专利名称：一种抗肿瘤生物多糖的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物提取领域，提取物质是一种来源于SPF鸡胚的多糖组分，具体的方法包括SPF鸡胚培养，收获，多糖物质的分离提取的全部过程，以及这种多糖物质的分析检测和用途。
背景技术：
肿瘤(Tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正 常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。2010年全球将有超过800万人死于癌症，取代心血管病成为世界死亡人数最多的疾病。因此，癌症治疗药物的研究关系到肝癌患者和全社会切身利益，一直是医药行业的研究热点，具有重要的社会意义。从治疗手段上来说，癌症的治疗主要是外科治疗、放射、化疗、生物与综合治疗等。癌症外科主要是癌切除、局部栓塞治疗等。切除和栓塞的治疗方法适用于界限清楚、远离大血管的肿瘤，而且手术切除的预后差、五年存活率低。移植需要解决的主要问题在于免疫排斥反应，后者往往成为患者和社会重大的经济负担，成功率也只有50%左右，5年存活率也很低。放疗和化疗对正常细胞也有杀伤作用，其特点是专一性差、副作用巨大，在杀伤肿瘤细胞的同时也极大地干扰机体的正常功能，不利于长期用药。正由于癌症缺乏有效控制方法，患者的预后极差。平均5年存活率低。因此，寻找肿瘤细胞特异性的药物是科学界始终关注的焦点。生物大分子包括核酸、蛋白质以及多糖。尤其是多糖，成为近些年研究的热点。目前，已经有包括香菇多糖、枸杞多糖、黄精多糖、大豆多糖被广泛的研究其在肿瘤治疗中的作用。并对其抗肿瘤机制进行了深入的研究和探讨。我们研制的鸡胚尿囊液和鸡胚提取的多糖属于免疫调节类产品。免疫调节是指在免疫反应中，各种免疫细胞及其亚群间，细胞与各种细胞因子间存在着的刺激与抑制，或正相与负相两方面作用构成的互相制约的调节网络，完成对抗原的识别和反应。这种调节作用对维护机体免疫功能的稳定和动态平衡十分重要。免疫调节共分成如下几类:免疫细胞间的调节作用。免疫反应过程涉及多种免疫细胞间的相互作用，如T-M，T-BTh-Ts和Ts-Tc等细胞间的相互作用，而其中Ts与Th在免疫调节中起关键作用。活化的Th细胞辅助B细胞产生抗体，辅助Tc细胞杀伤靶细胞，诱导M，表现迟发型超敏反应。而Ts细胞反过来对Th、Tc、B细胞和M的功能产生抑制作用。同样B细胞和M也可以通过多种机制对T细胞以及互相之间发挥促进和抑制的调节作用。细胞因子的免疫调节作用。在免疫反应中，免疫细胞的相互作用，除细胞间的直接接触外、免疫细胞释放的可溶性因子也参与免疫反应的调节。就目前所知，这些因子包括干扰素(interferon, IFN),白细胞介素-1 (interleukinl, IL-1),集落刺激因子(colonystimulating factor, CSF)等。这些细胞因子在介导机体多种免疫反应如肿瘤免疫、感染免疫、移植免疫、自身免疫等过程中发挥着重要的、甚至是中心的作用。它们各自具有多种生物学活性，彼此之间还在诱生、受体调节及生物效应等三个水平上相互作用，构成内容丰富、关系复杂的细胞因子网络(cytokine network)。免疫调节剂就是作用于免疫反应的不同环节，发挥其作用，使机体的免疫反应处于所需要的范围内，达到防治疾病的目的。肿瘤免疫治疗的方法有非特异性免疫治疗和特异性免疫治疗。过去，人们在肿瘤免疫研究中过于强调特异性抗原和特异性免疫系统，免疫学的进展加深了人们对免疫系统抗肿瘤功能及免疫治疗作用重要性的认识。近年的研究表明，非特异性免疫系统的重要性开始得到了认同。现在，人们认识到，与不能对自身组织产生良好免疫应答的特异性免疫系统形成鲜明对照的是，非特异性免疫系统具有很强的能力来消除单个畸变的自身细胞。这意味着非特异性免疫系统具有在单个细胞水平消除可能发展成为肿瘤细胞的早期遗传变异的潜能。迪威立克抗肿瘤作用主要是通过对单核巨噬细胞系统强大而持久的刺激，引起巨噬细胞(Μφ)增生、活化、吞噬功能增强、诱导分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL-2)、活性氧(H202、N0)等癌细胞杀伤因子及增强NK细胞杀伤活性，达到抑制和杀伤肿瘤细胞及病原微生物的目的，且可通过促进造血多能干细胞分化为单核巨噬细胞，进一步调动机体免疫系统蕴藏抗癌、杀菌潜力。由于免疫调节的全身作用强，副作用少且轻特异性强的特点，适用范围逐渐增加，安全性较其他类别的药物具备明显的提闻。首先，在作用机理上该药物激活体液免疫与细胞免疫，直接作用于癌细胞，具有特异性，这明显优于现有抗肿瘤药物。此外，大量的实验，包括临床前药效学试验和临床试验的结果证实，对于多种肿瘤具有良好的治疗作用。第三，生物提取法不但易于进行放大实现工业化，还有利于环境保护等工业化需要面对的严重问题，与化学合成相比优势明显。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有提取技术的不足，针对原有的提取技术-冻干、有机溶剂沉淀的繁琐步骤入手，对鸡胚尿囊液多糖和鸡胚多糖的分离纯化的手段的创新，使用盐析和膜技术相结合的方法来提取生物多糖。来大幅度提高鸡胚尿囊液和鸡胚多糖中具备生物活性 的多糖分离纯化后的纯度和回收率。本发明解决的技术问题所采用的技术方案是在纯化工艺中采用了盐析和膜技术的分离纯化步骤。包括步骤:a、SPF鸡胚的培养；b、活鸡胚尿囊液或鸡胚培养物低温预冷；
C、离心法和过滤法的使用对鸡胚尿囊液或鸡胚培养物进行澄清；d、盐析法沉淀生物大分子；e、超滤法(高分子量的超滤膜包)除高分子量的生物大分子；f、超滤法(低分子量的超滤膜包)截流活性多糖。本发明提取所述多糖的工艺的优选的工艺步骤如下:1.将SPF鸡胚在温度为36_38°C的恒温条件下培养9_13天。2.收获后的鸡胚灯检，标记尿囊腔的位置，在温度为4°C _18°C的环境下，放置8-48小时，然后提取活鸡胚的(死鸡胚颜色变黑，活鸡胚颜色发红)尿囊液或鸡胚培养物。3.将上一步得到的尿囊液或鸡胚培养物使用如下的纯化工艺提取:I)尿囊液或鸡胚培养物的澄清处理:使用IOmM IOOmM磷酸盐缓冲液稀释尿囊液或鸡胚培养物混合均匀，其中磷酸盐缓冲液与尿囊液或鸡胚培养物的体积比为2-10: l，8000g-12000g，18°C以下，离心10-60分钟，收集上清液，弃去沉淀;
2)上清液的进一步澄清处理:用0.22 μ m的微孔滤膜过滤上清液；3)向滤膜滤过的上清液中添加固体硫酸氨，其中上清:固体硫酸氨的质量比为5-20: I，混匀后放置于4°C _18°C储存，时间不低于6小时；4)8000g_12000g，18°C 以下，离心 10-60 分钟，取上清液；5)用10-30KD的超滤膜以0.1-0.5mol的NaCl对上清液进行超滤，取滤过液；6)用IKD的超滤膜进行过滤，取截流液，所得截流液即获得本发明所述的多糖。同原有的化学提取相比较，采用本专利的盐析和膜技术分离，目标多糖的回收率>80%，远高于步骤繁琐的化学法的不足10%的回收率，具有明显的优势。此外，在全部的纯化工艺中，没有使用有机溶剂，不存在生物危害性，更有利于环保。可见，采用本发明的纯化下艺，可以大幅度的提高鸡胚尿囊液中具备生物活性的多糖的回收率。本发明获得的多糖用于小鼠体内移植性人体肿瘤的杀伤能力试验，结果显示活性多糖对人类原发性肝癌，卵巢癌具有确切的杀伤能力。临床试验用于食管癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤、肺癌、非何杰金淋巴瘤、急性粒细胞白血病和乳腺癌等治疗，发现能够明显改善病人的生存质量，毒副作用小、有效率高等特点。
图1尿囊液提取的生物多糖的高效液相色谱分析结果，色谱柱为凝胶排阻色谱柱，检测器为视差折光检测器，结果显示提取的物质为单一组分；图2鸡胚培养物提取的生物多糖的高效液相色谱分析结果，色谱柱为凝胶排阻色谱柱，检测器为视差折光检测器，结果显示提取的物质为单一组分；
图3尿囊液提取的生物多糖的OD26tol检测结果；图4尿囊液提取的生物多糖的OD28tol检测结果；图5鸡胚培养物提取的生物多糖的OD26tol检测结果；图6鸡胚培养物提取的生物多糖的OD28tol检测结果；图7尿囊液提取的生物多糖紫外区和可见光区全波段扫描(扫描波长200nm-760nm)分析；图8鸡胚培养物提取的生物多糖紫外区和可见光区全波段扫描(扫描波长200nm-760nm)分析；图9尿囊液提取的生物多糖的核磁检测碳谱；图10尿囊液提取的生物多糖的核磁检测氢谱；图11鸡胚培养物提取的生物多糖的核磁检测碳谱；图12鸡胚培养物提取的生物多糖的核磁检测氢谱；
具体实施例方式通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。实施例1抗肿瘤生物多糖的制备本发明提取所述多糖的工艺的步骤如下:1.将SPF鸡胚在温度为36_38°C的恒温条件下培养9_13天。
2.收获后的鸡胚灯检，标记尿囊腔的位置，在温度为4°C的环境下，放置8小时，然后提取活鸡胚的(死鸡胚颜色变黑，活鸡胚颜色发红)尿囊液或鸡胚培养物。3.将上一步得到的尿囊液或鸡胚培养物使用如下的纯化工艺提取:I)尿囊液或鸡胚培养物的澄清处理:使用IOmM磷酸盐缓冲液稀释尿囊液或鸡胚培养物混合均匀，其中磷酸盐缓冲液与尿囊液或鸡胚培养物的体积比为2: l，8000g，18°C以下，离心60分钟，收集上清液，弃去沉淀；2)上清液的进一步澄清处理:用0.22 μ m的微孔滤膜过滤上清液；3)向滤膜滤过的上清液中添加固体硫酸氨，其中上清:固体硫酸氨的质量比为5: 1，混匀后放置于4°C-18°C储存，时间不低于6小时；4) 8000g, 18°C以下，离心60分钟，取上清液；5)用10-30KD的超滤膜以0.1mol的NaCl对上清液进行超滤，取滤过液；6)用IKD的超滤膜进行过滤 ，取截流液，所得截流液即获得本发明所述的多糖。实施例2抗肿瘤生物多糖的制备本发明提取所述多糖的工艺的步骤如下:1.将SPF鸡胚在温度为36_38°C的恒温条件下培养9_13天。2.收获后的鸡胚灯检，标记尿囊腔的位置，放置于4°C冰箱冷藏，放置12-16小时，然后提取活鸡胚的(死鸡胚颜色变黑，活鸡胚颜色发红)尿囊液或鸡胚培养物。3.将上一步得到的尿囊液或鸡胚培养物使用如下的纯化工艺提取:I)尿囊液或鸡胚培养物的澄清处理:使用20mM磷酸盐缓冲液稀释尿囊液或鸡胚培养物5倍，混合均匀，12000g, 4°C离心20分钟，收集上清液，弃去沉淀；2)上清液的进一步澄清处理:用0.22 μ m的微孔滤膜过滤上清液；3)向滤膜滤过的上清液中添加固体硫酸氨，其中上清:固体硫酸氨的质量比为10: 1，混匀后放置于4°C储存，时间不低于6小时；4) 12000g，4°C离心20分钟，取上清液；5)用30KD的超滤膜以0.1mol的NaCl对上清液进行超滤，取滤过液；6)用IKD的超滤膜进行过滤，取截流液，所得截流液即获得本发明所述的多糖。实施例3抗肿瘤生物多糖的制备本发明提取所述多糖的工艺的步骤如下:1.将SPF鸡胚在温度为36_38°C的恒温条件下培养9_13天。2.收获后的鸡胚灯检，标记尿囊腔的位置，在温度为4°C的环境下，放置48小时，然后提取活鸡胚的(死鸡胚颜色变黑，活鸡胚颜色发红)尿囊液或鸡胚培养物。3.将上一步得到的尿囊液或鸡胚培养物使用如下的纯化工艺提取:I)尿囊液或鸡胚培养物的澄清处理:使用IOOmM磷酸盐缓冲液稀释尿囊液或鸡胚培养物混合均匀，其中磷酸盐缓冲液与尿囊液或鸡胚培养物的体积比为10: l，12000g，18°c以下，离心10分钟，收集上清液，弃去沉淀；2)上清液的进一步澄清处理:用0.22 μ m的微孔滤膜过滤上清液；3)向滤膜滤过的上清液中添加固体硫酸氨，其中上清:固体硫酸氨的质量比为20: 1，混匀后放置于4°C-18°C储存，时间不低于6小时；4) 12000g, 18°C以下，离心10分钟，取上清液；
5)用10-30KD的超滤膜以0.5mol的NaCl对上清液进行超滤，取滤过液；6)用IKD的超滤膜进行过滤，取截流液，所得截流液即获得本发明所述的多糖。实施例4抗肿瘤多糖的检测分析方法1:双缩脲反应原理:双缩脲反应是指具有两个或两个以上肽键的化合物在碱性条件下与Cu2+反应，生成红紫色的络合物。所有的蛋白质均有此显色反应。双缩脲试剂就是指能与具有两个以上肽键的化合物发生红紫色显色反应的试剂。除-CONH-有此反应外，-C0NH2-, -CH2-，NH2-, -CS-CS-NH2，等基团亦有此反应。糖类物质的双缩脲反应为阴性。试剂双缩脲试剂。取硫酸铜(CuSO4.5H20) 3.0g、酒石酸钾钠(KNaC4H4O6.4Η20) 9.0g、碘化钾5.0g、氢氧化钠24g，加水溶解并稀释至1000ml，摇匀，即得。标准蛋白质溶液的制备精密量取人血白蛋白标准品适量，用水定量稀释成每Iml含50mg的溶液。供试品溶液的制备精密量取适量的供 试品，加水制成每Iml约含50mg的溶液。测定法分别精密量取供试品溶液与标准蛋白质溶液各0.05ml置玻璃试管中，分别加双缩脲试剂4.0ml，混匀，置37°C水浴中30分钟，照紫外-可见分光光度法(附录IIA)，在波长540nm处测定吸光度。另精密量取水0.05ml,自“加双缩脲试剂4.0ml”起，同法操作，作为空白对照。按下式计算
权利要求
1.一种抗肿瘤生物多糖的制备方法，包括以下步骤: I) SPF鸡胚的培养；2)活鸡胚尿囊液或鸡胚培养物低温预冷；3)对鸡胚尿囊液或鸡胚培养物进行澄清处理；4)澄清处理后的上清通过盐析法沉淀生物大分子；5)超滤法去除高分子量的生物大分子，得到含活性多糖的过滤液；6)低分子量的超滤膜截流活性多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的SPF鸡胚的培养，其条件为在温度为36-38 °C中鸡胚培养时间为9-13天。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的活鸡胚尿囊液或鸡胚培养物低温预冷，具体条件为收获后的鸡胚经过灯检，标记标记尿囊腔的位置，在温度为4°C -18°C的环境下，放置8-48小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的鸡胚尿囊液或鸡胚培养物进行澄清处理的具体条件为:使用IOmM IOOmM磷酸盐缓冲液稀释尿囊液或鸡胚培养物混合均匀，其中磷酸盐缓冲液与尿囊液或鸡胚培养物的体积比为2-10: l，8000g-12000g，18°C以下，离心10-60分钟，收集上清液，弃去沉淀，得到的上清液进一步用0.22 y m的微孔滤膜过滤。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的盐析法沉淀生物大分子，其具体条件为:向滤膜滤过的上清液中添加固体硫酸氨，上清和固体硫酸氨的体积比为5-20: 1，混匀后放置于4°C _18°C储存，时间不低于6小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超滤法去处高分子量的生物大分子，其具体条件为:8000g-12000g，18°C以下，离心10-60分钟，取上清液，用10-30KD的超滤膜以0.1-0.5mol的NaCl对上清液进行超滤，取滤过液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的低分子量的超滤膜截流活性多糖，具体条件为:用IKD的超滤膜过滤第5)步去除高分子量生物大分子的过滤液。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法制备的多糖。
9.权利要求8所述的多糖在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用。
10.权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤、肺癌、非何杰金淋巴瘤、急性粒细胞白血病和乳腺癌。
全文摘要
本发明公开了一种抗肿瘤生物多糖，所述多糖是通过从鸡胚尿囊液和鸡胚中分离纯化得到，本发明还公开了多糖的具体的纯化工艺，所述工艺是通过使用盐析和膜技术相结合的方法来提取生物多糖。本发明所述工艺大幅度提高了鸡胚尿囊液和鸡胚多糖分离纯化的纯度和回收率。本发明临床前药效学实验证明，所述生物多糖在裸鼠体内对移植性人体肿瘤-人类原发性肝癌，卵巢癌具有确切的杀伤能力，给以足够的剂量及时间可将裸鼠体内的移植性人体肿瘤细胞完全清除。本发明所述的多糖是一种无毒性、副作用小、十分安全的生物活性物质；并且给药途径广泛，生产工艺简单，回收率高，是一种可以产生巨大社会效益和经济效益的抗肿瘤新药。
文档编号A61P35/00GK103145867SQ20131009359
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月22日 优先权日2013年3月22日
发明者乔民, 金莲英 申请人:乔民, 金莲英