一种检测弓形虫急性感染的方法及其靶标蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种检测弓形虫急性感染的方法及其靶 标蛋白。
【背景技术】
[0002] 弓形虫是一种世界范围内寄生的原虫，可导致人畜流产、死胎和免疫抑制患者死 亡，其临床表现复杂，确诊困难，给公共卫生和畜牧业带来极大危害。在过去，免疫学检测方 法是弓形虫病的主要检测方法，但是抗弓形虫IgG的检测难以区分急性感染和既往感染， IgM和IgA阳性也不能作为急性感染的标志。因此，弓形虫急性感染的早期检测标志物有待 进一步寻找确定。
[0003] 弓形虫循环抗原（CirculatingAntigens，CAg)是弓形虫急性感染期虫体自身排 泄和裂解产物，动物感染弓形虫1-2天即可检出CAg，2周后滴度显著降低，CAg阳性提示弓 形虫病急性、活动性感染，是病原体存在的重要标志，是早期感染的可靠指标。排泄-分泌 抗原（Excretory/SecretoryAntigens，ESA)为CAg的主要成分，现有研宄大多是提取ESA 抗原或者表达某个分泌蛋白制备多抗来检测血清中的CAg，由于CAg抗原的含量较少，且成 分复杂，从而使得这些方法的特异性、灵敏度有限。因此，目前尚缺少一种特异性和灵敏度 都较高的检测弓形虫的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服了目前检测弓形虫感染的方法难以区分急性 感染和既往感染、利用循环抗原来检测急性感染的方法因循环抗原含量低、成分复杂等原 因特异性和灵敏度有限的问题，提供了一种适用于弓形虫早期急性感染检测的高特异性、 高敏感性的检测方法，用所述检测方法能够快速检测弓形虫急性感染，并具有较高的特异 性和灵敏度。
[0005] 本发明技术方案之一：一种非疾病诊断治疗目的的检测弓形虫急性感染的方法， 其包括下述步骤：使待检测样本与弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反 应。
[0006] 本发明中，所述待检测样本可以为本领域常规所指被弓形虫感染的样本，较佳地 为被弓形虫感染后的血清样本。
[0007] 本发明中，所述弓形虫ELMO蛋白可以为本领域常规所指，较佳地为氨基酸序列如 GenBank收录号为EPT30320. 1的序列所示，所述弓形虫ELMO蛋白的制备方法可以为本领 域常规的方法，如合成法或表达纯化法，较佳地为原核表达纯化法。所述原核表达纯化方法 较佳地包括下述步骤：培养含有所述弓形虫ELMO基因的原核表达载体的原核表达菌株，破 碎细胞，从裂解液中提取所述弓形虫ELMO蛋白。所述原核表达的菌株可以为本领域常规的 表达菌株，较佳地为大肠杆菌表达菌株，更佳地为大肠杆菌BL21菌株。所述原核表达的载 体可以为本领域常规的表达载体，较佳地为pET系列表达载体，最佳地为pET28a载体。所 述提取方法可以为本领域常规，较佳地为层析法，更佳地为亲和层析法，最佳地为镍离子-6 组氨酸亲和层析法。
[0008] 本发明中，所述弓形虫ELMO蛋白的抗体可以为本领域常规所指的抗体，如单克隆 抗体或多克隆抗体。所述弓形虫ELMO蛋白的抗体的制备方法可以为本领域常规的制备方 法，较佳地包括下述步骤：将所述弓形虫ELMO蛋白免疫动物后制得所述抗体，更佳地包括： 将所述弓形虫ELMO蛋白免疫动物，二次免疫后采集血液分离含有所述抗体的血清。所述动 物可以为本领域常规使用到的动物，较佳地为兔或小鼠，更佳地为小鼠。所述免疫注射可以 为本领域常规的注射方式，如直接将所述弓形虫ELMO蛋白注射到动物体内，较佳地为将所 述弓形虫ELMO蛋白与弗氏佐剂一起注射到所述动物体内。所述二次免疫的间隔时间较佳 地为2周，所述采集血液较佳地为从所述动物的尾静脉采集。
[0009] 本发明中，所述反应可以为本领域常规所指，较佳地包括下述步骤：（1)将所述弓 形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体包被于基质上；（2)向步骤（1)中包被有所 述弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体的基质上加入待检测样本，使其与所述 弓形虫ELMO蛋白或所述弓形虫ELMO蛋白的抗体发生反应。
[0010] 本发明中，较佳地还可以包括步骤（3):检测步骤（2)所述反应的结果。所述检测 可以为本领域常规的检测方法，较佳地为检测抗原与抗体反应的检测方法，例如当基质上 包被的为ELMO蛋白时，在步骤（2)过后加入辣根过氧化物酶（HRP)标记的抗IgG的抗体后 孵育、显色并测定化学发光值；当基质上包被的是所述检测弓形虫急性感染的抗体时，在步 骤（2)后加入与所述检测弓形虫急性感染的抗体异源的ELMO抗体，孵育后再加入辣根过氧 化物酶（HRP)标记的抗IgG的抗体后再孵育、显色并测定化学发光值。
[0011] 本发明技术方案之二：一种检测弓形虫急性感染的抗体，其是通过包括如下步骤 的制备方法所制得的：将弓形虫ELMO蛋白免疫动物后制得所述抗体。
[0012] 本发明中，所述检测弓形虫急性感染的抗体可以为本领域常规所指的抗体，如单 克隆抗体或多克隆抗体。所述检测弓形虫急性感染的抗体的制备方法可以为本领域常规的 制备方法，较佳地包括下述步骤：将前述弓形虫ELMO蛋白免疫注射动物，二次免疫后采集 血液分离含有所述抗体的血清。所述动物可以为本领域常规使用到的动物，较佳地为兔或 小鼠，更佳地为小鼠。所述免疫注射可以为本领域常规的注射方式，如直接将所述弓形虫 ELMO蛋白注射到动物体内，较佳地为将所述ELMO蛋白与弗氏佐剂一起注射到动物体内。所 述二次免疫的间隔时间较佳地为2周，所述采集血液较佳地为从动物的尾静脉采集血液。
[0013] 本发明技术方案之三：一种检测弓形虫急性感染的试剂盒，其包括前述ELMO蛋白 和/或前述检测弓形虫急性感染的抗体。
[0014] 本发明中，所述检测弓形虫急性感染的试剂盒较佳地还可以包括免疫反应封闭 液、免疫反应洗绦液、免疫反应终止液和偶联有显色反应酶的抗IgG的抗体。
[0015] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0016] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0017] 本发明的积极进步效果在于：本发明所提供的一种检测弓形虫急性感染的靶标 蛋白及其抗体，以及一种利用所述靶标蛋白及其抗体的检测弓形虫急性感染的方法能够有 效、快速地检测弓形虫早期急性感染，并具有较高的特异性和灵敏度。
【附图说明】
[0018] 图1、不同物种ELMO氨基酸序列的进化树分析表明。
[0019] 图2、弓形虫ELMO基因的RT-PCR结果。
[0020] 图3、弓形虫ELMO蛋白His?Bind柱纯化结果。1 :流穿液；2 :漂洗液；3和4 :洗 脱液。
[0021] 图4、弓形虫ELMO蛋白的组织定位。
【具体实施方式】
[0022] 下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述 的"室温"是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
[0023] 下述实施例中的实验材料、仪器和试剂的来源如下：
[0024] 实验动物与微生物：昆明小鼠和BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司； 比格犬购自上海新闪试验动物场；弓形虫RH株购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心；大 肠杆菌BL21(DE3)和大肠杆菌TOP10感受态细胞购自北京康为世纪生物科技有限公司。
[0025] 实验细胞与试剂：Vero细胞购自中科院上海生化与细胞研宄所；DMEM、胰酶购 自Gibco公司；BSA、弗氏佐剂购自Sigma公司；复合型蛋白酶抑制剂购自Merck公司； NormalMouseIgG、ProteinA琼脂糖微球、DAPI购自碧云天生物技术有限公司；Alexa Fluor488标记的驴抗鼠IgG购自Jackson公司；HisBandResin试剂盒购自默克公司； BCA蛋白定量试剂盒和二硫苏糖醇（DTT)购自Bio-Rad公司；总RNA反转录试剂盒购自 ThermoScientific公司；pMD19T质粒购自宝生物工程（大连）有限公司；pET28a质粒购 自Novagen公司；氨苄青霉素和卡那霉素购自生工生物工程股份有限公司；3, 3'，5, 5' -四 甲基联苯胺、多聚甲醛和Triton-X100购自国药集团化学试剂有限公司；引物由苏州金唯 智生物技术有限公司合成；DNA测序由宝生物工程（大连）有限公司进行。
[0026] 实验仪器：色谱柱RP-C18购自ColumnTechnologyInc.;色谱仪 Zorbax300SB_C18peptidetraps购自AgilentTechnologies,Wilmington,DE；QExactive 质谱仪购自ThermoFisherScientific;激光共聚焦显微镜NikoneclipseCl_Si购自尼 康（Nikon)公司。
[0027] 实施例1获得弓形虫ESA抗原并制备多抗
[0028] 1、ESA的制备
[0029]