专利名称：一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及本发明涉及一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物及其制备方法和用途。
背景技术：
益生菌属于一种微生态制剂，联合国粮农组织/世界卫生组织将益生菌定义为:“活的微生物，当摄入达到足够数量时将对宿主的健康带来益处”。在这个定义包含3个关键点:首先是活菌，其次是有效剂量，最后是能产生有益健康的作用。前两点属于质量标准的范畴，第三点属于健康声称的范畴。所有益生菌的立法和指导准则都是围绕这三点进行细化的。活性是关键，益生菌必须是“活的”，才能起到健康作用，这是益生菌产生功效的基础；其次，益生菌的临床效力与每日摄入量密切相关。大量的益生菌生理效应研究(如治疗腹泻、乳糖不耐受、提高粪酶活性等试验室研究)证实，每日有效摄入量为109-101(icfu。对于急性或者慢性胃肠道感染、免疫或炎性疾病，益生菌的效果依赖于菌株选择，不同的治疗也需要不同的剂量。不可能制定统一的益生菌剂量标准，治疗所需的剂量要依靠大量的研究来确定。益生菌达到临床效应的活菌数，一般小肠中每克内容物的活菌数量≥ 1O6CFU,结肠中每克内容物的活菌数量> 108CFU。治疗急性感染性腹泻更需要短疗程、高剂量的益生菌制剂。世界胃肠组织临床指南对益生菌、益生元总结了一些临床状况。所需益生菌的剂量因菌株和产品不同而差异很大。虽然很多非处方产品提供的剂量范围为1O9-1OioCFU/剂，但是某些产品被发现在较低剂量时也有效，而某些产品所需的剂量则要多得多。确定益生菌的普遍剂量是不现实的，剂量必须是针对菌株，来源于提示有健康功效的体内试验。发明专利92113318.9公开了一种地衣芽孢杆菌CMCC63516 (CGMCC N0.0183)制成的微生态制剂，即整肠生。用于治疗成人急性、慢性腹泻及各种原因引起的肠道菌群失调症，该专利提供的这种微生态制剂为每克活菌数9-11亿，北京协和医院吴梓涛等开展的II期临床的推荐剂量为每日摄入量1.5X109CFU。地衣芽孢杆菌进入肠道后，需要快速的生长、增殖成为优势菌群后才得以实现其药效的发挥，拮抗葡萄球菌，酵母样菌等致病菌，促进双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌、消化链球菌生长，从而调整菌群失调达到治疗目的，且具有无副作用，无残留等优点。但遗憾的是，目前针对该产品使用剂量方面的研究较少，吴铁林等人报道的应用地衣芽孢杆菌调治肠道菌群失调的研究，通过动物试验证实了地衣芽孢杆菌63516极低的生物毒性，亚急性毒性试验中，相当于LDltl十分之一的计量可达37500亿/Kg ；李玲等人报道整肠生常规剂量对于慢性肠炎的治疗，效果较好。对于急性腹泻，冯婉玉等人报道整肠生大剂量治疗给药具有良好效果，但均未就其最佳的剂量进行深入的研究。有些患者为了不影响正常的工作和生活，希望快速解决腹泻等相关疾病的困扰，所以在服用地衣芽孢杆菌活菌制剂时，均会自主加大用药量。虽然达到了起效快、疗程短的目的，但盲目加大用药剂量，不科学、不规律，依从性也较差。所以为了提高用药剂量的准确性，做到安全用药，迫切需要针对肠道菌群失调研究更为安全、有效的剂量范围，指导临床用药。从发明专利92113318.9和201010578718.0公开的数据来看，目前地衣芽孢杆菌CMCC63516 (CGMCC N0.0183)菌粉的活菌数均较低，一般在250-530亿/g，另外，按发明专利92113318.9和201010578718.0公开的以无水碳酸钙作为稀释剂制备的菌粉，其流动性较差(休止角为:45.0° )，因其在现有的10亿/g的地衣芽孢杆菌活菌制剂中添加量有限，还未影响制剂的工业化生产，但如果添加量大于产品的15%，就会明显降低制剂产品整体的流动性，较难实现工业化生产，所以过去这种以无水碳酸钙作为稀释剂制备地衣芽孢杆菌菌粉的方法已经不能适用本发明所涵盖的高剂量范围。另外，以往的研究过多的关注每批发酵液菌泥的产量，但这解决不了单位质量菌粉中活菌含量不高的现状，满足不了使用少量的菌粉既可调配高剂量、高活菌数成品的目标，如何在保证菌泥产量的情况下，提升单位质量菌泥中的芽孢活菌数，已成为制约高剂量地衣芽孢杆菌活菌制剂开发的关键问题。因此，研制开发一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物及其制备方法和用途一直是亟待解决的课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物及其制备方法和用途，该活菌组合物用于肠道菌群失调引起的急、慢性肠炎、腹泻的治疗及肠道菌群失调的防治药物中，更为安全、有效的剂量范围。本发明的目的是这样实现的:一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物，包括菌粉和适合的辅料，每克组合物中含有地衣芽孢杆菌活菌数为15-200亿；每克组合物中含有地衣芽孢杆菌活菌数为26-200亿；每克组合物中含有地衣芽孢杆菌活菌数为30-200亿；每克组合物中含有地衣芽孢杆菌活菌数为45-100亿；制备菌粉时需要在菌泥中添加稀释剂，菌泥与稀释剂的比例为1:3-5 ;所述稀释剂为微晶纤维素、微晶纤维素与乳糖混合物、微晶纤维素与无水碳酸钙混合 物中的任何一种；稀释剂中微晶纤维素与乳糖的混合比例为1:0.25-2.3，优选1:0.43-1 ;稀释剂中微晶纤维素与无水碳酸钙的混合比例为任意比例，优选1:0.43-2.3 ;一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物作为制备用于肠道菌群失调引起的急、慢性肠炎、腹泻的治疗及肠道菌群失调的防治药物中的应用，所述地衣芽孢杆菌活菌的每日推荐使用剂量为0.25-3.4亿活菌/Kg ;所述地衣芽孢杆菌活菌的每日推荐使用剂量为0.43-3.4亿活菌/Kg ;所述地衣芽孢杆菌活菌的每日推荐使用剂量为0.5-3.4亿活菌/Kg ;所述地衣芽孢杆菌活菌的每日推荐使用剂量为0.75-1.7亿活菌/Kg 种高剂量地衣芽孢杆菌活菌的制备方法，将种子液接种于发酵罐的灭菌培养基中，36-38°C发酵18-20小时后，改变培养温度至41-49°C，并加入Mn2+至培养基终浓度为0.005-0.05%,培养至发酵结束；将种子液接种于发酵罐的灭菌培养基中，36-38°C发酵18-20小时后，改变培养温度至43-470C，并加入Mn2+至培养基终浓度为0.01-0.04%,培养至发酵结束。本发明的要点在于一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物及其制备方法和用途，其原理在于高剂量的地衣芽孢杆菌活菌组合物比现行常规剂量起效更快，疗程更短，能够迅速恢复肠道定植抗力，并且不影响肠道内正常菌群比例，在停服后可以迅速的从肠道菌群中消失，对小鼠肠道无任何不良影响。但是剂量超过一定范围后，止泻治愈和恢复肠道微生物定植抗力的效果无显著差异。另外，本发明针对上面提及的地衣芽孢杆菌单位质量菌粉中活菌含量不高；以无水碳酸钙作为稀释剂制备的菌粉，其流动性较差，增大添加量会明显降低制剂产品整体的流动性，较难实现工业化生产的现状问题。研究了各种影响芽孢形成的因素，进行了大量的地衣芽孢杆菌菌粉的制备方法研究，通过对进入稳定期的发酵液进行升温和添加Mn2+处理，大幅度提高了单位菌泥中的芽孢活菌数；同时，重新系统的筛选了替代无水碳酸钙的稀释剂，并优化了混合比例，大量保留了高温干燥后的芽孢活菌数，并且大幅度改善了菌粉的流动性，实现了高剂量的地衣芽孢杆菌活菌制剂的工业化生产。本发明在研究发现菌粉制造过程中，活菌数量的损失最多是发生在高温干燥过程中，如果菌泥中成熟的芽孢比例增加，且选用的稀释剂能够在该过程对菌体起到保护作用，那将大幅度提升菌粉中的活菌数，减少损失，降低成本。一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物及其制备方法和用途与现有技术相比，具有单位质量菌粉中活菌含量高；高温干燥后的芽孢活菌数保留率高；菌粉的流动性更佳，具有起效更快、疗程更短，能够迅速恢复肠道定植抗力的显著效果，可实现高剂量的地衣芽孢杆菌活菌组合物的工业化生产等优点，将广泛地应用于微生物技术领域中。
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。图1是本发明的5.3-31.5mg/kg五个治疗组停药后各治疗组小鼠粪便中BL63516变化图。图2是本发明的34.5-207mg/kg五个治疗组停药后各治疗组小鼠粪便中BL63516变化图。
具体实施方式
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例一1.材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物SPF级昆明种小鼠，鼠龄6-8周，体重20±2g，雌雄各半，由东北制药集团沈阳第一制药厂动物房提供，实验动物使用许可证(SYXK (辽)2009-0007 )。1.1.2 药物注射用氨苄西林钠(中诺药业(石家庄)有限公司，0.5g/瓶)，地衣芽孢杆菌BL63516菌粉(东北制药集团沈阳第一制药厂，批号:YJ12018，294亿/g)1.1.3主要试剂双歧杆菌选择性培养基(BBL)，肠球菌选择性培养基(胆汁-七叶苷-叠氮钠琼脂)，乳杆菌选择性培养基(MRS)，肠杆菌培养基(EMB)，产气荚膜梭菌培养基(TSC)均购自北京陆桥技术有限责任公司。牛肉膏，蛋白胨均购自北京奥博星生物技术有限责任公司，氯化钠购自天津市博宇化工有限公司。1.2 方法
1.2.1地衣芽孢杆菌BL63516菌悬液配制取2g菌粉溶解于1600ml生理盐水中，配制成1.25mg/ml的高浓度菌液，取1000ml高浓度菌液加入500ml生理盐水，配制成0.83mg/ml菌液，将0.83mg/ml菌液进行2倍系列稀释成 0.42mg/ml 和 0.2 lmg/ml 菌液。每次灌胃前都需现配现喂。1.2.2试验动物分组参考赵伟等《不同种实验动物间用药量换算》中的“按体表面积直接换算法”，A为每日每千克体重的菌粉剂量。由:A人X60Kg+l.6246m2=A小鼠 Χ0.02Kg + 0.0067m2，得到:A人=A小鼠/12.37地衣芽孢杆菌活菌制剂现行剂量为每天15亿，按60Kg体重计算，应为0.25亿/kg.d，换算为小鼠即为3.09亿/kg.d，使用地衣芽孢杆菌BL63516菌粉YJ12018，约合10.5mg/kg.d0选用健康Balb/c小鼠72只，体重20±2g。用鼠饲料及清水适应饲养I周后，按随机分组的方法将小鼠分成6组，每组12只，雌雄各半。I组为空白对照组，其余5组模型组用氨苄西林钠制成肠道菌群失调腹泻模型，然后分为自然恢复组、治疗I组(每日灌胃5.3mg/kg)、治疗II组(每日灌胃10.5mg/kg)、治疗III组(每日灌胃21mg/kg)、治疗IV组(每日灌胃31.5mg/kg)。治疗I至IV组分别对应的人用剂量为每日7.5亿、15亿、30亿和45亿活菌。1.2.3 给药空白对照组每日灌胃等体积0.85%生理盐水；自然恢复组在造模成功后灌胃等体积0.85%生理盐水，治疗组 分别灌服等体积不同浓度的菌悬液。灌胃方法:在自由采食和饮水的基础上，于每日上午9时，采取灌胃方式，分别对各组小鼠按要求给药，每次0.5ml，共计灌服7天。1.2.4抗生素诱导的肠道菌群失调的腹泻小鼠造模参照李佳荃等文献方法，用氨苄西林钠制造肠道菌群失调的腹泻小鼠模型。造模前6小时开始禁食，自由饮水。注射用氨苄西林钠临用前用0.85%的生理盐水配制成浓度为0.5g/ml的溶液备用，每次灌胃氨苄西林钠0.5ml，每天2次，连续5天，小鼠单只单笼饲养，鼠笼笼底垫有滤纸，观察小鼠活动现象。选用腹泻率作为造模成功的观察指标。1.2.5小鼠肠道菌群检测分别在给予抗生素第5天，灌胃地衣芽孢杆菌菌粉第3、5、7天和停服后第3、5、10、15、20、25天，采用光R氏法无菌采取空白对照组，自然恢复组及各不同剂量治疗组粪便各1.0g，置于灭菌的硫酸纸上称重后放入装有玻璃珠的无菌瓶内，加入9ml无菌生理盐水，振荡使粪便均质化并进行10倍系列稀释。根据预实验结果，选择2个适合菌落计数的稀释度，分别取100 μ I于选择性培养基上,均勻涂布后,分别于需氧、厌氧环境中按相应培养条件进行培养。待培养好后，按照表I所标注的鉴定方法进行菌落鉴定，计数各培养基菌落数。对所需分析6种菌进行菌群分析，表中结果以每克湿便中菌落对数值表示(lgCFU/g)。 表I肠道菌种选择培养及鉴定
权利要求
1.一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物，包括菌粉和适合的辅料，其特征在于:每克组合物中含有地衣芽孢杆菌活菌数为15-200亿。
2.根据权利要求1所述的一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物，其特征在于:每克组合物中含有地衣芽孢杆菌活菌数为26-200亿。
3.根据权利要求1所述的一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物，其特征在于:每克组合物中含有地衣芽孢杆菌活菌数为30-200亿。
4.根据权利要求1所述的一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物，其特征在于:每克组合物中含有地衣芽孢杆菌活菌数为45-100亿。
5.根据权利要求1所述的一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物，其特征在于:制备菌粉时需要在菌泥中添加稀释剂，菌泥与稀释剂的比例为1:3-5。
6.根据权利要求1或5所述的一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物，其特征在于:所述稀释剂为微晶纤维素、微晶纤维素与乳糖混合物、微晶纤维素与无水碳酸钙混合物中的任何一种。
7.根据权利要求1或5所述的一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物，其特征在于:稀释剂中微晶纤维素与乳糖的混合比例为1:0.25-2.3，优选1:0.43-1。
8.根据权利要求1或5所述的一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物，其特征在于:稀释剂中微晶纤维素与无水碳酸钙的混合比例为任意比例，优选1:0.43-2.3。
9.根据权利要求1所述的一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物作为制备用于肠道菌群失调引起 的急、慢性肠炎、腹泻的治疗及肠道菌群失调的防治药物中的应用，其特征在于:所述地衣芽孢杆菌活菌的每日推荐使用剂量为0.25-3.4亿活菌/Kg。
10.根据权利要求1或9所述的一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物作为制备用于肠道菌群失调引起的急、慢性肠炎、腹泻的治疗及肠道菌群失调的防治药物中的应用，其特征在于:所述地衣芽孢杆菌活菌的每日推荐使用剂量为0.43-3.4亿活菌/Kg。
11.根据权利要求1或9所述的一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物作为制备用于肠道菌群失调引起的急、慢性肠炎、腹泻的治疗及肠道菌群失调的防治药物中的应用，其特征在于:所述地衣芽孢杆菌活菌的每日推荐使用剂量为0.5-3.4亿活菌/Kg。
12.根据权利要求1或9所述的一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物作为制备用于肠道菌群失调引起的急、慢性肠炎、腹泻的治疗及肠道菌群失调的防治药物中的应用，其特征在于:所述地衣芽孢杆菌活菌的每日推荐使用剂量为0.75-1.7亿活菌/Kg。
13.根据权利要求1所述的一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌的制备方法，其特征在于:将种子液接种于发酵罐的灭菌培养基中，36-38 °C发酵18-20小时后，改变培养温度至41-490C，并加入Mn2+至培养基终浓度为0.005-0.05%,培养至发酵结束。
14.根据权利要求1或13所述的一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌的制备方法，其特征在于:将种子液接种于发酵罐的灭菌培养基中，36-38°C发酵18-20小时后，改变培养温度至43-470C，并加入Mn2+至培养基终浓度为0.01-0.04%,培养至发酵结束。
全文摘要
一种应用于微生物技术领域中的高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物及其制备方法和用途，每克组合物中含有地衣芽孢杆菌活菌数为15-200亿；制备菌粉时需要在菌泥中添加稀释剂，菌泥与稀释剂的比例为1:3-5；一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌组合物作为制备用于肠道菌群失调引起的急、慢性肠炎、腹泻的治疗及肠道菌群失调的防治药物中的应用，所述地衣芽孢杆菌活菌的每日推荐使用剂量为0.25-3.4亿活菌/Kg；一种高剂量地衣芽孢杆菌活菌的制备方法，将种子液接种于发酵罐的灭菌培养基中，36-38℃发酵18-20小时后，改变培养温度至41-49℃，并加入Mn2+至培养基终浓度为0.005-0.05%，培养至发酵结束。该发明单位质量菌粉中活菌含量高；高温干燥后的芽孢活菌数保留率高；菌粉的流动性更佳，具有起效更快、疗程更短，迅速恢复肠道定植抗力的显著效果。
文档编号A61K47/26GK103099821SQ20131004154
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者李雪龙, 雷健, 陈伟, 吴楠, 彭勃 申请人:东北制药(沈阳)科技发展有限公司