专利名称：一种PirB胞外多肽及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程蛋白重组领域，具体涉及一种具有治疗中枢系统损伤作用的PirB 胞外多月太(PirB extracellular peptides, PEP)及其应用。
背景技术：
创伤、中风、脑出血、脊髓损伤等具有高死亡率和高致残率的特点。如何降低神经功能受损程度和如何更好地使受损神经元功能得到更好地改善，提高患者的生存质量，对患者及其家庭、社会都有重要意义，是一个世界性的难题。目前，对于中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤引起的神经功能障碍尚无有效治疗药物。因此,寻找新型有效的治疗脑CNS损伤药物是研究热点。以往普遍认为成年哺乳动物CNS损伤引起的神经功能障碍，难以恢复的主要原因为神经元不能再生。近二十年来的研究已有突破性进展，目前认为CNS再生困难的原因除促进再生的营养因子不足外，另一重要的原因是中枢的抑制性再生环境。近几年来，髓磷脂中3种主要轴突生长抑制因子Nogo-A、髓磷脂相关糖蛋白(MAG)、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)及其受体(Nogo-66receptor, NgRl)的发现，为CNS损伤的研究掀开了新的一页，被誉为是“探索中枢神经损伤修复漫长道路中的一个里程碑”。新近Neuron发表的研究，应用基因敲除(knockout)技术，发现敲除Nogo-A和NgRl改善脊髓损伤后再生和可塑反应，应用NgRl拮抗剂(NgRecto，可溶性NgRl受体胞外段)治疗，促进轴突再生和脊髓损伤的功能恢复。同样应用Nogo-A抗体(IN-1，7B12)显著改善MACO导致的行为学结果，促进轴突可塑性。为此，Lee 等在《NatureReview Drug Discovery》撰写 “Targeting the Nogoreceptor to treat centralnervous system injuries” 的论文，提出 “NgR as a drugdiscovery target”,认为以调控NgRl为治疗目标，可大大促进CNS损伤后神经元的功能恢复，逆转其灾难性的后果。目前NgR成为CNS损伤领域的研究热点和关注焦点，认为阻断它可影响脑缺血的发展和结果，促进和增强神经功能恢复。PirB是一种I型跨膜糖蛋白，由胞外六个免疫球蛋白样结构域和胞内四个免疫受体酪氨酸依赖的抑制性基序(ITMs)的多肽组成。早期的研究认为PirB是一种在小鼠和人体中发挥相同作用的白细胞免疫球蛋白样受体，在树突状细胞(dendritic cells，DC)、B细胞、粒细胞及肥大细胞等表面表达较高，通过胞外端的IgG样结构域与来自胞内和胞外的其他分子结合，激活其胞内端ITIM基序，传导抑制信号，从而介导机体炎症和免疫反应。新近的一项研究发现，PirB在中枢神经系统的神经元亚型上亦有表达,表达于此的PirB在抑制视皮质经验依赖性重塑程度中发挥重要作用，推测PirB可能是轴突再生的抑制性受体。2008年《Science》、《Neuron》同时报道:依赖于文库筛选技术，Atwal等发现PirB是髓磷脂蛋白的功能性受体，能够与MAG、Nogo-66、OMgp高亲和力结合，表现出抑制轴突生长的慢性抑制作用。与NgRl相比 ，PirB在髓磷脂抑制作用中似乎更为重要，依据是基因敲除PirB后会引起比敲除NgRl更多的轴突再生，而且体外轴突再生实验证实，NgRl在髓磷脂导致的抑制过程中似乎起辅助抑制受体作用，因为基因敲除NgRl能够加强敲除PirB对髓磷脂抑制的逆转作用。同时，PirB在CNS的多个区域广泛表达，对CNS突触形成和可塑性以及神经回路的稳定性起着重要作用，与学习记忆功能也有密切相关，在海马中的表达随年龄的增长而增加。基于PirB的分子结构和生物学功能，本发明提出通过表达PirB胞外多肽(PirBextracellular peptides, PEP),与髓磷脂轴突生长抑制因子MAG、Nogo-66> OMgp高亲和力结合，以阻断髓磷脂轴突生长抑制因子与PirB结合，促进神经元轴突的生长，改善CNS损伤后的神经功能障碍，为研发治疗脑缺损伤有效药物奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有拮抗髓磷脂轴突生长抑制因子与PirB结合、促进轴突生长作用的PirB胞外段多肽(PEP)的表达及其生物学活性验证，并给出PirB胞外段多肽(PEP)，用于制备哺乳动物脑中枢神经系统损伤的药物以及中枢神经系统损伤保护剂的应用。该药物能够用于在哺乳动物中枢神经系统损伤疾病包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤、脊髓损伤的治疗，在哺乳动物细胞水平上作为蛋白药物治疗工具为了实现上述技术任务，本发明采用如下技术方案予以实现:1、一种PirB胞外多肽，其特征在于:该PirB胞外多肽的cDNA序列和蛋白序列如下: cDNA 序列: CTGACGGGTAGCCTGCCGAAACCGATTCTGCGTGTTCAACCGGATAGCGTTGTGAGCCGCCGCACCAAAGTGACCTTCCTGTGTGAAGAAACCATTGGCGCCAACGAATATCGTCTGTACAAAGATGGTAAACTGTATAAAACCGTGACGA A A A ACA A ACAGA A ACCGGA A A ATA A AGCTGA ATTTAGCTTCTCTAACGTTGATCTGAGCAATGCGGGCCAGTATCGCTGCAGTTACTCCACCCAATATAAAAGCTCTGGCTACTCGGACCTGCTGGAACTGGTGGTTACCGGTCATTATTGGACGCCGAGCCTGCTGGCACAGGCATCACCGGTCGTGACCTCGGGCGGTTATGTTACGCTGCAATGTGAAAGCTGGCATAACGATCACAAATTTATTCTGACCGTCGAAGGCCCGCAGAAACTGAGCTGGACCCAGGACTCTCAATATAATTACAGTACGCGTAAATACCACGCACTGTTCAGCGTCGGTCCGGTGACCCCGAACCAGCGTTGGATCTGCCGCTGTTATTCCTACGATCGTAATCGCCCGTATGTGTGGTCACCGCCGTCAGAATCGGTTGAACTGCTGGTCAGCGGCAACCTGCAGAAACCGACCATTAAAGCAGAACCGGGTTCAGTCATCACCTCGAAACGCGCTATGACGATTTGGTGCCAGGGTAACCTGGACGCGGAAGTGTATTTTCTGCATAACGAAAAATCCCAGAAAACCCAATCAACCCAGACGCTGCAAGAACCGGGCAACAAGGGTAAATTTTTCATCCCGTCTGTTACCCTGCAGCACGCCGGCCAATACCGTTGCTATTGTTACGGCAGTGCAGGTTGGAGCCAGCCGTCTGATACCCTGGAACTGGTTGTCACGGGTATCTATGAATATTACGAACCGCGTCTGAGCGTGCTGCCGTCTCCGGTGGTTACCGCGGGCGGTAACATGACGCTGCATTGTGCCTCCGATTTTCCGTATGACAAATTCATCCTGACCAAAGAAGATAAAAAATTCGGCAATTCACTGGACACGGAACATATCAGTTCCTCAGGCCAGTACCGTGCCCTGTTTATTATCGGTCCGACCACGCCGACCCACACGGGTGCATTCCGCTGCTATGGTTATTACAAAAACGCACCGCAGCTGTGGAGTGTTCCGTCCGCTCTGCAGCAAATTCTGATCTCAGGTCTGTCGAAAAAACCGTCTCTGCTGACCCATCAGGGCCACATCCTGGACCCGGGTATGACCCTGACGCTGCAATGTTTCAGTGATATCAACTACGACCGTTTCGCACTGCATAAAGTGGGCGGTGCTGATATCATGCAGCACTCGAGCCAGCAAACCGACACGGGCTTTTCTGTCGCCAACTTCACCCTGGGTTATGTGTCTAGTTCCACGGGCGGTCAATATCGTTGCTACGGTGCACATAATCTGTCATCGGAATGGAGCGCCAGCTCTGAACCGCTGGATATTCTGATCACCGGTCAGCTGCCGCTGACGCCGAGCCTGTCTGTCCAACCGAATCATACCGTGCACTCGGGTGAAACGGTTAGCCTGCTGTGTTGGAGCATGGATTCTGTTGACACCTTTATTCTGAGTAAAGAAGGCTCCGCTCAGCAACCGCTGCGTCTGAAAAGTAAATCCCATGATCAGCAAAGCCAGGCGGAATTTTCAATGTCGGCCGTGACCAGTCACCTGTCCGGCACGTATCGCTGCTACGGTGCGCAAGACAGTTCCTTCTATCTGCTGTCATCGGCATCTGCTCCGGTGGAACTGACCGTTAGTGGTCCGATTGAAACGAGCACGCCGCCGCCGACGATGTCCATGCCGCTGGGTGGTCTGCATATGTAT ；蛋白质序列:GSLPKPILRVQPDSVVSRRTKVTFLCEETIGANEYRLYKDGKLYKTVTKNKQKPENKAEFSFSNVDLSNAGQYRCSYSTQYKSSGYSDLLELVVTGHYWTPSLLAQASPVVTSGGYVTLQCESWHNDHKFILTVEGPQKLSWTQDSQYNYSTRKYHALFSVGPVTPNQRWICRCYSYDRNRPYVWSPPSESVELLVSGNLQKPTIKAEPGSVITSKRAMTIWCQGNLDAEVYFLHNEKSQKTQSTQTLQEPGNKGKFFIPSVTLQHAGQYRCYCYGSAGWSQPSDTLELVVTGIYEYYEPRLSVLPSPVVTAGG匪TLHCASDFPYDKFILTKEDKKFGNSLDTEHISSSGQYRALFIIGPTTPTHTGAFRCYGYYKNAPQLWSVPSALQQILISGLSKKPSLLTHQGHILDPGMTLTLQCFSDINYDRFALHKVGGADIMQHSSQQTDTGFSVANFTLGYVSSSTGGQYRCYGAHNLSSEWSASSEPLDILITGQLPLTPSLSVQPNHTVHSGETVSLLCWSMDSVDTFILSKEGSAQQPLRLKSKSHDQQSQAEFSMSAVTSHLSGTYRCYGAQDSSFYLLSSASAPVELTVSGPIETSTPPPTMSMPLGGLHMYLK。2、直接合成PEP的DNA，合成后的DNA克隆到pET32a载体中形成重组质粒pET32a-PEP，重组质粒经过DNA测序分析正确后，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中，挑选菌落克隆在氨苄抗性的LB培养基中，用IPTG预诱导表达PEP ;表达后的全菌蛋白用SDS-PAGE、考马斯亮兰R250染色，确定诱导表达的条件，然后在16 22° C，0.2mM IPTG条件下大量表达蛋白。诱导表达蛋白的细菌经过超声破碎菌体，释放出目的蛋白后，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE确定该蛋白的可溶表达。结果显示该蛋白为可溶性表达，经过Ni离子整合的亲和层析柱纯化，纯化后的蛋白经过超滤浓缩为2mg/ml，存放在-80° C的冰箱中。3、本发明通过表达、纯化和鉴定了 PirB胞外多肽(PEP)，证实其具有与髓磷脂轴突生长抑制因子MAG、Nogo-66、OMgp结合的能力，从而阻断髓磷脂轴突生长抑制因子与PirB结合，促进 轴突生长的作用，可作为潜在治疗中枢系统损伤的重要药物。
图1.PirB作为髓磷脂蛋白的功能性受体，抑制轴突生长的机制。PirB能够与MAG、Nogo-66、OMgp高亲和力结合,从而发挥抑制神经元轴突生长的作用。图2.PirB的结构示意图。PirB是一种I型跨膜糖蛋白，由胞外6个免疫球蛋白样结构域和胞内包含有4个免疫受体酪氨酸依赖的抑制性基序(ITIMs)的多肽组成。图3.PirB胞外多妝(PirB extracellular peptide, PEP)质粒结构不意图以及PEP表达与鉴定。图3A为pET32a-PEP质粒结构示意图，图3B为SDS-PAGE电泳显示PEP的表达和鉴定，可看出PEP蛋白正常可溶性表达。图4.不同浓度PEP对原代神经元活力的影响。海马神经元原代培养至第5天，分别加入不同浓度(62.5 u g/L, 125 u g/L, 250 u g/L)纯化后的融合蛋白PEP，MTT法分析细胞活力显示，PEP对原代神经元活力的没有任何影响，表明PEP对正常原代神经元无毒性。图5.PEP拮抗抑制因子的作用，促进原代神经元轴突及其分支生长。将Nogo-66、MAG、OMgp(IOmgzVell)分别包被于96孔板中，与原代海马神经元共培养24h，加入125 y g/L的PEP及对照溶剂，培养7d后应用抗Tau单克隆抗体观察轴突长度，发现PEP显著促进原代神经元轴突及其分支生长，表明PEP可拮抗Nogo-66、MAG、OMgp对轴突生长的抑制作用。图6.PEP拮抗抑制因子的作用，促进原代神经元骨架蛋白形成。将Nogo-66、MAG、OMgp (10mg/well)分别包被于96孔板中，与原代海马神经元共培养24h，加入125 u g/L的PEP及对照溶剂，培养7d后应用抗MAP2单克隆抗体观察神经元骨架蛋白形成，发现PEP显著促进原代神经元骨架蛋白形成，表明PEP可拮抗Nogo-66、MAG、OMgp引起骨架蛋白塌陷的作用。下面结合具体实施例和附图对本发明的具体内容作进一步详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
具体实施例方式实施例一:重组PEP的原理与思路2008年Atwal等在《Science》首先报道了 PirB是另外一个髓磷脂抑制因子的功能受体，随后有学者在《Neimm》等上发表述评，认为PirB作为髓磷脂受体的发现为临床上促进轴突再生和神经功能恢复提供了一个新的治疗靶点。PirB是一种I型跨膜糖蛋白，由胞外六个免疫球蛋白样结构域和胞内包含有四个免疫受体酪氨酸依赖的抑制性基序(ITMs)的多肽组成(图1)。依赖于文库筛选技术，Atwal等发现PirB是髓磷脂蛋白的功能性受体，能够与MAG、N OgO-66、0mgp高亲和力结合(图2)。与NgRl相比，PirB在髓磷脂抑制作用中似乎更为重要，依据是基因敲除PirB后会引起比敲除NgRl更多的轴突再生，若同时敲除PirB和NgRl的功能，能够完全逆转可溶性AP-Nogo-66或髓磷脂导致的背根神经节神经元生长锥崩溃。基于PirB的分子结构和生物学功能，本发明提出通过表达PirB胞外多肽(PirB extracellular peptides, PEP),与髓磷脂轴突生长抑制因子 MAG、Nogo-66、OMgp高亲和力结合，以阻断髓磷脂轴突生长抑制因子与PirB结合，促进神经元轴突的生长，改善CNS损伤后的神经功能障碍，为研发治疗脑缺损伤有效药物奠定基础。实施例二:PEP表达、鉴定与纯化1.试剂与材料(1).质粒、菌株菌株:BL21(DE3)质粒:pET32a(2).主要试剂Amp (氨苄青霉素)TPTG (异丙基-P-D-硫代半乳糖苷)PBS (磷酸盐缓冲液)SDS (十_■烧基硫酸纳)LB Borth 培养基LB Ager 培养基2.依据PirB的分子结构(图1)和生物信息学，依赖文库筛选技术，确定PirB胞外多肽的氨基酸序列。PirB胞外多肽PEP氨基酸序列为:
GSLPKPILRVQPDSVVSRRTKVTFLCEETIGANEYRLYKDGKLYKTVTKNKQKPENKAEFSFSNVDLSNAGQYRCSYSTQYKSSGYSDLLELVVTGHYWTPSLLAQASPVVTSGGYVTLQCESWHNDHKFILTVEGPQKLSWTQDSQYNYSTRKYHALFSVGPVTPNQRWICRCYSYDRNRPYVWSPPSESVELLVSGNLQKPTIKAEPGSVITSKRAMTIffCQGNLDAEVYFLHNEKSQKTQSTQTLQEPGNKGKFFIPSVTLQHAGQYRCYCYGSAGWSQPSDTLELVVTGIYEYYEPRLSVLPSPVVTAGGNMTLHCASDFPYDKFILTKEDKKFGNSLDTEHISSSGQYRALFIIGPTTPTHTGAFRCYGYYKNAPQLWSVPSALQQILISGLSKKPSLLTHQGHILDPGMTLTLQCFSDINYDRFALHKVGGADIMQHSSQQTDTGFSVANFTLGYVSSSTGGQYRCYGAHNLSSEWSASSEPLDILITGQLPLTPSLSVQPNHTVHSGETVSLLCWSMDSVDTFILSKEGSAQQPLRLKSKSHDQQSQAEFSMSAVTSHLSGTYRCYGAQDS SFYLLS SASAPVELTVSGPIETSTPPPTMSMPLGGLHMYLK3.合成PEP的DNA，提取质粒转化感受态细胞及IPTG诱导蛋白表达(1).根据步骤一直接合成PEP的DNA，合成后的DNA克隆到pET32a载体中，为pET32a_PEP。(2).将pET32a_PEP质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株。(3).单克隆挑取菌落接种于LB培养液(5ml)中，在37° C、200r/min振摇过夜；次日按I: 100的比例接种至1Oml上述LB培养液中，37° C200r/min振摇，培养约2 3h，A值至0.6左右，摇床培养16h。(4).加入0.2nM浓度的IPTG，在16 22° C的温度中诱导蛋白表达。4.蛋白表达鉴定、纯化与储存(I).5000r离心5min,离心收集大肠杆菌BL21菌体。(2).超生裂解细菌:按10: 1的比例的加入超声裂解液(20mmol/LTris-Cl)进行
超声裂解。(3).取诱导表达8h的细菌沉淀超声破碎产物4° C下15000父8离心301^11，分别收集上清和沉淀。上清100 μ L加入50 μ L3XLoading Buffer。100° C水浴5min。⑷.取诱导表达4h上清经SDS-PAGE电泳，电泳完毕通过半干转法把蛋白转移到PVDF膜上，0.05%脱脂奶粉封闭lh，抗PirB单克隆抗体4° C过夜孵育，HRP标记的二抗室温孵育lh，TBST洗膜，ECL试剂曝光显影定影分析。图3可看出有融合蛋白PEP可溶性正常表达。(5).利用细菌发酵罐大规模发酵，收集诱导表达4h细菌沉淀。用超声缓冲液重悬菌体，超声破碎后离心收集上清。(6).蛋白纯化:利用蛋白纯化系统(aktapurifierupc, GE公司)纯化蛋白，首次Ni+亲和层析，然后脱盐处理。BCA蛋白定量。(7).纯化后的融合蛋白分装后，在-80° C保存备用。以上实施例中未作详细叙述部分属于本行业或相关行业的公知技术，采用的设备是行业惯例设备。以上实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件；又如David等人,细胞实验指南(NewYork: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1998)中所述的条件。实施例三:PEP药效试验
1.不同浓度的PEP对原代神经元活力的影响(I).海马神经元原代培养至第5天，分别加入不同浓度纯化后的融合蛋白PEP，浓度分别为 62，5 μ g/L, 125 μ g/L, 250 μ g/L ；(2).正常培养，于加入蛋白后的12h，24h，48h行细胞活力分析(MTT法)；(3).结果显示不同浓度PEP蛋白对原代神经元活力的没有任何影响，表明PEP对正常原代神经元无毒性。2.PEP促进原代神经元轴突及其分支生长和骨架蛋白形成(I).包被:将 Nogo-66、MAG、OMgp (Sigma) (10mg/well)分别包被于 96 孔板中，在4° C条件下孵育24h，晾干后用PBS (pH7.3)漂洗3次；(2).封闭:加入含有0.1%的2.5%的小牛血清(BSA)，37°C孵育2h ;按125 μ g/L分别加入PEP及对照溶剂，37° C孵育2h，用PBS (pH7.3)漂洗3次以除去未结合的蛋白；
(3).接种海马神经元，培养第5d、7d和10d，应用多重免疫荧光法观察轴突长度(抗Tau单克隆抗体，抗MAP2单克隆抗体，DAPI )。(4).结果显示PEP蛋白显著促进原代神经元轴突及其分支生长，促进原代神经元骨架蛋白形成，表明PEP可拮抗Nogo-66、MAG、OMgp对轴突生长的抑制作用和导致骨架蛋白塌陷的作用。
权利要求
1.一种PirB胞外多肽，其特征在于:该PirB胞外多肽的cDNA序列和蛋白序列如下: cDNA序列:
2.权利要求1所述该PirB胞外多妝,命名为PEP(PirB extracellular peptides)。
3.权利要求1所述的PirB胞外多肽，用于制备治疗哺乳动物脑中枢神经系统损伤疾病的药物的应用。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于:所述的药物用于在哺乳动物中枢神经系统损伤疾病包括脑缺血缺氧、脑出血、 脑创伤、脊髓损伤的治疗。
全文摘要
本发明提供了一种具有潜在治疗中枢系统损伤作用的PirB胞外多肽，该多肽具有配对免疫球蛋白样受体B的胞外段氨基酸序列；该多肽片段能够在大肠杆菌中大量表达；并能够与髓磷脂抑制因子MAG、Nogo-66、OMgp高亲和力结合，从而拮抗PirB的生物活性和功能。本发明的PEP能够有效与髓磷脂抑制因子MAG、Nogo-66、OMgp结合，从而促进轴突生长。本发明的PEP可大量制备、成本低、活性高，用于治疗脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤以及脊髓损伤等多种CNS损伤疾病的药物应用，它能够有效促进神经组织的再生和神经功能恢复。
文档编号A61P25/00GK103113467SQ20131003188
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者王强, 苟兴春, 郭钒, 邓斌, 姜凤良, 熊利泽 申请人:中国人民解放军第四军医大学