NAFLD的患者受代谢综合征的影响。可以通过许多确立的标准来鉴定代谢综合征患者，其是指根据本发明方法用包含Lewis和/或非-Lewis抗原的化合物治疗的患者。这些年来，对于由什么组成了MetS已经提出了许多定义。目前用于诊断MetS的主要标准由以下四个组织提出:世界卫生组织(1999 年建立的标准)(World Health Organization (WHO).Definition, diagnosisand classification of diabetes mellitus and its complications.Report of aWHO consultation, 1999)、the Adult Treatment Panel III Report2001(Expert panelon detection, evaluation, and treatment of high blood cholesterol in adults.JAMA.2001 ;285:2486-97)、the European Group for the Study of IR(EGIR) 1999(BalkauB 等人，Diabet Medl999 ; 16:442-3)和 the International Diabetes Federation (IDF)consensus on Met S.[0146]在一些实施方案中，本发明涉及通过向有此需要的哺乳动物给药预防或治疗有效量的组合物以治疗或预防以肝脏中脂肪积累为特征的疾病，所述组合物包含含有蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物(例如，包含Lewis抗原，如LNFPIII和SEA的化合物)。在一个优选的实施方案中，需要这样治疗的哺乳动物患有MetS或处于发展MetS的风险中。
[0147]如Gupta 等人(Bioscience Trends2010 ；4:204-11)综述的，MetS 的危险因素包括(a)高水平的甘油三酯(> 150mg/dL), (b)低水平的高密度脂蛋白(HDL)胆固醇(女性<50mg/dL和男性 <40mg/dL), (c)高血压(> 130/85mmHg), (d)高水平的空腹血糖 OlOOmg/dL)，和(e)大的腰围(女性> 35英寸和男性> 40英寸)。对于各参数的实际值并非是限制性的，因为上述四个主要标准的每一项均依赖于这些值的微小变化。因此，上面列出的每个参数的具体值应符合所依据的特定标准的值。因此，基于是否存在任何上述风险因素或其组合可以很容易地确定受试者是否有发展MetS的风险。
[0148]WHO、EGIR、NCEP-ATP III和IDF设立的每个标准都可以作为诊断患有MetS的个体的指导资料。例如，WTO的MetS标准需要个体患有糖尿病、糖耐受异常、空腹血糖受损或胰岛素耐受，以及至少两种上述的风险因素。因此，依赖于如上所述的四个标准之一可以很容易地确定患有MetS的个体。
[0149]本文中引用的所有出版物、专利和专利申请，不论上文或下文，全部引入本文作为参考。
[0150]氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺
[0151]上面的公开内容对本公开进行了一般性描述，其将通过下面的实施例进行进一步示例性说明。这些具体实施例仅仅是出于说明的目的进行描述的，而不旨在限制本公开的范围。尽管在本文中使用了具体的目标、术语和值，但这些目标、术语和值同样应该被理解为是示例性的，而不对本公开的范围构成限制。
实施例
[0152]实施例中使用的材料和方法[0153]动物
[0154]雄性C57BL/6J 小鼠(8-10 周龄)购自 Jackson 实验室(Bar Harbor, ME)。FXRa-/-小鼠(均是在C57BL/6J背景)获得自Jackson实验室。所有的动物研究已获Harvard Medical Area Standing Committee on Animals 批准。
[0155]治疗方案
[0156]在实验持续时间内，将雄性C57BL/6J小鼠(8_10周龄)置于高脂肪、高碳水化合物饮食(F3282，Bio-SERV)。在6周特殊饮食后，向给小鼠腹膜内注射25 μ g葡聚糖(载体)或25yg葡聚糖缀合的LNFPIII(LNFPII1-DEX)，每周2次。另外一组用0.9%氯化钠或溶于0.9% NaCl的SEA治疗(25 μ g/鼠/每周两次)。代谢研究在用LNFPIII或SEA治疗后4周开始并于空腹6小时后进行。动物在治疗的第6周被处死，以进行血清和组织的采集。大多数实验在两个组内重复(η = 4-7/治疗)。每周监测体重和摄食情况。
[0157]测量
[0158]整体肝功能标记物ALT和AST的循环水平是用如Liu等人(JBC2011 ；286:1237-47)描述的市售试剂盒测量的。
[0159]组织学
[0160]Dana Farber/Harvard Cancer Center Research Pathology Cores 由病理学家提供所有的组织学服务和初步评估。简而言之，所述组织从动物中收集并固定在10%福尔马林(肝脏)中48小时。按照 标准程序将所固定的样品用PBS漂洗并传送到组织中心用石蜡包埋、切片并用苏木精和曙红染色。病理学家分析了样品的炎症迹象、脂肪肝、肝纤维化及与肝脏相关的其它病理。
[0161]原代细胞、细胞培养和功能分析
[0162]将原代肝细胞如先前所述(Liu等人，同上；Reilly等人，Cell Metab2010 ；12:643-53)进行分离。简言之，将小鼠麻醉并经门静脉灌注50mL EDTA缓冲液和50mL含有胶原酶的灌注缓冲液(Liberase Tm, Roche)。灌注后,通过Percoll梯度分离和分散肝细胞。将细胞计数并将其在William’E、5% FBS中贴壁过夜，然后处理24小时。对于从头脂肪形成，将细胞用14C-乙酸酯标记并在6小时后用氯仿:甲醇(v/v2:l)提取14C-脂质。将所述样品旋转并将含有层的脂质分离并使其干燥。然后测量放射性水平。如前所述进行β-氧化作用测定(Reilly等人，同上)。简而言之，将所述细胞用3H-棕榈酸处理2小时或4小时。检测上清液中3H20，一种脂质分解代谢的副产物的水平。
[0163]将购自ATCC(#HB_8065)的H印G2细胞培养于补充有非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、碳酸氢钠、10%胎牛血清和抗生素的Eagle’ s最小必需培养基中。
[0164]基因表达分析
[0165]通过基于SYBR Green的实时定量PCR(q-PCR)反应确定了转录物的相对表达水平。36B4水平用于标准化。qPCR是用St印One Real-Time PCR系统进行的(AppliedBiosystems)。引物序列显示于表1中。
[0166]表1
[0167]
【权利要求】
1.一种治疗与肝脏中脂肪积累相关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物给药治疗有效量的包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物。
2.一种预防与肝脏中脂肪积累相关的疾病的方法，所述方法包括向有发展成所述疾病风险的哺乳动物给药预防有效量的包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物。
3.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述化合物包含至少一种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述化合物包含至少两种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述化合物包含选自LNFPII1、LNnT,LDN和LDNF的蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物包含Lewis抗原。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物包含Lewisx抗原。
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述化合物包含LNFPIII。
9.根据任一前述权利要求所 述的方法，其中所述化合物包含SEA。
10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述疾病为脂肪肝病。
11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述疾病为非酒精性脂肪肝病。
12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述疾病为肝脏脂肪变性。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述疾病为非酒精性脂肪性肝炎。
14.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述疾病为酒精性脂肪肝病。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病为肝脏脂肪变性。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病为脂肪性肝炎。
17.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述疾病为代谢综合征。
18.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子交联。
19.根据权利要求18所述的方法，其中至少一种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
20.根据权利要求19所述的方法，其中至少两种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子的缀合物的分子量为约5，000-100，000道尔顿。
22.根据权利要求21所述的方法，其中蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子的缀合物的分子量为约10，000-40，000道尔顿。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有2-200个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有10-100个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有20-50个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
26.根据权利要求18-25所述的方法，其中所述载体为碳水化合物聚合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述碳水化合物聚合物为葡聚糖。
28.根据权利要求18-25所述的方法，其中所述载体为蛋白质。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述蛋白为人血清白蛋白。
30.根据权利要求18-25所述的方法，其中所述载体为聚丙烯酰胺。
31.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述化合物是胃肠外给药。
32.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物是腹膜内给药。
33.根据权利要 求1-31中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物是静脉给药。
34.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物是口服给药。
35.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物降低肝脏中的甘油三酯水平。
36.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物抑制肝脏中的脂肪生成。
37.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物增加肝细胞中FXRa的产生。
38.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物减少肝细胞中SREBP-1c的产生。
39.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物通过增加肝细胞中FXRa的产生来抑制所述肝细胞中的脂肪生成。
40.一种减少肝细胞中脂肪生成的方法，所述方法包括将肝细胞与足够量的包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物接触。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述化合物包含至少一种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述化合物包含至少两种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述化合物包含选自LNFPII1、LNnT, LDN和LDNF的蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
44.根据权利要求40-43所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物包含Lewis抗原。
45.根据权利要求40-44所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物包含Lewisx0
46.根据权利要求40-45所述的方法，其中所述化合物包含SEA。
47.根据权利要求40-46所述的方法，其中所述化合物包含LNFPIII。
48.根据权利要求40-47中任一项所述的方法，其中在所述肝细胞中SREBP-1c的产生被抑制。
49.根据权利要求40-48中任一项所述的方法，其中在所述肝细胞中FXRa的产生增加。
50.根据权利要求40-49中任一项所述的方法，其中向有此需要的受试者给药所述化合物以抑制肝脏脂肪生成。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述受试者患有脂肪肝病或具有发展成脂肪肝病的风险。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述受试者患有非酒精性脂肪肝病或具有发展成非酒精性脂肪肝病的风险。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述受试者患有肝脏脂肪变性或具有发展成肝脏脂肪变性的风险。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述受试者患有脂肪性肝炎或具有发展成脂肪性肝炎的风险。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述受试者患有酒精性脂肪肝病或具有发展成酒精性脂肪肝病的风险。
56.根据权利要求50所述的方法，其中所述受试者患有代谢综合征病或具有发展成代谢综合征的风险。
57.根据权利要求40-56中任一项所述的方法， 其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
58.根据权利要求57任一项所述的方法，其中至少一种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
59.根据权利要求58任一项所述的方法，其中至少两种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
60.根据权利要求57-59中任一项所述的方法，其中蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子的缀合物的分子量为约5，000-100，000道尔顿。
61.根据权利要求60所述的方法，其中蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子的缀合物的分子量为约10，000-40，000道尔顿。
62.根据权利要求57-61中任一项所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有2-200个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有10-100个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有20-50个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
65.根据权利要求57-64所述的方法，其中所述载体为碳水化合物聚合物。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述碳水化合物聚合物为葡聚糖。
67.根据权利要求57-64所述的方法，其中所述载体为蛋白质。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述蛋白为人血清白蛋白。
69.根据权利要求57-64所述的方法，其中所述载体为聚丙烯酰胺。
70.根据权利要求40-69中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物是胃肠外给药。
71.根据权利要求40-70中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物是腹膜内给药。
72.根据权利要求40-70中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物是静脉给药。
73.根据权利要求40-70中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物是口服给药。
74.—种增加细胞中FXRa产生的方法，所述方法包括将细胞与足够量的包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物接触。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述化合物包含至少一种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述化合物包含至少两种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
77.根据权利要求74-76中任一项所述的方法，其中所述化合物包含选自LNFPII1、LNnT, LDN和LDNF的蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
78.根据权利要求74-77中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物包含Lewis抗原。
79.根据权利要求74-78中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物包含Lewi Sx。
80.根据权利要求74-79中任一项所述的方法，其中所述化合物包含SEA。
81.根据权利要求74-79中任一项所述的方法，其中所述化合物包含LNFPIII。
82.根据权利要求74-80中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
83.根据权利要求82任一项所述的方法，其中至少一种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
84.根据权利要求83任一项所述的方法，其中至少两种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
85.根据权利要求82-84中任一项所述的方法，其中蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子的缀合物的分子量为约5，000-100，000道尔顿。
86.根据权利要求85所述的方法，其中蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子的缀合物的分子量为约10，000-40，000道尔顿。
87.根据权利要求82-86中任一项所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有2-200个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有10-100个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有20-50个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
90.根据权利要求82-89中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物抗原与葡聚糖交联。
91.根据权利要求74-90中任一项所述的方法，其中FXRa为FXRa 3/a 4。
92.根据权利要求74-90中任一项所述的方法，其中FXRa为FXRa1/a 2。
93.一种增加FXRa转录诱导的基因产物的产生的方法，所述方法包括将肝细胞与足够量的包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物接触。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述化合物包含至少一种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述化合物包含至少两种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
96.根据权利要求93-95中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物选自 LNFPII1、LNnT、LDN 和 LDNF。
97.根据权利要求93-96所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物包含Lewis抗原。
98.根据权利要求93-97所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物包含Lewisx0
99.根据权利要求93-98所述的方法，其中所述化合物包含SEA。
100.根据权利要求93-98所述的方法，其中所述化合物包含LNFPIII。
101.根据权利要求93-100中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
102.根据权利要求101任一项所述的方法，其中至少一种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
103.根据权利要求102任一项所述的方法，其中至少两种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
104.根据权利要求93-103中任一项所述的方法，其中蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子的缀合物的分子量为约5，000-100，000道尔顿。
105.根据权利要求104所述的方法，其中蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子的缀合物的分子量为约10，000-40，000道尔顿。
106.根据权利要求93-105中任一项所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有2-200个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有10-100个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有20-50个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
109.根据权利要求93-107所述的方法，其中所述Lewis抗原与葡聚糖交联。
110.根据权利要求93-109中任一项所述的方法，其中所述基因产物选自SHP、OATPUPLTP 和 BSEP。
111.一种增加肝细胞中Erk-c-fos/APl-FXRa通路的活化的方法，所述方法包括将肝细胞与包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的化合物接触。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述化合物包含至少一种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述化合物包含至少两种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
114.根据权利要求111-113中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物选自LNFPII1、LNnT、LDN和LDNF。
115.根据权利要求111-114中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物包含Lewis抗原。
116.根据权利要求115任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物包含Lewi Sx。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述化合物包含LNFPIII。
118.根据权利要求116所述的方法，其中所述化合物包含SEA。
119.根据权利要求111-118中任一项所述的方法，其中所述蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
120.根据权利要求119所述的方法，其中至少一种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
121.根据权利要求120任一项所述的方法，其中至少两种蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子缀合。
122.根据权利要求119-121中任一项所述的方法，其中蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子的缀合物的分子量为约5，000-100，000道尔顿。
123.根据权利要求122所述的方法，其中蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物与载体分子的缀合物的分子量为约10，000-40，000道尔顿。
124.根据权利要求119-123中任一项所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有2-200个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有10-100个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述缀合物每个载体分子具有20-50个包含蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物的寡糖分子。
127.根据权利要求119-126中任一项所述的方法，其中LNFPIII与葡聚糖交联。
128.根据权利要求111-127中任一项所述的方法，其中Erk-c-fos/APl-FXRa通路的活化伴随着脂肪生成的减少。
129.药物组合物，其包含足以治疗肝脏中与脂肪积累相关的疾病量的蠕虫衍生的聚糖和/或其糖缀合物。
【文档编号】A61P1/16GK103957944SQ201280057835
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年9月21日 优先权日:2011年9月23日
【发明者】C-H.李, P.巴尔加瓦, D.A.哈恩 申请人:哈佛大学的校长及成员们