一种双靶标嵌合蛋白的制作方法

专利名称：一种双靶标嵌合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及融合蛋白领域，特别是涉及一种双靶标嵌合蛋白。
背景技术：
自身免疫性疾病，通常是由T淋巴细胞和B淋巴细胞的介入，炎性因子的参与，机体免疫系统对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的局部或全身性的慢性疾病。如类风湿关节炎(RA)，系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化症(MS)，干燥综合症(Sjogren's syndrome), I 型糖尿病(TypelDiabetes mellitus)等。T淋巴细胞和B淋巴细胞是机体免疫防御和免疫应答的两个主要功能细胞。它们分别参与机体细胞免疫和体液免疫功能。它们的异常，可以引起免疫功能亢进，如自身免疫性疾病；或引起免疫功能低下，如HIV感染或慢性疾病和肿瘤放疗或化疗后。T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫防御和免疫应答功能需要被激活后才能发挥。B淋巴细胞的活化分T淋巴细胞依赖性和T淋巴细胞非依赖性。T淋巴细胞依赖性B淋巴细胞的活化，需要B淋巴细胞受体(BCR)与抗原结合，内嗜和外表，呈递并参与活化协助T (Th)淋巴细胞，借助T淋巴细胞膜上的⑶40L与B淋巴细胞膜上⑶40的结合作为B淋巴细胞激活的第二信号。B淋巴细胞生长、发育、成熟、和分化则需要B淋巴细胞表面受体(BAFF-R、跨膜激活物和钙调制器和亲环素配体相互作用分子(TACI)和B淋巴细胞成熟抗原(BCMA))与B淋巴细胞刺激因子BAFF (BLYS)和患者增殖诱导配体(APRIL)相互作用来维持。任何异常情况所致BLYS长时间过高，将导致自身免疫功能紊乱。BLYS和BAFF-R互动是决定B淋巴细胞生存或淘汰的关键。除与BAFF-R相互作用外，BAFF还能与TACI和BCMA结合。TACI和BCMA对成熟活化后的B淋巴细胞，对记忆B淋巴细胞和长寿浆细胞的生存和功能起重要作用。除产生抗体和作为抗原提呈细胞功能外，B淋巴细胞也是细胞因子包括IL-6和IL-10的主要分泌者。T淋巴细胞的活化需要俩个信号，第一信号来自T淋巴细胞表面受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)表面抗原的主要组织相容性复合体分子相互作用。第二信号，也称共刺激信号，来自T淋巴细胞膜上相应受体与APC表面对应配体的相互作用来实现。其中，以T淋巴细胞膜上受体⑶28与APC的配体⑶80和⑶86分子间的相互作用最为重要。⑶28和⑶80/86之间的相互作用，参与T淋巴细胞活化和细胞增殖，促进细胞因子的产生和T淋巴细胞的存活，触发T淋巴细胞免疫应答反应。然而，表达在T淋巴细胞膜上的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA-4)的作用与⑶28的作用相反。CTLA-4和⑶80/86之间的相互作用使T淋巴细胞发生免疫沉默/免疫耐受，抑制T淋巴细胞增殖和活化，引起活化T淋巴细胞凋亡。CTLA-4与⑶28共同构成了调控T淋巴细胞功能的一对正负共刺激因子。而且，CTLA-4与⑶80/86的结合比⑶28与⑶80/86结合更强。机体正是利用⑶28/CTLA-4与CD80/86作用的正负调节机制，维持T淋巴细胞参与的机体免疫防御和免疫应答功能的平衡。 T淋巴细胞除直接参与细胞免疫外，还参与B淋巴细胞活化和促进B淋巴细胞(浆细胞)抗体产生。作为体液免疫的B淋巴细胞，也以抗原提呈细胞参与T淋巴细胞的激活。部分T淋巴细胞也表达TACI和低浓度的BAFF ；BAFF除主要参与B淋巴细胞的生长、发育和成熟外，也参与T淋巴细胞的功能。所以，T淋巴细胞介导的细胞免疫和B淋巴细胞介导的体液免疫即有区别又相互联系。通过阻断⑶28:⑶80/86通路，下调T淋巴细胞活性，下调炎性因子所引起炎症反应，还可以降低B淋巴细胞(浆细胞)自身抗体的产生，达到控制自身免疫性疾病，和抑制同种异体移植排斥反应。通过阻止B淋巴细胞因子BAFF/APRIL与BAFF-R，TACI和BCMA的作用，可以抑制B淋巴细胞的生长、增殖和分化，减少自身反应性B淋巴细胞存活数量和自身抗体的产生，减少免疫反应沉积物和减轻免疫反应引起的组织损伤；减少记忆B淋巴细胞数量，有助于防止自身免疫性疾病的复发。用于自身免疫性疾病的制疗方法经历了免疫抑制剂，类固醇激素抗炎剂，非固醇类抗炎剂过程。目前分子特异性靶向疗法是治疗自身免疫性疾病的一种较好的选择，特别是在减少免疫反应沉积物和减轻免疫反应引起的组织损伤方面效果显著。临床上用于治疗RA的肿瘤坏死因子(TN Fa)拮抗剂(etanercept), B淋巴细胞耗竭剂(rituximab),抗白介素-6受体单抗(tociIizumab),以及共激活阻断剂阿巴普西(abatacept);用于治疗红斑狼疮的抗B淋巴细胞因子BAFF单抗(belimumab)和抗器官移植排斥的共激活阻断剂(belatacept)。由于自身免疫性疾病是由多因素参与的复杂性疾病。阻止其中一个环节或因素，很难完全消除自身免疫性反应，特别是难以阻止免疫复合物沉积所导致的组织/器官破坏。多数情况下，自身免疫性疾病复发需要重复治疗。这有可能与耗竭B淋巴细胞治疗幸存下来的长寿记忆B淋巴细胞或/和浆细胞或自身反应性B淋巴细胞有关。未被枯竭的自身免疫反应性记忆T淋巴细胞，也可能会对自身反应性B淋巴细胞的活化起重要作用。多数具有自身免疫反应性记忆B淋巴细胞及后代都会得到T淋巴细胞的协助。在次级淋巴组织中，T淋巴细胞依赖性浆细胞存活则提示，联合应用针对T淋巴细胞和B淋巴细胞的特异性靶向疗法，可以加强抑制浆细胞自身抗体的产生，可能是治疗自身免疫性疾病的更佳选择。

发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明将细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4细胞外片断和跨膜激活物和钙调制器和亲环素配体相互作用分子细胞外半胱胺酸富有区与免疫球蛋白IgG恒定区相融合，通过筛选和优化，构建成的双靶向分子，该分子具有协同阻断异常情况下T淋巴细胞和B淋巴细胞功能，减少致炎因子分泌，阻止或减少自身抗体的产生，减轻免疫反应对机体组织和器官的损害，增加对自身免疫性疾病的治疗功效，克服了目前单靶点生物药物在临床上治疗自身免疫性疾病的不足。本发明是依据⑶80或⑶86和BlyS或APRIL能与其对应受体结合的结构功能区能以融合蛋白在真核细胞中表达，第一方面提供一种双靶标嵌合蛋白，所述双靶标嵌合蛋白包括三个结构功能区域，第一结构功能区域是CTLA-4的部分细胞外区域，第二结构功能区域是TACI的部分细胞外区域，第三结构功能区域是免疫球蛋白IgG的Fe片段。所述第一结构功能区域能够结合两种不同的细胞因子，⑶80和⑶86。所述第二结构功能区域是TACI的一个或者两个半胱氨酸区域，能够结合两种不同的细胞因子，BlyS和APRIL。所述第三结构功能区域的作用一是增加该融合蛋白与相对应的因子的结合能力，二是增加融合蛋白的血液半衰期，从而减少临床用药次数。更优选的，所述双靶标嵌合蛋白从N端到C端依次为第一、二和三结构功能区域，所述第一结构功能区域的氨基酸序列如SEQ ID N0.29所示，所述第二结构功能区域的氨基酸序列如SEQ ID N0.30或31所示，所述第三结构功能区域的氨基酸序列如SEQ ID N0.32所示。更优选的，所述第一结构功能区域和第二结构功能区域之间还包括第一连接肽，所述第二结构功能区域和第三结构功能区域之间还包括第二连接肽。所述第二连接肽能够使融合蛋白具有更佳的亲和力，这主要是由于连接肽增加了结构功能域之间的空间，消除或减小了相邻结构功能域之间的空间物理阻碍作用。所述各连接肽的作用是增加所述融合蛋白各结构功能域的相对独立性，同时也增加所述融合蛋白各功能区的结构稳定及生物学功能。更优选的，所述连接肽的长度为5-15个氨基酸序列。更优选的，所述双靶标嵌合蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID N0.14、16、18、20、22、24,26 或 28。如上所述，本发明提供分离的核酸分子，该分子包含三个功能结构域部分；第一功能结构域和第二功能结构域是具有生物活性功能区域，第三功能结构域为免疫球蛋白IgG恒定区，免疫球蛋白IgG恒定区包括胶链区、CH2和CH3区，以及在这三个功能结构域之间分别添加的连接链。把该分离的核酸分子克隆到宿主表达载体，在宿主表达系统中表达的融合蛋白能同时结合CD80和BlyS，阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞的信号传递，从而抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞介入的自 身免疫性疾病。本发明第二方面提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的双靶标嵌合蛋白。本发明第三方面提供一种含有所述的多核苷酸的序列的表达载体。本发明第四方面提供一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的表达载体、或者染色体中整合有所述的多核苷酸。本发明第五方面提供所述的双靶标嵌合蛋白的制备方法，包括如下步骤:构建含有能表达所述双靶标嵌合蛋白的核苷酸序列，将此核苷酸序列构建至表达载体中，然后将含有融合蛋白基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，即得所述双靶标嵌合蛋白。优选的，所述双靶标嵌合蛋白的制备方法，具体包括以下步骤:(I)分别合成第一、二和三结构功能区域所对应的片段基因及IgGK分泌肽核酸片段；(2)将IgG K分泌肽核酸片段联接到质粒中，构建质粒P- K ；(3)将第一、二和三结构功能区域所对应的片段编码基因分别通过重叠PCR融合，通过克隆到步骤(2)所得的质粒中，构建质粒P-K -CT001 ；(4)将所获得的质粒P-K-CT001转化到宿主细胞中进行表达，得到所需要的融合蛋白CT001。
优选的，本发明提供所述核酸序列编码的表达载体及表达宿主载体系统；宿主载体系统可以是哺乳动物细胞，昆虫细胞和酵母细胞，例如CHO-Kl、CHO-S、DG44细胞、COS细胞、BHK细胞、293细胞、NSO细胞、PerC6细胞，Sf9细胞、Sf21细胞等。更优选的,所述表达载体为质粒pcDNA3.1 (Invitrogen),所述表达宿主载体系统为 CHO-Kl 或 CHO-S。本发明第六方面提供一种药物组合物，含有所述的双靶标嵌合蛋白及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。本发明第七方面提供所述的双靶标嵌合蛋白在制备治疗自身免疫性疾病的药物或制剂中的应用。本发明第八方面提供一种用于治疗自身免疫性疾病的方法，其中包括注射有效治疗剂量的所述的双靶标嵌合蛋白。本发明发明人发现，含有本发明所提供的融合蛋白的药物组合能减少B淋巴细胞数量和抑制T淋巴细胞的数量，降低免疫球蛋白水平，减轻炎症引起的组织结构破坏，缓解临床体征，用于治疗自身免疫性疾病，如RA，移植物抗宿主病，系统性红斑狼疮，哮喘和牛皮癖，炎性肠道疾病(Inflammatory Bowel Diseases)和动脉粥样硬化症等与T淋巴细胞异常和BlyS异常增多引起的疾病。


图1显示为本发明融合蛋白结构示意图。图2显示为本发明各融合蛋白的Western Blot (左图)SDS-PAGE (右图)试验结果示意图。图3 显示为本发明融合蛋白 (CT001 Λ5、CTOOl Λ 12、CT002A5、CT002A 12 或CTOOIΨO、CT002ΨO、CTOO1、CT002)分别与CD80和BlyS体外结合实验示意图。图4 显示为本发明融合蛋白(k-T、k-C、TC001、TC002、CT001、CT001W0、CT002 和0Τ002Ψ0)与CD80和BlyS体外结合实验示意图。图5-1显示为本发明动物试验后膝关节病理示意图。图5-2显示为本发明融合蛋白药效试验膝关节病理指数示意图(对应图5-1)。图5-3显示为本发明动物试验后踝足关节病理示意图。图5-4显示为本发明融合蛋白药效试验踝足关节病理指数示意图(对应图5-3)。图6-1显示为本发明融合蛋白对各试验组小鼠脾脏病理和脾脏B淋巴细胞⑶20的影响示意图。图6-2显示为本发明融合蛋白对各试验组小鼠脾脏病理和脾脏B淋巴细胞⑶20的吸光度密度测定示意图。图7显不为本发明各组动物试验后IgG、IgA和IgM在血中浓度测定结果不意图。图8-1显示为融合蛋白对各试验组小鼠脾脏总B淋巴细胞数的作用。图8-2显示为融合蛋白对各试验组小鼠脾脏总T淋巴细胞数的作用。图9-1显示为各试验动物组关节炎指数变化图。图9-2显示为各试验动物组足踝肿胀容积变化图。
具体实施例方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式
加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式
之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Samtoook等MOLECULAR CLONING:ALAB0RAT0RY MANUAL, Second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition,2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the seriesMETHODS IN ENZYM0L0 GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METHODS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press, San Diego,1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119，Chromatin Protocols (P.B.Becker,ed.)Humana Press, Totowa, 1999 等。实施例1.
融合蛋白的基因构建1.表达质粒的构建:CTLA-4和TACI细胞外区域的编码序列是依据基因(NM_005214.4/BC052683.1 ；NM_012452.2/BC028072)用基因合成法得到 SEQ ID N0.1(CTLA 模版)和 SEQ ID N0.2(TACI模版)。Fe模版(699bp)是以淋巴结cDNA (BD)为模版和下列引物PCR扩增所得(SEQ IDN0.3):引物1 (正向)5’ CTCATCGAGCCTAAGAGCAGCGACAAAACTCACACATGCCCAC3’引物2 (反向)5 ’ AAGGGAATCTAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3 ’IgG-k分泌肽(SEQ ID N0.4)用基因合成法得到，用限制性内切酶NheI和EcoRI (Invitrogen公司)切割、纯化，插入到事先用NheI和EcoRI切割、纯化后的pcDNA3载体(pcDNA3.1, Invitrogen),得到质粒 pcDNA3_k。
κ -T由TACI的第I和第2个半胱氨酸结构域与人免疫球蛋白Fe构成。首先，用引物3和4PCR扩增TACI模版，得到taci30_110，从aa30到aallO ;引物5和引物6PCR扩增Fe模版获得fc片段；然后用引物3和引物6将PCR扩增的和PCR扩增的fc片段通过重叠PCR融合而成。所获得的K -T编码DNA序列和氨基酸序列如SEQ ID N0.5和SEQID N0.6。引物3 (正向)5’AGCGAATTCGCTATGAGATCCTGCCCC引物4 (反向)5，CTCGCTCCTGAGCTTGTTCTCAC引物5 (正向)5，AACAAGCTCAGGAGCGAGCCTAAGAGCAGCGAC引物6 ( 反向)5，ATAGTCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG K -C由CTLA-4与人免疫球蛋白Fe构成。首先，用引物7和引物8以合成的CTLA-4为模板PCR扩增获得ctla-4片段；引物9和引物6以合成的Fe片段为模板PCR扩增获得fc片段，再用引物7和引物6通过重叠PCR将ctla-4和fc片段融合而成。所获得的κ-C编码DNA序列和氛基酸序列如SEQ ID N0.7和8。引物7:5，GACGAATTCATGCACGTGGCCCAGC引物8:5，CTCTTGGTCAGAATCTGGGCAC引物9:5 ’ CCAGATTCTGACCAAGAGCCTAAGAGCAGCGACTCOOl (k-taci30-110-glyl2-ctla-4-glyl2-fc)由 taci 的第 I 和第 2 个半胱氨酸结构域、ctla-4和人免疫球蛋白Fe构成。首先，引物3和引物10以合成的TACI为模板PCR扩增获得taCi3Q_11Q-gly 12 ;引物11和引物12以合成的CTLA-4为模板PCR扩增获得glyl2-ctla-4-glyl2 (注意:通过引物设计，将ctla-4中氨基酸位点120的Cystine变成了 Serine)。引物13和引物6PCR扩增Fe片段得到glyl2_fc。引物3和引物12将taCi3Q_11Q-glyl2和glyl2-ctla-4-glyl2用重叠PCR融合得到taci30_110-glyl2-ctla_4-glycl2。引物 3 和引物 6 将 taci30-110-glyl2-ctla-4-glycl2与 glyl2-fc 用重叠 PCR 融合得到 TCOOl (k-taCi3Q_11Q-glyl2-Ctla-4-glyl2-fC)。所获得的TCOOl编码DNA序列和氨基酸序列如SEQ ID N0.9和10。引物IO: 5，TCCGCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCTCCACCGCTCCTGAGCTTGTTCTCAC引物11:5，AACAAGCTCAGGAGCGGTGGAGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGAGCAATGCACGTGGCCCAGC引物12:5，TCCACCTCCGCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCTTGGTCAGAATCTGGGGACG引物13:5，CCAGATTCTGACCAAGGTGGAGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGAGAGCCTAAGAGCAGCGACGACAAATC002 (k-taci67-110-glyl2-ctla-4-glyl2-fc)由 taci 的第 2 个半胱氨酸结构域、ctla-4和人免疫球蛋白Fe构成。用引物14和引物IOPCR扩增TACI模版获得taci67_11(l ；引物11和引物12PCR扩增CTLA-4模版获得glyl2-ctla-4-glyl2(注意:通过引物设计，将ctla-4中氨基酸位点120的Cystine变成了 Serine)。引物13和引物6PCR扩增Fe模版获得glyl2-fc。引物14和引物12将taci67_11(l和glyl2-ctla-4-glyl2通过重叠PCR得到taci67_11(|-glyl2-ctla-4_glycl2。引物 14 和引物 6 将 taci67_11(|-glyl2-ctla_4-glycl2 与glyl2-fc用重叠PCR融合得到TC002(k-taci67_110-glyl2-ctla-4-glyl2-fc)。所获得的 TC002 编码 DNA 序列和氨基酸序列如 SEQ ID N0.11 和 12。引物14:5，-AGCGAATTCAGGTCACTCAGCTGCCGCT001由ctla_4、taci的第I和第2个半胱氨酸结构域和人免疫球蛋白Fe构成。以合成基因CTLA-4为模版，分别用引物7和引物12PCR扩增，得到ctla-4-glyl2(注意:通过引物设计，将ctla-4中氨基酸位点120的Cystine变成了 Serine);引物15和引物16PCR扩增TACI模版获得taci29_114- (GGS) 2 ;引物17和6PCR扩增Fe模版获得fc ;用引物7和引物16将 ctla-4-glyl2 和 taci29_114_ (GGS) 2 重叠 PCR 得到 ctla-4-glyl2_taci29_114，再用引物 7 和引物 6 将 ctla-4-glyl2-taci29_114 与 fc 通过重叠 PCR 融合而成(ctla-4_taci29_114-fc)。所获得的CT001DNA编码序列和氨基酸序列如SEQ ID N0.13和14。引物15:5，CCAGATTCTGACCAGGGTGGAGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGAGTGGCTATGAGATCCTGCCCC引物16:5，GCTTCCACCGCTTCCACCAAGGTTCACTGGGCTCCTGAG引物17:5，AGCCCAGTGAACCTTGGTGGAAGCGGTGGAAGCGAGCCTAAGAGCAGCGACAAAACCT001 Λ5和CT001 Λ 12均由ctla_4、taci的第I和第2个半胱氨酸结构域和人免疫球蛋白Fe构成。CT001 Λ 5的ctla4片段需用引物7和引物18扩增CTLA-4模版得到(注意:通过引物设计，将ctla-4中氨基酸位点120的Cystine变成了 Serine)。引物19和引物20PCR扩增CT001得到taci29_114-glyl2 ;引物21和引物6PCR扩增Fe模版得到fc ;用引物7和引物20重叠PCR得到Ctla-4-glyl2-taCi29_114A 5 ;再用引物7和引物6将ctla-4-glyl2-taci29_114 Δ 5 与 fc 通过重叠 PCR 融合而成(ctla-4_taci29_114-fc)。所获得的CT001 Δ 5DNA编码序列和氨基酸序列如SEQ ID N0.15至16。
·
CT001 Δ 12的ctla4片段需用引物7和引物12扩增CTLA-4模版得到(注意:通过引物设计，将ctla-4中氨基酸位点120的Cystine变成了 Serine)。引物15和引物20PCR扩增CT001得到taci29_114-glyl2 ;引物21和引物6PCR扩增Fe模版得到fc ；用引物7和引物20重叠PCR得到Ctla-4-glyl2-taCi29_114A 12 ;再用引物7和引物6将ctla-4-glyl2-taci29_114 Δ 12 与 fc 通过重叠 PCR 融合而成(ctla-4_taci29_114-fc)。所获得的CT001 Δ 12DNA编码序列和氨基酸序列如SEQ ID N0.17至18。CT001 Λ 5 和 CT001 Δ 12 与 CT001 区别是在 taci 和 Fe 之间，CT001 Λ 5 和 CT001 Δ 12都含有一个12个氨基酸的连接肽，CT001则含有6个氨基酸的连接肽。引物18:5，ACCTCCGCCTCCACCTTGGTCAGAATCTGGGGACGG引物19:5，CCAGATTCTGACCAGGGTGGCGGAGGTGGAGTGGCTATGAGATCCTGCCCC引物20:5，TCCACCTCCGCCACCTCCGCCACCTCCGCCTCCACCAAGGTTCACTGGGCTCCTGAG引物21:5’ CCAGTGAACCTTGGTGGAGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGAGAGCCTAAGAGCAGCGACAAAACCT001Ψ0由ctla_4、taci的第I和第2个半胱氨酸结构域和人免疫球蛋白Fe构成。CT001Ψ0在taci和Fe之间没有添加连接肽。以CT001为模板，引物7和引物22PCR扩增ct Ia4-gly 12_tac i 29-114_ Ψ O ;引物23和引物6PCR扩增Fe模版得f c ;再用引物7和引物 6 将 ctla-4-gly 12-taci29-l 14 与 fc 通过重叠 PCR 融合而成(ctla-4-taci29_l 14-fc)。所获得的CT001Ψ0的DNA编码序列和氨基酸序列如SEQ ID N0.19和20。引物22:5’ AAGGTTCACTGG GCTCCTGAGCTTGTTCTCAC
引物23:5 ’ AGCCCAGTGAACCTTGAGCCTAAGAGCAGCGACAAAACTCACACCT002由ctla-4、taci的第2个半胱氨酸结构域和人免疫球蛋白Fe三部分构成。以CT-001为模板，用引物7和引物12PCR扩增ctla-4，得到ctla-4-glyl2 ;用引物24和引物6PCR扩增taci67-l 14-(GGS) 2-fc ;用引物7和引物6将ctla_4-glyl2和taci67-114-(GGS)2-fc用重叠PCR融合得到CT-002。所获得的CT-002DNA和氨基酸序列如 SEQ ID N0.21 和 22。引物24:5，GATTCTGACCAAGGTGGAGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGCGGAGGTGGAAGGTCACTCAGCTGCCGCAAGCT002 Δ 5、CT002 Δ 12 和(:Τ002Ψ0:由 ctla-4、taci 的第 2 个半胱氨酸结构域和人免疫球蛋白Fe三部分构成。分别以CT001 Λ5ΧΤ001 Λ 12和CT001Ψ0为模板，用引物7和引物18或引物7和引物12PCR扩增CTLA模版，得到c 11 a-4-g I y5和c 11 a-4-g I y 12 ;用引物25与引物6PCR扩增CT001 Λ5得5gly-taci67_114-12gly-fc，用引物24分别与引物6PCR扩增 CT001 Δ 12 和 CT001Ψ0 分别得到 12gly-taci67_114_12gly-fc、12gly-taci67_114-fc。用融合 PCR 将 ctla_4_gly5 和 ctla_4_glyl2 片段分别与 5gly-taci67-114_12gly-fc、12gly-taci67-114-12gly-fcU2gly-taci67-114-fc 融合，得到 CT002A5、CT002A 12 和0Τ002Ψ0ο所获得的CT002 Λ 5的DNA和氨基酸序列如SEQ ID N0.23至24。CT002 Λ 12的DNA和氨基酸序列如SEQ ID N0.25至26。CT002W0DNA和氨基酸序列如SEQ ID N0.27至28。

引物25:5，CCAGATTCTGACCAAGGTGGAGGCGGAGGTAGGTCACTCAGCTGCCGCAAG通过PCR融合的目的基因片段，用限制性内切酶EcoRI和XhoI (Invitrogen公司)切割，纯化，插入到事先用EcoRI和XhoI切割、纯化后的pcDNA3-K载体，最终得到表达质粒 P κ -T、P κ -C、pCTOOl、pCTOOl Λ5、pCTOOl Δ 12、ρΟΤΟΟΙΨΟ, pCT002、pCT002A5、PCT002 Δ 12、pCT002W0、pTC001和pTC002。对每个表达质粒的核苷酸编码序列进行了序列测序分析，确认所有表达质粒的序列是正确的。ρκ-Τ核苷酸编码序列检测结果如SEQ IDN0.5所示、ρκ-C核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID N0.7所示、pCTOOl核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID N0.13所示、pCTOOl Δ 5核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID N0.15所示、pCTOOl Δ 12核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID N0.17所示、pCTOOlΨ0核苷酸编码序列检测结果如SEQ IDN0.19所示、pCT002核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID N0.21所示、pCT002 Δ 5核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID N0.23所示、pCT002 Δ 12核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID N0.25所示、ρσΓ002Ψ0核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID N0.27所示、pTCOOl核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID N0.9所示和pTC002核苷酸编码序列检测结果如SEQ ID N0.11所
/Jn ο实施例2.CHO细胞的转染、重组克隆的筛选和融合蛋白的表达本发明中多个融合蛋白质是在CH0-K1和CHO-S细胞中表达并分泌到培养液中，用葡萄球菌A蛋白亲和沉析法纯化所得。当瞬时表达本发明中融合蛋白，重组质粒用DNA纯化试剂盒(Qiagen公司)提纯后，用脂质体2000(InVitrOgen公司)转染到CHO-Kl (ATCC#CCL61)细胞。在无血清培养液OPT1-MII中培养3天后收集上清液。葡萄球菌A蛋白亲和沉析法纯化后的融合蛋白，经ELISA测定浓度后，用免疫印迹分析得到验证。所述ELISA测定的具体方法为:用Bethyl公司的Fe夹心酶联免疫分析ELISA检测试剂盒来测定融合蛋白Fe。将稀释后的融合蛋白(CT001A5、CT001A12、CT002A5、CT002 Λ 12 或 CTOOIΨ O、CT002 Ψ O、CTOO1、CT002)加入到事先用抗 Fe 包被抗体(200ng/ 孔)包被的ELISA板,在室温孵育1.5小时,经过I小时封闭后，加入Fe检测抗体,在室温孵育30分钟后加人底物显色，检测被包被抗体结合的融合蛋白浓度。所述免疫印迹法的具体条件为:将等量的不同融合蛋白3-5微克用SDS-PAGE电泳分离，转移到PVDF膜上，经过封闭，加入抗Fc-HRP赘合抗体，加入底物TMB显色。稳定表达本发明中k-τ、k-c、TCOO1、CTOOl和CT002融合蛋白，用电穿孔法将纯化后的质粒转染到CHO-S细胞(Invitrogen公司)。48小时后，添加700ug/ml的G418 (Invitrogen公司)到培养液中。2周后，用有限密度稀释法进行细胞克隆培养。第五周，用ELISA法测定各克隆细胞株蛋白表达量，挑选高产克隆细胞株，进行放大培养。实施例3.重组融合蛋白的纯化、制剂的初步制备工艺和稳定性稳定转染的CHO-S细胞能持久表达大量的融合蛋白，并分泌到细胞培养液中。细胞培养液上清经离心过滤，用超滤膜包(IOkDa, Sartorius Stedim)浓缩,样本上到事先用缓冲液(30mM Tris-HCl，0.15MNaCl，pH7.5)平衡好的蛋白 A柱(GE Health Care)。用缓冲液洗涤至平衡，用洗脱液(20mM柠檬酸钠，pH3.4)洗脱目的蛋白，按洗脱峰收集，收集时在收集管事先放置10%体积的中和缓冲液(IM Tris，pH8.0)。用缓冲液(30mM Tris-HCl,pH7.5)稀释蛋白A柱洗脱下的目的蛋白，样本上到预先用缓冲液(30mM Tris-HCl, 30mMNaCl,pH7.5)准备好的离子柱(GE health Care)，用缓冲液洗涤至平衡，用含盐缓冲液(30mMTris-HC1,1M NaCl, pH7.5)以浓度梯度模式洗脱目的蛋白，收集目的蛋白，经脱盐、缓冲液置换、浓缩、蛋白定量、分装，进行初步蛋白稳定性实验，或储藏在_80°C用于下述实验各融合蛋白的SDS-PAGE试验结果如图2所示。各融合蛋白均经过N端测序，确认各融合蛋白读框无误。蛋白初步稳定性实验:将纯化、脱盐、不同缓冲液置换后的蛋白用Centricon离心超滤管(Millipore)浓缩到2mg/ml的浓度，分装到美国安捷伦Agilent9301_1388Crimpcap micro vial瓶中，分别放置在4°C、25°C、37°C、_80°C，直接进行或在设定的时间点进行SEC-HPLC分析。CTOOl稳定性试验-SEC-HPLC分析如表1.1-表1.4所示:
表1.权利要求
1.一种双靶标嵌合蛋白，所述双靶标嵌合蛋白包括三个结构功能区域，第一结构功能区域是CTLA-4的部分细胞外区域，第二结构功能区域是TACI的部分细胞外区域，第三结构功能区域是免疫球蛋白IgG的Fe片段。
2.如权利要求1所述的一种双靶标嵌合蛋白，其特征在于，所述双靶标嵌合蛋白从N端到C端依次为第一、二和三结构功能区域，所述第一结构功能区域的氨基酸序列如SEQ IDN0.29所示，所述第二结构功能区域的氨基酸序列如SEQ ID N0.30或31所示，所述第三结构功能区域的氨基酸序列如SEQ ID N0.32所示。
3.如权利要求2所述的一种双靶标嵌合蛋白，其特征在于，所述第一结构功能区域和第二结构功能区域之间还包括第一连接肽，所述第二结构功能区域和第三结构功能区域之间还包括第二连接肽。
4.如权利要 求3所述的一种双靶标嵌合蛋白，其特征在于，所述连接肽的长度为5-15个氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的一种双靶标嵌合蛋白，其特征在于，所述双靶标嵌合蛋白的氨基酸序列选自 SEQ ID N0.14、16、18、20、22、24、26 或 28。
6.—种多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸编码如权利要求1-5任一权利要求所述的双革巴标嵌合蛋白。
7.一种含有权利要求6所述的多核苷酸的序列的表达载体。
8.—种重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的表达载体、或者染色体中整合有权利要求6所述的多核苷酸。
9.如权利要求1-5任一权利要求所述的双靶标嵌合蛋白的制备方法，包括如下步骤:构建含有能表达所述双靶标嵌合蛋白的核苷酸序列，将此核苷酸序列构建至表达载体中，然后将含有融合蛋白基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，即得所述双靶标嵌合蛋白。
10.一种药物组合物，含有如权利要求1-5中任一权利要求所述的双靶标嵌合蛋白及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。
11.权利要求1-5中任一权利要求所述的双靶标嵌合蛋白在制备治疗自身免疫性疾病的药物或制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及融合蛋白领域，特别是涉及一种双靶标嵌合蛋白。本发明提供一种双靶标嵌合蛋白，所述双靶标嵌合蛋白包括三个结构功能区域，第一结构功能区域是CTLA-4的部分细胞外区域，第二结构功能区域是TACI的部分细胞外区域，第三结构功能区域是免疫球蛋白IgG的Fc片段。本发明发明人发现，含有本发明所提供的融合蛋白的药物组合能减少B淋巴细胞数量和抑制T淋巴细胞的数量，降低免疫球蛋白水平，减轻炎症引起的组织结构破坏，缓解临床体征，用于治疗自身免疫性疾病，如RA，移植物抗宿主病，系统性红斑狼疮，哮喘和牛皮癣,炎性肠道疾病和动脉粥样硬化症等与T淋巴细胞异常和BlyS异常增多引起的疾病。
文档编号A61K47/48GK103232542SQ20131004183
公开日2013年8月7日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者殷勇 申请人:殷勇, 陈煦