专利名称：一种具有fshr靶向性的pet示踪剂及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对具有卵泡刺激素受体靶向性的多肽化合物进行正电子核素标记得到的PET示踪剂，以及其在检测肿瘤中的应用。
背景技术：
卵泡刺激素(foil icle s t imulat ing hormone, FSH)是垂体分泌的可以刺激精子生成和卵细胞成熟的一种激素，通过与分布于性腺的卵泡刺激素受体(FSHR)结合发挥生物学功能。FSH主要作用为促进卵泡成熟。人卵泡刺激素促进卵泡颗粒层细胞增生分化，促进整个卵巢长大。卵泡刺激素在男女两性体内都是很重要的激素之一，有助于调控发育、生长、青春期性成熟以及生殖相关的一系列生理过程，尤其在生殖相关的生理过程中发挥着至关重要的作用。FSH是一种糖蛋白，活性形式是糖基化的异源二聚体，由α和β两条亚基组成，其中，β亚基负责与FSH受体的相互作用。黄体化激素，甲状腺激素，人绒毛膜促性腺激素等糖蛋白激素具有与卵泡刺激素相似的结构，它们共享同样的α亚基，而β亚基则随激素的不同而不同。正电子发射计算机断层扫描(Po s it ron emi s s ion tomography,简称PET)是将人体代谢所必需的物质(如葡萄糖、蛋白质、核酸、氧等)标记上短半衰期的核素(18F、nC、13N、150、68Ga或 64Cu)制成示踪剂(如18F-FDG),注入人体后进行断层扫描，采集数据及成像，进行诊断和分析。PET可在活体上显示生物分子代射、受体及神经介质活动。目前已广泛应用于多种疾病的诊断与鉴别、病情判断、治疗效果评价、脏器功能研究和新药开发等方面。PET在肿瘤诊断和治疗中的应用，主要是因为绝大部分恶性肿瘤存在着对葡萄糖、蛋白质、核酸、氧等物质具有高代谢或高表达倾向，例如18F-FDG作为与葡萄糖结构相似的放射性物质，静脉注射入人体后会在恶性肿瘤中聚集，PET显像可以将其显示出来，进而PET显像可以分辨恶性肿瘤与正常组织及良性病变。同时，PET也可对复发的肿瘤与周围坏死及瘢痕组织加以区分。在肿瘤化疗、放疗的早期(第一周期结束或全疗程的中期)，当形态学检查尚未出现明显变化时，PET检查即可发现肿瘤代射是否已经受到抑制，从而为确定进一步治疗的方案提供帮助。PET多用于肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、卵巢癌、脑肿瘤、头颈部肿瘤、淋巴瘤等多种肿瘤的诊治。正常成年人中性腺血管内皮细胞有极少量FSHR表达，但近来研究发现肿瘤血管内皮细胞中FSHR高度表达。2010年《新英格兰医学杂志》(Radu A, Pichon C, Camparo P, eta1. Expression of follicle-stimulating hormone receptor in tumor blood vessels.N Eng I J Med. 20100ct21;363(17) :1621-30.)报道1336例患者肿瘤标本中，所有级别的肿瘤(包括早期Tl期肿瘤)的内皮细胞都表达FSH受体。这些肿瘤位于前列腺、乳腺、结肠、胰腺、膀胱、肾、肺、肝、胃、睾丸和卵巢。同时，良性炎症组织和毗邻正常组织中未检出FSHR表达。另外，肿瘤FSHR表达水平与预后存在着显著相关性。由此可以猜测，FSHR可能是潜在的肿瘤靶向标志物，活体监测FSHR的表达将有助于肿瘤的诊断和治疗。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有FSHR靶向性的PET示踪剂及其制备方法；本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种通过无创观测肿瘤FSHR表达水平进行肿瘤诊断的技术。本发明所述的PET示踪剂，通过对具有FSHR靶向性的多肽化合物进行正电子核素标记得到。所述具有FSHR靶向性的多肽化合物优选为卵泡刺激素类多肽。上述PET示踪剂，所述多肽化合物优选为卵泡刺激素，本领域技术人员可以对所述卵泡刺激素的全部序列或部分氨基酸序列进行标记操作，以实现本发明的目的，或是对所述卵泡刺激素进行适应性的修饰后再进行正电子核素显像标记，均可以实现本发明的目的。本发明优选包含卵泡刺激素β亚基的第33-53位的氨基酸残基序列，即如SEQ.1DNO 1所示的氨基酸序列；或第81-95位的氨基酸残基序列，即如SEQ.1D NO 2所示的氨基酸序列。上述多肽化合物均可市售，本申请所述的多肽化合物均购自楚肽公司，纯度均在95%以上。上述PET示踪剂，具有如下所示的结构=X-N-G ;其中X为所述正电子显像核素，N为双功能螯合剂，G为所述多肽化合物。上述PET示踪剂，所述双功能螯合剂为本领域技术人员熟知的可起到连接作用的基团，优选与巯基定位结合和/或与氨基定位结合的双功能螯合剂。
更优的，所述双功能螯合剂为可与巯基定位结合的螯合剂如MAA-NOTA,中文名称为(2，2’ - (7_ (2_ ((2_ (2，5_ 二氧 _2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)~2~氧乙基)-1, 4, 7- 二氮杂环壬烧-1, 4- 二基)二乙酸；MAA-GA-N0DA,中文名称为 2，2' -(7-(1-羧基-4-((2-(2, 5_ 二氧-2，5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧丁基)-1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4-二基)二乙酸；MAA-D0TA，中文名称为 2，2’，2 " - (10-(1-羧基 _4_ ((2_ (2，5_ 二氧 _2，5_ 二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧丁基)-1，4，7，10-三氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸];和/或与氨基定位结合的螯合剂如p-SCN-Bn-NOTA，中文名称为2_ (4_异硫氰苯基)_1，4，7_三氮杂环壬烷_1，4，7-三乙酸;DOTA-NHS,中文名称为 2, 2’，2’ ’ - (10- (2~ ((2，5- _■氧卩比略烧 _1_ 基)氧)~2~ 氧乙基)-1, 4，7，10-三氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸。上述螯合剂均可购自法国Chematech公司或美国Macrocyclic s公司，各型号产品并无明显区别，对本发明的技术效果不产生影响，本发明中均选用IOOmg包装。同样的，所述PET示踪剂具有如Y-G所示的结构；其中Y为正电子显像核素标记辅基，G为所述多肽化合物。所述正电子显像核素标记辅基可选择本领域技术人员熟知的起到连接作用的集团，本发明中，所述标记辅基优选18F-NPFP,中文名称为2-[18F]氟丙酸(4-硝基)苯酯；所述标记辅基18F-NPFP可参照文献报道的方法制得。上述PET示踪剂的正电子显像核素，可以为本领域中常使用的正电子显像核素，本发明所述的正电子显像核素优选为18F或68Ga。本发明还公开了连接基为标记辅基时，上述PET示踪剂的制备方法，包括如下步骤取所述标记辅基与含有所述多肽化合物的缓冲液混合进行反应，分离纯化得到所需的PET示踪剂。本发明还公开了连接基为双功能螯合剂时，上述PET示踪剂的制备方法，包括如下步骤(1)制备标记前体取含有所述双功能螯合剂的缓冲液与含有所述多肽化合物的缓冲液混合进行反应，纯化得到所需的标记前体；(2)制备所述正电子显像核素溶液；(3)将步骤(I)中制备的所述标记前体溶液与步骤(2)中制备的所述正电子显像核素溶液混合反应，并分离纯化，即得。所述步骤(I)中，所 述双功能螯合剂与多肽化合物的摩尔比例为1:1-10:1。上述PET示踪剂的制备方法，所述步骤(I)中，所述含有双功能螯合剂的缓冲液和所述含有多肽化合物的缓冲液彼此独立的为乙酸铵、水、乙醇、磷酸盐缓冲溶液或二甲亚砜。上述PET示踪剂的制备方法，在所述步骤(3)中，还包括将所述标记前体溶解于乙醇、乙腈或水的步骤。上述PET示踪剂的制备方法,在步骤(3)中，还包括在所述标记前体中加入AlCl3溶液和/或酸性溶液的步骤，所述酸性溶液为醋酸、抗坏血酸和醋酸-醋酸钠缓冲液等。本领域技术人员可以根据各自熟知的技术手段选择合适的方法对产物进行纯化及检测，本发明选择以制备型HPLC进行对产物的纯化，并以分析型HPLC方法对产物的纯度进行检测分析。该方法简单、高效，且纯化及检测精度高。本发明还提供了一种具有FSHR靶向性的多肽化合物用于PET示踪剂的应用。上述PET示踪剂在进行肿瘤活体监测领域的应用。一种活体监测肿瘤的技术，使用上述的PET示踪剂进行PET扫描以监测活体的FSHR水平。本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点1、本发明采用具有FSHR靶向性的多肽化合物，以正电子核素进行标记，首次制备了靶向FSHR的PET示踪剂。阻断实验证实此类显像剂与FSHR特异性结合，经正电子断层扫描显像，肿瘤可清晰显影，并进行肿瘤FSHR表达的定量分析。为人类检测及诊治肿瘤病症提供了新的医疗途径；2、本发明所述的PET示踪剂，优选对与FSHR有良好结合性能的卵泡刺激素类多肽进行标记，能够与FSHR高度特异性结合，达到示踪的目的；3、本发明优选对卵泡刺激素的第33-53位氨基酸序列和第81_95位氨基酸序列进行正电子显像核素标记，实验表明，FSH33_53和FSH81_95具有最强的与FSHR结合的能力，尤其是FSH33_53F仅是抗FSH血清抗原的一部分且与黄体生成素(LH)不发生交叉反应，能够实现对FSHR的高效显像；4、由于标记的多肽化合物与肿瘤血管内皮细胞高度表达的FSHR特异性结合且放射性核素标记多肽具有组织渗透迅速的优点，因此本发明所述示踪剂可以灵敏的、快速的与FSHR特异性结合，进而可以快速的对肿瘤进行显像，有利于对肿瘤的诊断和分析，进而有利于肿瘤的及早发现；5、本发明所述的标记方法选用适宜的螯合剂或标记辅基进行正电子现象核素标记，所述方法简单快捷，标记率和放化纯均可达到满意效果，且适用于医用检测之用，便于临床推广；6、本发明所述的标记方法优选与巯基定位结合和/或与氨基定位结合的双功能螯合剂，不仅标记步骤简单，且标记效率较高；7、本发明所述的方法以HPLC法对标记前体和标记产物进行提纯和纯度分析，不仅分离效果较好，且与杂质明显区分；8、荷瘤鼠microPET显像表明，肿瘤清晰可见，肿瘤与背景对比度高。尾静脉注射I小时后，肿瘤与正常肌肉组织对所述PET示踪剂的摄取比值大于5,提示所述PET示踪剂与肿瘤高表达的FSHR特异性结合。阻断实验显示，在未标记FSHR靶向肽阻断下，肿瘤中放射性浓聚显著降低，该结果证实所述PET示踪剂与FSHR特异性结合。综上所述，本发明解决了靶向FSHR的PET示踪剂的制备和活体监测肿瘤的技术问题。特别适用于高表达FSHR的肿瘤的诊断、疗效监测等。
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中图1为实施例1中所述P`ET示踪剂的标记前体的分析型HPLC图；图2为实施例1所述PET示踪剂的分析型HPLC图；图3-A为实施例1中所述荷人PC-3前列腺癌模型鼠尾静脉注射所述PET示踪剂的microPET显像图；图3-B为通过ROI计算所得实施例1中所述荷P人PC-3前列腺癌模型鼠的主要器官对PET示踪剂的摄取值；图3-C为实施例1中所述荷人PC-3前列腺癌模型鼠的靶/非靶比值；图4-A为实施例1中所述荷人MDA-MB231乳腺癌模型鼠尾静脉注射所述PET示踪剂的microPET显像图；图4-B为通过ROI计算所得实施例1中所述荷人MDA-MB231乳腺癌模型鼠的主要器官对PET示踪剂的摄取值；图4-C为实施例1中所述荷人MDA-MB231乳腺癌模型鼠的靶/非靶比值；图5-A为实施例1中所述荷人A549肺癌模型鼠尾静脉注射所述PET示踪剂的microPET显像图；图5-B为通过ROI计算所得实施例1中所述荷人A549肺癌模型鼠主要器官对PET不踪剂的摄取值；图5-C为实施例1中所述荷人A549肺癌模型鼠的靶/非靶比值；
图6为本发明实施例2所述PET示踪剂的分析型HPLC图；图7-A为实施例2中所述荷人PC-3前列腺癌模型鼠尾静脉注射所述PET示踪剂的microPET显像图；图7-B为通过ROI计算所得实施例2中所述荷人PC-3前列腺癌模型鼠主要器官对PET示踪剂的摄取值；图7-C为实施例2中所述荷人PC-3前列腺癌模型鼠的靶/非靶比值；图8为本发明实施例3中所述PET示踪剂的分析型HPLC图；图9-A为实施例3中所述荷人PC-3前列腺癌模型鼠尾静脉注射所述PET示踪剂的microPET显像图；图9-B为通过ROI计算所得实施例3中所述荷人PC_3前列腺癌模型鼠ROI计算所得主要器官对PET示踪剂的摄取值；图9-C为实施例3中所述荷人PC-3前列腺癌模型鼠的靶/非靶比值。
具体实施例方式实施例1本实施例所述的PET示踪剂是以双功能螯合剂MAA-NOTA为连接基对具有SEQ.1DNO 1所示氨基酸序列的多肽化合物进行正电子核素(18F)标记，具体步骤包括I)标记前体 N0TA-MAA-FSH33_53 的制备将 Iml (8mg, 11. 6mmol)含有 ΜΑΑ-Ν0ΤΑ的O. 2M乙酸铵溶液加入到含有氨基酸序列如SEQ.1D NO 1所示的多肽化合物(6. 8mg, 2.6mmol)的O. 2M乙酸铵溶液中，室温反应I小时。反应结束后，使用制备型HPLC纯化，条件如下制备型反相C18 柱(Xbridge, 19X 150mm, Waters)；Waters2998 二级管阵列紫外检测器；BioScan放射性检测器；Waters2545 二元高压梯度泵；流动相为A、含O. 1%三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液；B、含O. 1%TFA的水溶液；梯度洗脱0-2分钟的5%A和95%B增加到21分钟的65%A和35%B ；流速为20ml/min,检测波长为218nm。收集出峰时间为9. Omin时的流份，冻干后得到3. 5mg白色粉末，获得标记前体。通过分析型HPLC检测产品纯度，所述分析型HPLC检测条件为反相C18 柱(Luna,4. 6X250mm, phenomenex)；Watersl525 二元 HPLC 液相泵；Radiomatic610TR 放射性检测器(Perkin-Elmer)；Waters2998双波长紫外检测器；流动相为A、含O. 1%三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液；B、含O. 1%TFA的水溶液；梯度洗脱0-2分钟的5%A和95%B增加到32分钟的65%A和35%B ；流速为lml/min,检测波长为218nm ;前体保留时间15. 9分钟(HPLC图谱见图1所示)，产品纯度>95%。LC-MS: [MH]+=2968. 5(m/z),这与标记前体即 N0TA-MAA_FSH33_53 (C133H21tlN36O39S: 2968.1)的计算值相吻合。所述标记前体N0TA-MAA_FSH33_53的结构式如下
权利要求
1.一种PET示踪剂，其特征在于，通过对具有卵泡刺激素受体靶向性的多肽化合物进行正电子显像核素标记得到。
2.根据权利要求1所述的PET示踪剂，其特征在于，所述多肽化合物为卵泡刺激素类多肽。
3.根据权利要求1或2所述的PET示踪剂，其特征在于，所述多肽化合物包括SEQ.1D NO :1和/或SEQ.1D NO 2所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的PET示踪剂，其特征在于，具有如X-N-G所示的结构；其中X 为所述正电子显像核素，N为双功能螯合剂，G为所述多肽化合物。
5.根据权利要求3所述的PET示踪剂，其特征在于，所述双功能螯合剂为与巯基定位结合和/或与氨基定位结合的双功能螯合剂。
6.根据权利要求5所述PET示踪剂，其特征在于，所述双功能螯合剂包括ΜΑΑ-Ν0ΤΑ、 MAA-GA-N0DA、MAA-DOTA、p-SCN-Bn-NOTA 和 DOTA-NHS 中的一种或几种。
7.根据权利要求3所述PET示踪剂，其特征在于，具有如Y-G所示的结构；其中Y为正电子显像核素标记辅基，G为所述多肽化合物。
8.根据权利要求7所述PET示踪剂，其特征在于，所述标记辅基为18F-NPFP。
9.一种用标记辅基制备权利要求7或8所述PET示踪剂的方法，其特征在于，包括如下步骤取所述标记辅基与含有所述多肽化合物的缓冲液混合进行反应，分离纯化得到所需的PET示踪剂。
10.一种用双功能螯合剂制备权利要求4-6任一所述PET示踪剂的方法，其特征在于， 包括如下步骤(1)制备标记前体取含有所述双功能螯合剂的缓冲液与含有所述多肽化合物的缓冲液混合进行反应，纯化得到所需的标记前体；(2)制备所述正电子显像核素溶液；(3)将步骤(I)中制备的标记前体与正电子显像核素溶液混合反应，并分离纯化，即得 PET示踪剂。
11.根据权利要求10所述的PET示踪剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中，所述双功能螯合剂与所述多肽化合物的摩尔比例为1:1-10:1。
12.根据权利要求10或11所述的PET示踪剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(I) 中，所述含有双功能螯合剂的缓冲液与所述含有多肽化合物的缓冲液彼此独立的为乙酸铵、水、乙醇、磷酸盐缓冲溶液或二甲亚砜。
13.根据权利要求10-12任一所述PET示踪剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3) 中还包括将所述标记前体溶解于乙醇、乙腈或水的步骤。
14.根据权利要求13所述PET示踪剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中还包括在所述标记前体中加入AlCl3溶液和/或酸性溶液的步骤。
15.根据权利要求10-14任一所述PET示踪剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(I) 和所述步骤(3)中，所述纯化步骤是采用制备型HPLC法进行的。
16.一种具有FSHR靶向性的多肽化合物用作PET示踪剂的应用。
17.—种权利要求1-8任一所述的PET示踪剂在肿瘤活体监测领域的应用。
18.一种活体监测肿瘤的技术，其特征在于，使用权利要求1-8任一所述的PET示踪剂进行PET扫描以监测活体的FSHR水平。
全文摘要
本发明涉及一种以正电子显像核素标记具有FSHR靶向性的多肽化合物得到的PET示踪剂及其制备方法，并公开了其在肿瘤活体监测领域中的应用。所述PET示踪剂解决了FSHR靶向性正电子示踪剂领域的空白及对FSHR水平进行活体监测的技术问题。特别适用于FSHR高表达的肿瘤的诊断、疗效监测等。
文档编号A61K51/08GK103041412SQ201310033129
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者杨敏, 严勇军, 徐宇平, 潘栋辉, 王立振, 陈飞 申请人:江苏省原子医学研究所