专利名称：碳纳米管在制备抗肿瘤免疫治疗药物的免疫促进剂中的应用的制作方法
技术领域：
:本发明属于生物医学领域，涉及碳纳米管的新用途，具体涉及碳纳米管可作为抗肿瘤免疫治疗药物的免疫促进剂的新应用。
背景技术：
:近年来碳纳米管的生物医学应用潜能受到极大的关注，并且已经吸引了国际上众多实验室从各个角度开展相关研究。碳纳米管的一个重要特性是可以跨越细胞膜和生物体内的多种屏障，进入到细胞和生物体内多种器官内。现有文献报道的研究结果显示，碳纳米管可以穿过多种细胞的细胞膜，包括小鼠成纤维细胞、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF7)、和人T 一细胞淋巴瘤细胞等[1_5]。有研究组从BALB/c小鼠脾中分离脾细胞，与不同浓度(2 μ g/ml 10 μ g/ml)的FITC标记的碳纳米管孵育不同的时间(4h 24h)后，在细胞内可以观察到绿色荧光，表明碳纳米管进入到了细胞内部。他们进一步研究了碳纳米管对原代免疫细胞功能·的影响，发现T细胞、B细胞和巨噬细胞在碳纳米管存在下仍保持原有的功能[6]。上述结果为碳纳米管作为基因和药物的新型载体，应用于极微型生物传感器和药物的靶向传递奠定了基础。例如，碳纳米管可以作为载体，用于DNA、蛋白和药物转运。蛋白分子可以通过共价和非共价作用连接到碳纳米管的表面。Dai研究组m通过非特异性吸附作用将荧光蛋白分子连接到单壁碳纳米管(SWNT)的表面，利用细胞对碳纳米管的内吞作用使碳纳米管进入到细胞内，同时将荧光标记物带入到细胞内，实现了细胞内标记显色。进一步研究表明，可以通过碳纳米管本身特异性的光学性质可以对碳纳米管一蛋白复合物进行追踪和显示，从而为碳纳米管作为新型载体在诊断成像中应用提供了一种途径。又如，DNA分子可以结合到碳纳米管的表面，并且随溶液中离子浓度的改变而发生构象的改变，通过近红外荧光可以检测到此信号改变，从而使碳纳米管有可能作为细胞内环境实时监测的DNA载体。有研究者提出，碳纳米管可以定位在细胞浆、细胞器、甚至进入细胞核内，碳纳米管在细胞中的定位与连接在其表面的功能分子有关。例如，核酸功能化的碳纳米管可以定位到细胞核内。因此，碳纳米管可以作为SiRNA、DNA的载体，增加或抑制细胞内特异蛋白的表达。有研究表明，经过化学修饰的碳纳米管能够特异地被巨噬细胞识别和吞噬，这一特性使碳纳米管有可能成为一种新型载体系统。例如，有研究显示W，碳纳米管与某些多肽结合，可能在肿瘤免疫治疗中发挥一定的作用。Bianco A等[9]的研究结果表明，碳纳米管可以增加口蹄疫病毒特异性多肽的免疫抗原性，可以用作疫苗载体。该研究通过共价结合将口蹄疫病毒感染细胞的B细胞表位多肽偶连到碳纳米管表面，多肽表位仍然暴露在外，可以被其特异性抗体识别和诱发体内特异性抗体产生。动物体内实验表明，该复合体引起了增强的抗体免疫响应，而碳纳米管本身没有引起特异性的抗体产生，与多肽抗体之间没有交叉反应。在上述研究中，碳纳米管主要作为生物大分子的载体应用
发明内容
:本发明的目的，在于提供碳纳米管的新应用。本发明提供了碳纳米管在制备抗肿瘤免疫治疗药物中免疫促进剂中的应用。其中，所述碳纳米管为水溶性碳纳米管粉末，或为浓度在0.0Γ0.5mg/ml的碳纳米管水溶液，优选0.1 0.4mg/ml的碳纳米管水溶液。所述抗肿瘤免疫治疗药物为肿瘤灭活疫苗、肿瘤相关的多肽或蛋白质抗原；特别为肿瘤灭活疫苗。本发明碳纳米管的一种具体应用，是提供一种抗肿瘤免疫药物组合物，包括肿瘤灭活疫苗、肿瘤相关的多肽或蛋白质抗原等抗肿瘤免疫治疗药物和水溶性碳纳米管的组
口 O其中，所述肿瘤灭活疫苗和水溶性碳纳米管的组合比例为1(Τ106细胞:0.1mg 20mg水溶性碳纳米管。本发明碳纳米管的另一种具体应用，是提供一种抗肿瘤免疫治疗药物试剂盒，包括用于作为肿瘤免疫治疗相关抗原的药`物和作为免疫促进剂的碳纳米管以及一份使用说明书。该试剂盒中，碳纳米管为水溶性碳纳米管粉末，所述作为肿瘤免疫治疗相关抗原的药物为用于制备肿瘤灭活疫苗的丝裂霉素，或为肿瘤相关的DNA疫苗、多肽或蛋白抗原。试剂盒中碳纳米管使用浓度为0.lmg/ml 0.4mg/ml的水溶液。本发明还通过实验验证，以碳纳米管作为促进剂，可以显著提高灭活肿瘤细胞疫苗的免疫治疗效果，荷瘤小鼠的肿瘤治愈率得到显著提高，未治愈小鼠的肿瘤也得到了有效的抑制。当完全治愈的小鼠再次被接种肿瘤细胞后，没有肿瘤形成。说明碳纳米管发挥了有效的促进剂作用，提高了瘤苗的免疫治疗效率，同时，促进机体产生了特异性的免疫反应，在机体内建立了特异性的肿瘤抗原识别和杀灭系统。
:图1为不同免疫治疗方法的肿瘤治疗效率图。图2为使用不同碳纳米管剂量作为瘤苗免疫促进剂的肿瘤治疗效率图。图3为治愈小鼠再次接种肿瘤细胞实验结果(tumor challenge)图。
具体实施方式
:在肿瘤的免疫治疗中使用的抗肿瘤免疫治疗药物，无论是传统的疫苗，例如灭活肿瘤细胞，还是新一代的疫苗，包括纯化的蛋白和多肽、由微生物分离产物制备的疫苗、DNA重组技术制备的疫苗、直接合成多肽疫苗等，经常存在治疗效率比较低的问题。要提高疫苗的效率，需要寻找安全而有效的新型免疫促进剂，增强机体对确定抗原的免疫响应。本发明提出了碳纳米管作为抗肿瘤免疫治疗药物中免疫促进剂的新思路，并通过实验验证其辅助瘤苗进行治疗的效果。本发明中，所用碳纳米管为水溶性的碳纳米管粉末或已经配成一定浓度的碳纳米管水溶液。水溶性的碳纳米管粉末可以采用以下方法制备得到，也可以直接选用其它方法获得的水溶性的碳纳米管粉末或碳纳米管水溶液。水溶性碳纳米管粉末及水溶液的制备:I)混合酸的配制:将浓硫酸与浓硝酸按体积比2:1的比例配制形成混合强酸溶液；2)称取200mg多壁碳纳米管加入400ml的混合酸溶液中，将直径为15mm的超声探头伸入到多壁碳纳米管和混合酸中，在IOOOw功率下超声处理2分钟，得到深黑色溶液。3)将深黑色溶液加水稀释后过滤(滤膜孔径为2 μ m)，用水反复冲洗滤出物，至滤液为中性；将滤出的沉淀在70°C以下烘干至恒重即得到水溶性碳纳米管粉末。4)将以上获得水溶性碳纳米管粉末按所需量(如2mg)加入纯水(如IOml)中，用直径为6_的超声探头再次处理2分钟，即可得到均匀稳定的黑色溶液，即为所需浓度(如
0.2mg/ml)的碳纳米管水溶液。调整粉末和水的加入量，可以制备任意所需要浓度的碳纳米管水溶液。碳纳米管作为抗肿瘤免疫治疗药物中免疫促进剂应用的实验1.建立肿瘤动物模型在6 8周龄的雌性BALB/C小鼠左后肢皮下接种H22细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)，一周后，皮下有实体肿瘤生成，平均肿瘤尺寸达到约5X5X2(mm3) ο 2.免疫治疗效率实验将荷瘤小鼠随机分成4组,每组10只,包括:(I)对照组(Control)、(2)瘤苗治疗组(TCV)、(3)碳纳米管治疗组(CNT)、(4)瘤苗联合碳纳米管治疗组(TCV + CNT)。其中瘤苗来源于灭活H22肿瘤细胞。H22肿瘤细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。将H22肿瘤细胞接种于雌性BALB/C小鼠腹腔，进行体内细胞增殖。从小鼠腹腔抽取腹水，分离得到H22细胞，用丝裂霉素(购自北京协和医院)处理后，得到灭活的肿瘤细胞，即为瘤苗。将瘤苗的浓度调整为105cell/ml，碳纳米管为由本发明介绍方法制成的0.25mg/ml水溶液。碳纳米管与瘤苗联用时，分别皮下注射于小鼠的不同部位。分别在接种肿瘤细胞后第7天和第14天对上述4组小鼠进行两次免疫治疗，每次免疫各组注射制剂情况如下:(I)对照组:皮下注射去离子水0.4ml和PBS溶液(0.15M磷酸盐缓冲液，ρΗ=7.4)
0.1ml0(2) TCV组:皮下分别注射灭活肿瘤细胞0.1ml和去离子水溶液0.4ml。(3) CNT组:皮下分别注射PBS溶液(0.15M磷酸盐缓冲液，pH=7.4) 0.1ml和碳纳米管水溶液0.4ml。(4) CNT+TCV组:皮下分别注射灭活肿瘤细胞0.1ml和碳纳米管水溶液0.4ml。在上述过程中，持续观察小鼠的肿瘤尺寸变化。第二次免疫5天后，CNT+TCV组中部分小鼠的肿瘤逐渐缩小，最终消失，CNT组小鼠肿瘤尺寸发展较慢，对照组及TCV组小鼠肿瘤尺寸发展较快。在第二次免疫15天后，处死肿瘤未治愈小鼠，测量最终肿瘤尺寸，统计治愈率和计算肿瘤抑制率，将各组中小鼠治疗情况分类。肿瘤消失者为治愈，抑瘤率大于50%者为肿瘤被抑制，抑瘤率小于50%者为肿瘤恶化。统计结果见图1，显示出CNT+TCV与其他组间肿瘤治愈率有显著性差异。3.碳纳米管作为免疫促进剂的剂量效应研究实验实验程序与2相同，只是设五个不同碳纳米管剂量的CNT+TCV组，分别为每次免疫每只小鼠碳纳米管注射量0.025mg、0.05mg、0.lmg、0.2mg或0.4mg。实验显示，适当的碳纳米管剂量(0.Γ0.2mg/小鼠)可以达到最佳治疗效果。实验结果见图2。4.肿瘤 challenge 实验实验2中CNT+TCV组中存活的肿瘤治愈小鼠被分别在皮下注射H22细胞和EMT细胞(人乳腺癌细胞，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)，每只小鼠H22细胞的注射量为1.5 X 106，每只小鼠EMT细胞的注射量同样为1.5X106。观察是否有肿瘤生成；同时设置对照组，对照组为61周龄的正常雌性BALB/C小鼠，每只注射同样数量的H22细胞和EMT细胞。实验结果:1周后，对照组小鼠均长出肿瘤，皮下种植H22细胞的肿瘤治愈小鼠没有I只长出肿瘤，而皮下种植EMT细胞的肿瘤治愈小鼠都长出了肿瘤。实验结果见图3。该实验显示，当完全治愈的小鼠再次被接种肿瘤细胞后，不会形成新的肿瘤，说明瘤苗组合碳纳米管的免疫治疗方案可以引起机体特异性的免疫反应，特异性的抑制H22肿瘤的生长，抑制肿瘤复发。
本发明验证了在采用传统的灭活肿瘤细胞作为疫苗的同时，应用碳纳米管水溶液制剂作为免疫促进剂，对荷人肝癌细胞H22肿瘤的小鼠进行免疫治疗，与单独使用灭活肿瘤细胞疫苗治疗比较治疗效果比较显示:以碳纳米管作为免疫促进剂，可以显著提高灭活肿瘤细胞疫苗的治疗效果，荷瘤小鼠的肿瘤治愈率得到显著提高，未治愈小鼠的肿瘤也得到了有效的抑制。当完全治愈的小鼠再次被接种肿瘤细胞后，没有肿瘤形成。上述研究结果说明，碳纳米管发挥了有效的免疫促进剂作用，提高了瘤苗的免疫治疗效率，同时，促进机体产生了特异性的免疫反应，在机体内建立了特异性的肿瘤抗原识别和杀灭系统。5、和以上实验2类似，本发明还验证了碳纳米管组合多肽、以及碳纳米管组合蛋白质抗原的免疫治疗方案，结果免疫治疗效率均有显著提高。使用同样的方法，本发明对乳腺癌细胞(EMT、MCF7)和肺癌细胞肿瘤的小鼠进行免疫治疗，按以上实验方案进行重复验证，结果发现，碳纳米管组合对应瘤苗的免疫治疗方案，其免疫治疗效率较单一瘤苗免疫治疗均有显著提高。说明碳纳米管对于不同肿瘤的免疫治疗均具有促进作用。根据以上实验结果，本发明可以利用水溶性的碳纳米管制备形成新的免疫治疗药物组合物。该组合物是将抗肿瘤免疫治疗药物如肿瘤灭活疫苗、肿瘤特异性的多肽或蛋白质抗原与水溶性的碳纳米管组合，其中瘤苗组合比例可以为IO4 IO6细胞:0.1mglOmgA溶性碳纳米管。组合物药物最简单的使用为以水作为溶剂，当然也可以加入其它助剂或药学辅剂以帮助药物发挥作用。本发明还可以利用水溶性的碳纳米管制备形成免疫治疗药物试剂盒。该试剂盒中包括用于作为肿瘤免疫治疗特异性抗原的药物和作为免疫促进剂的碳纳米管以及一份使用说明书，碳纳米管为水溶性的碳纳米管粉末，使用时按照说明书的指示配制成一定浓度(如0.1 0.4mg/ml)的水溶液，然后按照说明书的操作过程(参考实验2之(4)的操作)使用试剂盒。该试剂盒中，作为肿瘤免疫治疗特异性抗原的药物还可以是能够获得肿瘤灭活疫苗的试剂丝裂霉素，使用时按照实验2描述的操作获得瘤苗，然后再与碳纳米管水溶液配合使用。参考文献1.Cui Dj Tian F，Ozkan CS, Wang Mj Gao HEffect of single wall carbonnanotubeson human HEK293cells.Toxicol Lett.2005Janl5;155 (I):73-852.Monteiro-Riviere NA，Inman AOj Wang YY, Nemanich RJ.Surfactant effectsoncarbon nanotube interactions with human keratinocytes.Nanomedicine.2005Dec;I(4):293-9.
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1.纳米管在制备抗肿瘤免疫治疗药物中免疫促进剂中的应用；所述肿瘤为包括肺癌细胞、乳腺癌细胞在内但不包括肝癌细胞的各类癌细胞。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述碳纳米管为水溶性碳纳米管粉末。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述碳纳米管为浓度在0.0Γ0.5mg/ml的碳纳米管水溶液，特别是0.1 0.4mg/ml的碳纳米管水溶液。
4.根据权利要求1或2或3所述应用，其特征在于，所述抗肿瘤免疫治疗药物为肿瘤灭活疫苗、肿瘤相关的多肽或蛋白质抗原；特别为肿瘤灭活疫苗；所述肿瘤为包括肺癌细胞、乳腺癌细胞在内但不包括肝癌细胞的各类癌细胞。
5.一种抗肿瘤免疫药物组合物，包括肿瘤灭活疫苗、肿瘤相关的多肽或蛋白质抗原等抗肿瘤免疫治疗药物和水溶性碳纳米管的组合；所述肿瘤为包括肺癌细胞、乳腺癌细胞在内但不包括肝癌细胞的各类癌细胞。
6.根据权利要求5所述药物组合物，其特征在于，所述肿瘤灭活疫苗和水溶性碳纳米管的组合比例为IO4IO6细胞:0.1mg 20mg水溶性碳纳米管。
7.一种抗肿瘤免疫治疗药物试剂盒，包括用于作为肿瘤免疫治疗相关抗原的药物和作为免疫促进剂的碳纳米管以及一份使用说明书；所述肿瘤为包括肺癌细胞、乳腺癌细胞在内但不包括肝癌细胞的各类癌细胞。
8.根据权利要求7所述抗肿 瘤免疫治疗药物试剂盒，其特征在于:碳纳米管为水溶性碳纳米管粉末。
9.根据权利要求7所述抗肿瘤免疫治疗药物试剂盒，其特征在于:所述碳纳米管为水溶性碳纳米管粉末，所述作为肿瘤免疫治疗相关抗原的药物为肿瘤相关的DNA疫苗、多肽或蛋白抗原。
10.根据权利要求7所述抗肿瘤免疫治疗药物试剂盒，其特征在于:所述碳纳米管为使用浓度0.lmg/ml 0.4mg/ml的水溶液。
全文摘要
本发明公开了碳纳米管的新用途，主要是其在制备抗肿瘤免疫治疗药物中促进剂的应用。实验验证，以碳纳米管作为促进剂，可以显著提高灭活肿瘤细胞疫苗的免疫治疗效果，荷瘤小鼠的肿瘤治愈率得到显著提高，未治愈小鼠的肿瘤也得到了有效的抑制。当完全治愈的小鼠再次被接种肿瘤细胞后，没有肿瘤形成。说明碳纳米管发挥了有效的促进剂作用，提高了瘤苗的免疫治疗效率，同时，促进机体产生了特异性的免疫反应，在机体内建立了特异性的肿瘤抗原识别和杀灭系统。
文档编号A61P35/00GK103083661SQ20131003181
公开日2013年5月8日 申请日期2008年3月20日 优先权日2008年3月20日
发明者许海燕, 孟洁, 孔桦 申请人:中国医学科学院基础医学研究所