专利名称：一种tat-lbd-nep1-40融合蛋白、构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于蛋白转导领域，具体涉及将LBD引入TAT-NEP1-40融合制备TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白。同时，本发明还涉及TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白穿过血脑屏障并富集于缺血区，用于中枢神经系统损伤的治疗。
背景技术：
创伤、中风、脑出血、脊髓损伤等具有高死亡率和高致残率的特点。如何降低神经功能受损程度和如何更好地使受损神经元功能得到更好地改善，提高患者的生存质量，对患者及其家庭、社会都有重要意义，是一个世界性的难题。目前，对于CNS损伤引起的神经功能障碍尚无有效治疗药物。因 此，寻找新型有效的治疗脑CNS损伤药物是研究热点。以往普遍认为成年哺乳动物中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤引起的神经功能障碍难以恢复的主要原因为神经元不能再生。近二十年来的研究已有突破性进展，目前认为CNS再生困难的原因除促进再生的营养因子不足外，另一重要的原因是中枢的抑制性再生环境。近几年来，主要抑制受损神经再生的基因一 Nogo及其受体(Nogoreceptor, NgR)的发现，为CNS损伤的研究掀开了新的一页，被誉为是“探索中枢神经损伤修复漫长道路中的一个里程碑”。新近Neuron发表的研究,应用基因敲除(knockout)技术，发现敲除Nogo-A和NgR改善脊髓损伤后再生和可塑反应,应用NgR拮抗剂(NgRecto)治疗，促进轴突再生和脊髓损伤的功能恢复。同样应用Nogo-A抗体(IN-1，7B12)和NgR拮抗剂(NgRecto)治疗，显著改善MACO导致的行为学结果，促进轴突可塑性。为此，Lee等在《Nature Review Drug Discovery》撰写“Targeting the Nogo receptor to treat centralnervous system injuries” 的论文，提出 “NgR as a drug discovery target”,认为以调控NgR为治疗目标，可大大促进CNS损伤后神经元的功能恢复，逆转其灾难性的后果。目前NgR成为CNS损伤领域的研究热点和关注焦点，认为阻断它可影响脑缺血的发展和结果，促进和增强神经功能恢复。Nogo-66是Nogo-A分子胞外的袢状结构，与NgR结合从而触发下游信号通路阻断神经的再生。NEPl_40(Nogo extracellular peptide residuesl-40)是 Nogo-66 氨基端40个残基组成的多肽，保留有Nogo-66与NgR结合的能力，但不触发下游的信号转导途径。NEP1-40作为NgR拮抗剂已经应用于脊髓损伤动物模型，可以促进皮质脊髓轴突的生长和5-羟色胺能神经纤维的出芽，并上调轴突生长蛋白SPRRlA以及突触的形成，可以显著促进实验动物运动功能的恢复。NEP1-40作为NgR拮抗剂，具有高选择性和有效性使其有望成为治疗脊髓损伤、脑外伤、中风和慢性进行性多发性硬化等轴突再生障碍性疾病的新药。然而，目前研究中所使用的NEP1-40都是经化学合成，其成本较高，且由于血脑屏障(BBB)、血脊屏障、细胞膜等的存在，大于6个氨基酸的多肽一般不能穿过这些屏障，而达不到有效的药物治疗浓度，目前主要是通过显微定位注射或植入微型泵等手术的形式给药。显微注射存在诱发脑内出血等潜在危险，并且只能维持短时期；植入微型泵较好，但存在难以通过血脊屏障、血脑屏障的问题，使NEP1-40的进一步研究和临床应用受到了极大的限制。目前，已通过应用TAT蛋白转导技术研制出的新型蛋白TAT-NEP1-40融合蛋白可顺利通过血脑屏障，减小脑缺血损伤。但是，TAT蛋白靶向性较差，进入脑内后广泛分布，不能集中作用于缺血损伤部位。因此，如何使TAT-NEP1-40靶向作用于CNS损伤部位成为现今研究的重点。
层粘连蛋白Laminin是CNS重要的胞外基质。在缺血性脑损伤时，Iaminin在缺血区域内高表达(Liebkind RTE.，et al.，2007)，因此，其可成为治疗蛋白聚集于缺血损伤区域的一个潜结合靶向区域，明显增强药物浓度和治疗效率，使治疗蛋白更有效的发挥靶向治疗损伤神经元的作用。集聚蛋白(Agrin)是神经肌肉接头突触后分化的一个关键分子，层粘连蛋白和集聚蛋白的氨基端(N-terminal domain of agrin,NtA)有很强的亲和能力，NtA可以作为与层粘连蛋白结合的结构域。有研究显示:通过构建含有神经营养因子BDNF和层粘连蛋白结合区域NtA的融合蛋白，可以靶向聚集于脑缺血损伤区域，并且高效、持续的发挥BDNF的治疗作用，而对正常组织和细胞没有任何副作用(Han, Q.，et al.，2011)。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于CNS损伤治疗的TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白，它由人类免疫缺陷病毒的TAT结构域与LBD结构域和治疗功能片段NEP1-40融合制成。本发明的另一个目的是提供一种构建CNS损伤治疗的TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白的方法。本发明的再一个目的是TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白用于制备哺乳动物脑中枢神经系统损伤的药物的应用。该药物能够用于在哺乳动物中枢神经系统损伤疾病包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤、脊髓损伤的治疗。为了实现上述技术任务，本发明通过如下技术方案予以实现:一种TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白，其特征在于:该融合蛋白的cDNA序列和蛋白序列如下:cDNA 序列:CTGCCGGGCGCATCGGGCACCTGTCCGGAACGCGCACTGGAACGTCGTGAAGAAGAAGCAAATGTTGTCCTGACGGGTACGGTTGAAGAAATTCTGAACGTTGATCCGGTCCAGCATACCTATAGCTGCAAAGTCCGTGTGTGGCGCTACCTGAAAGGCAAGGATCTGGTGGCACGTGAAAGTCTGCTGGACGGCGGTAATAAGGTGGTTATTTCCGGCTTTGGTGATCCGCTGATCTGTGACAACCAAGTCAGTACCGGTGATACGCGCATCTTTTTCGTTAATCCGGCACCGCCGTATCTGTGGCCGGCACATAAAAACGAACTGATGCTGAATAGCTCTCTGATGCGTATTACGCTGCGCAACCTGGAAGAAGTGGAATTTTGCGTTGAAGATAAACCGGGCGGTGGCGGTTCACGTATCTACAAAGGCGTTATTCAGGCGATCCAAAAGTCGGACGAAGGTCACCCGTTCCGCGCCTACCTGGAATCGGAAGTCGCAATCTCAGAAGAACTGGTGCAAAAATACAGCAACAGC。蛋白序列:-LPGASGTCPERALERREEEANVVLTGTVEEILNVDPVQHTYSCKVRVWRYLKGKDLVARESLLDGGNKVVISGFGDPLICDNQVSTCDTRIFFVNPAPPYLWPAHKNELMLNSSLMRITLRNLEEVEFCVEDKPGGGGSRIYKGVIQAIQKSDEGHPFRAYLESEVAISEELVQKYSNS。进一步地，TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白是将TAT、LBD与NEP1-40融合制得，具体按照下述步骤构建:步骤一:从Genebank获取LBD基因和NEP1-40序列，然后将LBD基因和NEP1-40序列之间通过GGCGGTGGCGGITCA序列连接，合成LBD-NEP1-40基因序列，且使得LBD-NEP1-40的基因序列两端分别含有Nco I和Xho I序列，整个LBD-NEP1-40的基因序列为:ACCATGGCC-CT GCCGGGCGCAT CGGGCACCT G TCCGGMCGCGCAC TGGAACGTCGTGAAGAAGAAGCAAATGTTGTCCTGACGGGTACGGTTGAAGAAATTCTGAACGTTGATCCGGTCCAGCATACCTATAGCTGCAAAGTCCGTGTGTGGCGCTACCTGAAAGGCAAGGATCTGGTGGCACGTGAAAGTCTGCTGGACGGCGGTAATAAGGTGGTTATTTCCGGCTTTGGTGATCCGCTGATCTGTGACAACCAAGTCAGTACCGGTGATACGCGCATCTTTTTCGTTAATCCGGCACCGCCGTATCTGTGGCCGGCACATAAAAACGAACTGATGCTGAATAGCTCTCTGATGCGTATTACGCTGCGCAACCTGGAAGAAGTGGAATTTTGCGTTGAAGATAAACCGGGCGGTGGCGGTTCACGTATCTACAAAGGCGTTATTCAGGCGATCCAAAAGTCGGACGAAGGTCACCCGTTCCGCGCCTACCTGGAATCGGAAGTCGCAATCTCAGAAGAACTGGTGCAAAAATACAGCAACAGC-CTCGAG ;其中基因下划线为Nco I和Xho I酶切位点；步骤二:将合成得到的LBD-NEP1-40的基因序列装载到pUC57载体中，得到PUC57-LBD-NEP1-40 载体；步骤三；选用含限制性内切酶Nco I和Xho I的人类免疫缺陷病毒的TAT序列的PTAT-HA作为表达载体；步骤四:用限制性内切酶Nco I和Xho I酶切pTAT-HA和pUC57-LBD-NEPl-40载体，回收酶切产物，其中PTAT的酶切产物为线性pTAT载体，pUC57-LBD-NEPl-40的酶切切产物为LBD-NEP1-40基因片段；步骤五:将步骤四得到的两种酶切产物即线性pTAT载体和TAT-LBD-NEP1-40基因片段用T4连接酶连接通过克隆筛选得到重组质粒pTAT-LBD-NEPl-40表达载体；步骤六:将重组质粒pTAT-LBD-NEPl-40表达载体经过DNA测序分析正确后，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中，挑选5 8个阳性的菌落克隆在氨苄抗性的LB培养基中，采用IPTG预诱导表达TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白；步骤七:将诱导表达后的全菌蛋白依次采用SDS-PAGE、考马斯亮兰R250染色，确定诱导表达的条件和阳性菌落克隆，然后在16 22°C，0.2mMIPTG条件下大量表达TAT-LBD-NEP1-40 融合蛋白；步骤八:将诱导表达的TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白的细菌经过超声破碎菌体，释放出目的蛋白后，经过Ni离子整合的亲和层析柱纯化，纯化后的蛋白经过超滤浓缩为2mg/ml，存放在-80 °C的冰箱中冷藏。本发明的特点是:将来源于人类免疫缺陷病毒HIV-1TAT的蛋白转导域(protein transduction domain, PTD)、特异结合缺血区的 LBD 与 NEP1-40 融合，构建pTAT-LBD-NEPl-40重组质粒，经表达、纯化得到具有生物活性的TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白。本发明所述TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白，可用于包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤、脊髓损伤等多种CNS损伤的治疗。所述TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白保留了 NEP1-40对NgR的选择性拮抗活性，具有转导效率高、透过BBB的优点，克服了 NEP1-40的局限性，而LBD使NEP1-40更具有靶向性，用于脑损伤治疗，可降低药物对其他组织的副作用，使治疗蛋白靶向聚集于损伤区域。TAT融合蛋白系统是一种很好的蛋白传送工具，打破了蛋白质通常只能通过细胞表面受体和信号转导途径将所携带的生物信息传递到细胞内的规律，能有效解决大分子蛋白质不能穿透血脑屏障(BBB)的问题，在临床应用大分子药物治疗脑血管疾病中具有广阔的应用前景。本发明利用TAT介导蛋白质的方法，将TAT-PTD的编码基因与外源蛋白LBD、NEP1-40基因连接，表达融合蛋白，所得到的TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白不仅保留了 TAT原有的穿透力，而且不影响外源蛋白的活力。为了提高有效的药物浓度，同时降低药物对其他组织的副作用，因此治疗蛋白如何靶向聚集于损伤区域是需要解决一个关键问题。在脑缺血性脑损伤过程中，层粘连蛋白(Laminin, LN)高表达于脑缺血区域,聚集蛋白agrin的N端序列可以与LN特异性结合,这种可与LN特性结合的序列被命名为laminin-binding domain (LBD)。通过构建将LBD与脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)相结合的融合蛋白，发挥靶向治疗脑缺血损伤的作用。本发明应用C57小鼠、采用免疫荧光组织化学分析和Westen Blot的方法证实TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白的转导作用，结果显示TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白可穿过血脑屏障进入脑内并降低脑梗死面积，表明TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白的转导作用，对C57小鼠具有脑保护作用。同时，本发明将纯化后的TAT-LBD-NEP1-40通过腹腔注射的方式给于全脑缺血模型后的C57小鼠，检测TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白对脑缺血后损伤轴突的变化和脑神经功能是否有改善作用。免疫荧光组织化学结果显示，融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40、TAT- P -Gal在大鼠脑组织细胞均呈阳性反应，而注射No-TAT- P -Gal融合蛋白的C57小鼠脑组织均为阴性反应，说明TAT可介导蛋白质通过血脑屏障转导入脑组织，而且TAT-LBD-NEP1-40可显著改善局灶脑缺血引起的神经功能障碍、减少梗死容积和促进损伤神经元突触再生，表明TAT-LBD-NEP 1-40具有蛋白转导作用可进入脑组织，对脑缺血损伤具有保护作用。本发明的TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白保留了 NEP1-40对NgR的选择性拮抗活性，具有转导效率高、透过BBB的优点，克服了 NEP1-40的局限性，而LBD使NEP1-40更具有靶向性，用于脑损伤治疗，可降低药物对其他组织的副作用，使治疗蛋白靶向聚集于损伤区域，可用于包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤、脊髓损伤等多种CNS损伤的治疗。本发明可大量制备、成本低、活性高，用于包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤以及脊髓损伤等多种CNS损伤的治疗，促进神经组织的再生和神经功能恢复，治疗中枢神经系统损伤的药物。
图1.TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白穿过血脑屏障转导入脑组织内表达示意图。图为 C57BL/6J 小鼠分别腹腔注射 40nmol 的 TAT-P -Gal、TAT-LBD-NEP 1-40 和No-TAT-LBD-NEP1-40 后 lh, 4h 和 12h，C57BL/6J 小鼠的大脑取出行 Westernblot 和免疫荧光染色分析。图1A为Western blot分析结果；图1B为免疫荧光染色分析结果，箭头表示免疫荧光阳性细胞，Scale bars=100umo图2.TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白对脑梗死容积的影响。图2A为各组代表性的TTC染色，白色为脑梗死区域；图2 B为4组脑梗死容积(mm3)。图3.TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白促进轴突生长示意图。图为C57BL/6J小鼠腹腔注射40nmol的TAT-LBD-NEP 1-40和PBS后28d，C57BL/6J小鼠的大脑取出行免疫荧光染色分析。图3A为海马区免疫荧光染色分析结果；图38为皮层区免疫荧光染色分析结果，箭头表示生长出的轴突。图4.TAT-LBD-NEP 1-40对C57BL/6J小鼠神经功能的改善作用。图为分别应用水迷宫和高架十字迷宫评估小鼠神经功能的改善作用数据图。图4A为水迷宫；图4B高架十
字迷宫。以下结合附图和具体实施方式
对本发明的具体内容作进一步详细说明。
具体实施例方式TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白药效试验为了证明本发明的有益效果，发明人采用本发明构建的TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白进行如下药效研究，试验情况如下:需要说明的是下列药效试验中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件；又如David等人，细胞实验指南(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1998)中所述的条件。
(一)TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白的转导功能鉴定1、TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白通过血脑屏障进入脑内的鉴定 9 只 SD 大鼠随机分为 3 组:TAT-LBD-NEP 1-40 组、TAT- ^ -Gal 组和 No-TAT- ^ -Gal组(n=3)，每组大鼠分别腹腔注射IOnmol的TAT-LBD-NEP1_40、TAT-P -Gal (阳性对照)和No-TAT-^-Gal (阴性对照)融合蛋 白，分别于lh、4h、12h后，用2%戊巴比妥钠深麻醉，迅速开胸经左心室至升主动脉插管， 先以生理盐水洗去血液，随后用冷的(4° C)含4%多聚甲醛的0.lmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)先快后慢灌流固定2h，然后取脑置于20%蔗糖中(4° C)直至组织沉底。冰冻切片机切制连续冠状切片，片厚14 iim，置于-20° C存放。切片加入封闭液室温封闭lh，加入抗6XHis鼠源单抗(I: 2000)，放入4° C冰箱过夜。取出后PBS洗涤3次，每次5min，加入FITC标记的驴抗鼠IgG(l: 400)，避光，室温反应2h。再用PBS适度洗涤，封片后在BX60荧光显微镜下观察并采图。2、结果TAT-LBD-NEP 1-40穿过血脑屏障在脑内表达。免疫荧光组织化学结果显示:融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40、TAT-P -Gal在大鼠脑组织细胞均呈阳性反应，而注射No-TAT-P-Gal融合蛋白的大鼠脑组织均为阴性反应，说明TAT可介导蛋白质通过血脑屏障，参见图1。(二)、TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白对脑梗死容积的影响1、动物分组32只雄性SD大鼠，体质量(300-350) g，由第四军医大学实验动物中心提供，随机分为 4 组:对照组(Control)、TAT-LBD-NEP 1-40 组、No-TAT-LBD-NEPl-40 组和 TAT-P -Gal组(n=8)。大鼠局灶脑缺血模型方法如下，各组分别于栓塞120min后再灌注时腹腔注射PBS (pH7.3) 4ml、TAT-LBD-NEP 1-40, No-TAT-LBD-NEPl-40 和 TAT- ^ -Gal (均为 40 u mo I 溶解于 PBS4ml)。2、局灶脑缺血模型制作大鼠术前禁食12h，不禁水。大鼠用4%异氟醚诱导麻醉，2%异氟醚吸入维持麻醉深度，保留自主呼吸。术中体温由肛温探头连接多功能监测仪监测，并用烤灯维持在37 37.5° C。参照我们以前的报道，大脑MCAO模型采用右侧颈内动脉尼龙线线栓法，即动物麻醉后取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉下方剪一切口，将一预先用乙醇灯烧成圆头的尼龙线(3-0，Ethicon,日本)置入颈内动脉17.5_，直到有轻微阻力感为止。栓塞120min后抽出尼龙线，恢复再灌注，缝合皮肤。大鼠麻醉苏醒后放回鼠笼，自由饮食。3、脑梗死容积测量再灌注24h后,动物用2%戍巴比妥钠深麻醉后处死,迅速取出鼠脑,置于冰盐水中lOmin，取冠状面均匀切成2mm厚脑片，迅速放入2%TTC溶液(37°C )中染色30min，然后用4%多聚甲醛缓冲液固定。24h后用数码相机(Kodak，DC240, USA)拍照，输入计算机，用图像处理软件(Adobe，Photoshop .0)计算梗死面积(粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区)，各脑片梗死面积之和乘以厚度(2mm)为总的梗死容积。4、实验结果脑梗死容积图2A为各组一只大鼠缺血再灌注24h后的脑切片(2mmX6)，粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区。缺血再灌注24h后脑梗死容积，对照组为(309.5±36.4)mm3、TAT-LBD-NEP 1-40 组为(107.6±23.1)mm3、No-TAT-LBD-NEPl-40 组为(296.2 ±72.5)mm3、TAT- ^ -Gal 组为(269.3 ±68.0)mm3。TAT-LBD-NEP 1-40 组梗死容积明显小于对照组、No-TAT-LBD-NEPl-40 组和 TAT- ^ -Gal 组(P=0.002 和 0.004)，而 Control 组、No-TAT-LBD-NEPl-40 组和 TAT-P -Gal 组比较无差别(P=0.903)，见图 2B。
(三)、TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白促进轴突生长1、动物分组12只雄性C57/BL6小鼠，体重2(T25g由第四军医大学实验动物中心提供，随机分为2组:对照组(Contix)I)、TAT-LBD-NEPl-40组(n=6)。全脑缺血模型如下，各组分别于栓塞20min后再灌注时腹腔注射PBS (pH7.3)0.5ml、TAT-LBD-NEPl_40(以250mg/kg的剂量溶于 0.5mlPBS 中)2、全脑缺血模型制作术前禁食6h，禁水2h。2%异氟醚吸入维持麻醉深度，保留自主呼吸。术中检测脑血流，模型成功标准为夹闭5min的脑血流下降70%。取颈部正中切口，仔细分离双侧颈总动脉(CCA)，夹闭20min后恢复再灌注，缝合皮肤。小鼠麻醉苏醒后放回鼠笼，自由饮食。3、组织切片制备小鼠脑缺血再灌注后连续28d给药，在第28天深麻醉下开胸暴露心脏，经升主动脉插管剪开左心耳，用生理盐水20mL左右快速冲洗，随后用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(4° C，pH7.4)灌注约30mL固定，后固定2h后小心取出大脑，浸入20%蔗糖溶液，放置于4° C冰箱中至脑沉于底部。用冷冻切片机连续冠状切片，片厚IOii m，-20°C保存切片。4、免疫荧光鉴定轴突生长切片加入封闭液室温封闭lh，加入抗MAP鼠源单抗(I: 400)，放入4° C冰箱过夜。取出后PBS洗涤3次，每次5min，加入兔抗鼠IgG(l: 1000)和Neurotrace (1:2000)，避光，室温反应2h。再用PBS适度洗涤，封片后在BX60荧光显微镜下观察并采图。
5、实验结果免疫荧光组织化学结果显示:融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40组轴突明显较PBS组增多。图3A是海马区域，图3B是皮层区域。(四)、TAT-LBD-NEP1-40对小鼠神经功能的改善作用。1、动物分组16只雄性C57/BL6小鼠，体重2(T25g由第四军医大学实验动物中心提供，随机分为2组:对照组(Contix)I)、TAT-LBD-NEPl-40组(n=8)。全脑缺血模型如下，各组分别于栓塞20min后再灌注时腹腔注射PBS (pH7.3)0.5ml、TAT-LBD-NEPl_40(以250mg/kg的剂量溶于0.5mlPBS中)全脑缺血模型制作方法同前。2、行为学实验方法(I)水迷宫获得性训练(Acquisition phase):将水池分为4个象限,平台置于其中一个象限区的中央。将小鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间(S)。在前几次训练中，如果这个时间超过60s，则引导动物到平台，让动物在平台上停留15s。(2)高架十字迷宫迷宫包括两个开放端(16厘米*5厘米)，两个闭口端(16厘米X 5厘米X 12厘米)，中间平台(5厘米X5厘米)，高出地面25厘米。每 只动物实验一次，每只小鼠单独放入开口端的末端，面对迷宫中心，小鼠用四肢从开口端到闭口端说用的时间即为移动延时时间(TLT), 一旦小鼠在180s内没有进入闭口端，轻柔的把它推入闭口端并计TLT为180s，在测完TLT后动物允许自由探索10s。3、实验结果(I)水迷宫:图4A所示，在训练第二天，:融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40组与PBS组有明显差异(p〈0.01)。融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40组可明显降低小鼠的游泳潜伏期。(2)高架十字迷宫:图4B所示，融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40组与PBS组组间存在明显差异(P〈0.05)。应用融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40治疗后小鼠的记忆功能明显改善。
权利要求
1.一种TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白，其特征在于:该融合蛋白的cDNA序列和蛋白序列如下: cDNA序列:ATG CGG GGT TCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT GGT ATG GCT AGCATG ACT GGT GGA CAGCAA ATG GGT CGG GAT CTG TAC GAC GATGAC GAT AAG GAT CGA TGG GGA TCC AAG CTT GGCTAC GGC CGCAAG AM CGC CGC CAG CGC CGC CGC GGT GGA TCC ACC ATG GCCCTGCCGGGCGCATCGGGCACCTGTCCGGAACGCGCACTGGAACGTCGTGAAGAAGAAGCAAATGTTGTCCTGACGGGTACGGTTGAAGAAATTCTGAACGTTGATCCGGTCCAGCATACCTATAGCTGCAAAGTCCGTGTGTGGCGCTACCTGAAAGGCAAGGATCTGGTGGCACGTGAAAGTCTGCTGGACGGCGGTAATAAGGTGGTTATTTCCGGCTTTGGTGATCCGCTGATCTGTGACAACCAAGTCAGTACCGGTGATACGCGCATCTTTTTCGTTAATCCGGCACCGCCGTATCTGTGGCCGGCACATAAAAACGAACTGATGCTGAATAGCTCTCTGATGCGTATTACGCTGCGCAACCTGGAAGAAGTGGAATTTTGCGTTGAAGATAAACCGGGCGGTGGCGGTTCACGTATCTACAAAGGCGTTATTCAGGCGATCCAAAAGTCGGACGAAGGTCACCCGTTCCGCGCCTACCTGGAATCGGAAGTCGCAATCTCAGAAGAACTGGTGCAAAAATACAGCAACAGC ； 蛋白序列:MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSKLGYGRKKRRQRRRGGSTMALPGASGTCPERALERREEEANVVLTGTVEEILNVDPVQHTYSCKVRVWRYLKGKDLVARESLLDGGNKVVISGFGDPLICDNQVSTGDTRIFF VNPAPPYLWPAHKNELMLNSSLMRITLRNLEEVEFCVEDKPGGGGSRIYKGVIQAIQKSDEGHPFRAYLESEVAISEELVQKYSNSo
2.构建权利要求1所述的TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白，其特征在于:TAT-LBD-NEP1_40融合蛋白是将TAT、LBD与NEP1-40融合制得，具体按照下述步骤构建: 步骤一:从Genebank获取LBD基因和NEP1-40序列，然后将LBD基因和NEP1-40序列之间通过GGCGGTGGCGGITCA序列连接，合成LBD-NEP1-40基因序列，且使得LBD-NEP1-40的基因序列两端分别含有Nco I 和Xho I序列，整个LBD-NEP1-40的基因序列为:ACCATGGCC-CTGCCGGGCGCATCGGGCACCTGTCCGGAACGCGCACTGGAACGTCGTGAAGAAGAAGCAAATGTTGTCCTGACGGGTACGGTTGAAGAAATTCTGAACGTTGATCCGGTCCAGCATACCTATAGCTGCAAAGTCCGTGTGTGGCGCTACCTGAAAGGCAAGGATCTGGTGGCACGTGAAAGTCTGCTGGACGGCGGTAATAAGGTGGTTATTTCCGGCTTTGGTGATCCGCTGATCTGTGACAACCAAGTCAGTACCGGTGATACGCGCATCTTTTTCGTTAATCCGGCACCGCCGTATCTGTGGCCGGCACATAAAAACGAACTGATGCTGAATAGCTCTCTGATGCGTATTACGCTGCGCAACCTGGAAGAAGTGGAATTTTGCGTTGAAGATAAACCGGGCGGTGGCGGTTCACGTATCTACAAAGGCGTTATTCAGGCGATCCAAAAGTCGGACGAAGGTCACCCGTTCCGCGCCTACCTGGAATCGGAAGTCGCAATCTCAGAAGAACTGGTGCAAAAATACAGCAACAGC-CTCGAG ;其中基因下划线为Nco I和Xho I酶切位点； 步骤二:将合成得到的LBD-NEP1-40的基因序列装载到pUC57载体中，得到PUC57-LBD-NEP1-40 载体； 步骤三；选用含限制性内切酶Nco I和Xho I的人类免疫缺陷病毒的TAT序列的pTAT-HA作为表达载体；其中TAT的核苷酸序列为:ATA GGC AGG AAG AAG CGT AGA CAG AGACGT AGA ； 步骤四:用限制性内切酶Nco I和Xho I酶切pTAT-HA和pUC57-LBD-NEPl-40载体，分别回收酶切产物，其中pTAT-HA的酶切产物为线性pTAT载体，pUC57-LBD-NEPl-40的酶切产物为TAT-LBD-NEP1-40基因片段；步骤五:将步骤四得到的酶切产物，即线性PTAT载体和TAT-LBD-NEP 1-40基因片段采用T4连接酶连接通过克隆筛选得到重组质粒pTAT-LBD-NEPl-40表达载体； 步骤六:将重组质粒pTAT-LBD-NEPl-40表达载体经过DNA测序分析正确后，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中，挑选5 8个阳性的菌落克隆在氨苄抗性的LB培养基中，采用IPTG预诱导表达TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白； 步骤七:将诱导表达后的TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白依次采用SDS-PAGE、考马斯亮兰R250染色，确定诱导表达的条件和阳性菌落克隆，然后在16 22°C，0.2mM IPTG条件下大量表达TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白； 步骤八:将诱导表达的TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白的细菌经过超声破碎菌体，释放出目的蛋白后，经过Ni离子整合的亲和层析柱纯化，纯化后的蛋白经过超滤浓缩为2mg/ml，存放在_80°C的冷藏。
3.权利要求1所述的TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白用于制备哺乳动物脑中枢神经系统损伤的药物的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述的药物用于在哺乳动物中枢神经系统损伤疾病包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤、脊髓损伤的治疗。
全文摘要
本发明公开了TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白、构建及其在治疗中枢神经系统损伤的应用。用本发明构建的TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白，保留了NEP1-40对Nogo受体的选择性拮抗活性，具有转导效率高、易透过血脊屏障、血脑屏障的优点，克服了NEP1-40的局限性，可以避免显微注射或植入微型泵的方式注射NEP1-40引起神经组织额外伤害以及NEP1-40难以通过血脊屏障、血脑屏障不能达到相应的生物学浓度的不足。本发明可大量制备、成本低、活性高，用于包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤以及脊髓损伤等多种CNS损伤的治疗，促进神经组织的再生和神经功能恢复，治疗中枢神经系统损伤的药物。
文档编号A61K47/48GK103113473SQ20131003269
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者王强, 苟兴春, 李立亚, 熊利泽 申请人:中国人民解放军第四军医大学