专利名称：Pa200和乙酰化介导核心组蛋白通过蛋白酶体降解的制作方法
技术领域：
本发明涉及PA200和乙酰化介导核心组蛋白通过蛋白酶体降解。
背景技术：
蛋白酶体催化细胞内绝大部分蛋白质的ATP和多泛素化依赖性降解，而且在脊椎动物体内还催化组织相容性复合体I类分子抗原肽的生成。26S蛋白酶体由两亚复合体组成，即20S催化颗粒和结合其一端或两端的调节颗粒。目前在哺乳动物中已经确定的20S核心颗粒主要有两种形式:组成型蛋白酶体和诱导型免疫蛋白酶体。前者含有三种催化亚基(β 、β 2和β 5)，而后者含三种与诱导紧密相关的亚基(β l1、3 2丨和35丨)。蛋白酶体主要的调节颗粒为19S复合体，它能够结合多泛素化的蛋白，使其去折叠后转移进入20S催化颗粒。另外还存在着其他的蛋白酶体活化因子，IlS复合体_ΡΑ28α/ΡΑ28β能够加快多肽形成促使抗原递呈，ΡΑ28 Y (为ΡΑ28α和ΡΑ28 β的类似物)能促使某些核蛋白的不依赖于泛素化的降解。最新发现的一种蛋白酶体活化因子为ΡΑ200，其酵母同源物为BlmlO，在体外能够激活小分子多肽和结构不 完整的Tau蛋白的降解。哺乳动物所有组织都含有PA200，但是在睾丸中高表达。PA200敲除导致雄性小鼠精子发生过程严重缺陷从而明显降低了其生殖能力，但其机理还不清楚。核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成的八聚体由DNA包裹在核小体中，而连接组蛋白Hl保护核小体间DNA。每一个八聚体都由两个H2A-H2B 二聚体和一个H3-H4四聚体组成。核小体是染色质结构的组成单位，在许多细胞活动中起到重要作用，包括基因表达的表观遗传调控、细胞分裂、分化和DNA损伤应答等。在精子发生过程中，减数分裂后细胞的大部分组蛋白先暂时性由转型蛋白(transition nuclear protein, TP蛋白)替换,最终被精蛋白取代。体细胞中的组蛋白在基因活性区或者启动子区域也会被替换。上述组蛋白替换的潜在机制还不清楚。赖氨酸乙酰化广泛参与各项细胞活动,特别是染色质重塑、DNA修复和转录。它不仅通过阻碍或者促进某些底物的多泛素化来影响蛋白酶体降解通路，还影响特定蛋白质通过溶酶体通路的降解。组蛋白乙酰化转移酶(HAT)催化乙酰化赖氨酸的形成，蛋白质中这一修饰能够被溴区结构域(BRD)所识别，而组蛋白去乙酰化酶(HDAC)则起到了去除这一基团的作用。在精子发生过程中组蛋白被清除之前是被高度乙酰化的。组蛋白乙酰化与打开和激活转录常染色质区域有关，并致使DNA双链断裂处染色质松散。尽管组蛋白乙酰化位点和乙酰化酶或去乙酰化酶受到广泛的研究，但乙酰化如何调控转录、精子发生和DNA修复仍不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供了新的组蛋白降解通路，即PA200和乙酰化介导核心组蛋白通过蛋白酶体降解。本发明还提供了一种新型组织特异性蛋白酶体，即生精蛋白酶体。本发明提供了 PA200蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(I)至(4)中的至少一种:(I)结合乙酰化蛋白质(可为乙酰化组蛋白，具体可为乙酰化核心组蛋白，更具体可为乙酰化组蛋白H2B或乙酰化组蛋白H4，更具体可为H2BK5ac或H4K16ac) ;(2)促进乙酰化蛋白质(可为乙酰化组蛋白，具体可为乙酰化核心组蛋白，更具体可为乙酰化组蛋白H2B或乙酰化组蛋白H4，更具体可为H2BK5ac或H4K16ac)降解；(3)参与体细胞DNA损伤修复(具体为识别DNA损伤处的乙酰化组蛋白并促进乙酰化组蛋白被蛋白酶体降解，所述DNA损伤具体可为射线照射引起的DNA损伤和/或药物引起的DNA损伤；所述射线具体可为6tlCo Y -射线；所述药物具体可为^S) ； (4)参与精子形成。所述PA200蛋白具体可为如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质。本发明还提供了 PA200蛋白的BRD类似域在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(5)和/或(6): (5)结合乙酰化蛋白质(可为乙酰化组蛋白，具体可为乙酰化核心组蛋白，更具体可为乙酰化组蛋白H2B或乙酰化组蛋白H4，更具体可为H2BK5ac或H4K16ac);
(6)促进乙酰化蛋白质(可为乙酰化组蛋白，具体可为乙酰化核心组蛋白，具体可为乙酰化组蛋白H2B或乙酰化组蛋白H4，更具体可为H2BK5ac或H4K16ac)降解；所述PA200蛋白的BRD类似域为所述PA200蛋白自N末端第1650-1738位氨基酸残基组成的多肽。所述PA200蛋白的BRD类似域还可以被替换为PA200-BRD-GST融合蛋白(即PA200蛋白自N末端第1650-1738位氨基酸残基组成的多肽的C端与谷胱甘肽S转移酶的N端融合得到的融合蛋白)。本发明还保护PA2 00蛋白在促进精细胞中组蛋白(具体可为核心组蛋白，如H2B和/或H3和/或H2A)积累中的应用或PA200蛋白在抑制精细胞中组蛋白(具体可为核心组蛋白，如H2B和/或H3和/或H2A)降解中的应用。本发明还保护a 4s亚基，为如下(C)或(d):(c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且在精细胞或精子中特异表达的由序列4衍生的蛋白质。本发明还保护哺乳动物的生精蛋白酶体，由20S核心复合物、19S调节复合物和PA200调节颗粒组成；所述20S核心复合物中存在所述a 4s亚基。所述哺乳动物可为牛、人、小鼠、大鼠或兔子。所述生精蛋白酶体为精子发生过程中主要的蛋白酶体形式。所述20S核心复合物中还存在免疫蛋白酶体的3个β催化亚基(β 、β2 和β5 )。所述生精蛋白酶体存在两种形式:大的生精蛋白酶体和小的生精蛋白酶体。大的生精蛋白酶体由35 种蛋白(包括 α 1-α 7、a 4s、β 1-β 7、Rptl_Rpt6、Rpnl-3、Rpn5_13、UCH37 和 PA200)形成的48个亚基组成。小的生精蛋白酶体由19种蛋白(包括α1-α7、α48、β1-β7、β1 、β 21、β 5i和PA200)形成的29个亚基组成。本发明还保护所述生精蛋白酶体在制备产品中的应用；所述产品的功能为降解乙酰化的蛋白质(所述蛋白质为组蛋白，具体可为核心组蛋白)。本发明还保护抑制PA200蛋白的表达的物质，或抑制PA200蛋白的活性的物质，或抑制生精蛋白酶体和乙酰化蛋白质结合的物质，在制备产品中的应用；所述产品为如下①或②或③或④或⑤:①男性避孕药；②促进睾丸中细胞的凋亡的产品；③抗睾丸肿瘤的药物！④促进精细胞中组蛋白(具体可为核心组蛋白，如H2B和/或H3和/或H2A)积累的产品抑制精细胞中组蛋白(具体可为核心组蛋白，如H2B和/或H3和/或H2A)降解的产品.本发明还保护一种男性避孕药，其活性成分为抑制PA200蛋白的表达的物质，或抑制PA200蛋白的活性的物质，或抑制生精蛋白酶体和乙酰化蛋白质结合的物质。所述乙酰化蛋白质可为乙酰化组蛋白，具体可为乙酰化核心组蛋白，更具体可为乙酰化组蛋白H2B或乙酰化组蛋白H4，更具体可为H2BK5ac或H4K16ac。本发明还保护去乙酰化酶抑制剂在制备促进组蛋白降解的产品中的应用。所述去乙酰化酶抑制剂具体可为TSA。所述组蛋白可为核心组蛋白，具体可为H2B和/或H4。本发明还保护去乙酰化酶抑制剂和发生引起DNA双链断裂的射线的仪器在制备抗肿瘤产品中的应用。所述去乙酰化酶抑制剂具体可为TSA。本发明还保护去乙酰化酶抑制剂和引起DNA双链断裂的药物在制备抗肿瘤产品中的应用。所述去乙酰化酶抑制剂具体可为TSA。所述引起DNA双链断裂的药物具体可为MMS。本发明发现了一种特异形式的蛋白酶体，它包含PA200/Blml0，能特异性催化核心组蛋白的多泛素非依赖性降解。在体细胞DNA损伤应答和精子发生过程中，PA200/Blml0通过其非典型性的BRD结构域结合核心组蛋白的乙酰化赖氨酸残基从而促使其降解。在哺乳动物睾丸中，大多数蛋白酶体均为以前未见报道的特殊蛋白酶体，将之命名为生精蛋白酶体(Spermatoproteasomes)。除了 PA200外，生精蛋白酶体还含有精细胞和精子特异的α亚基，将其命名为 a 4s(Spermatid/sperm specific a 4-like subunit)。同时生精蛋白酶体还含有免疫蛋白酶体中具催化活性的β亚基。本发明发现去乙酰化酶抑制剂和可引起DNA双链断裂的放射或化学药物共同处理细胞，会诱导体细胞的核心组蛋白降解。进一步发现ΡΑ200基因的敲除能阻滞小鼠体细胞DNA双链断裂损伤过程中依赖于乙酰化的核心组蛋白降解，并延迟长形精细胞中核心组蛋白的适时清除。纯化的ΡΑ200明显地加快了乙酰化的核心组蛋白通过不依赖于ATP的体外蛋白酶体降解，而对多泛素化的蛋白质降解没有影响。ΡΑ200及其酵母同源物BlmlO含有能特异识别赖氨酸乙酰化位点的类似于溴区结构域(Bromodomain)的新型结构域(溴区结构类似域，Bromodomain-1ike region)。可能在其它翻译后修饰的辅助下，PA200和BlmlO通过该非典型溴区结构域结合乙酰化的核心组蛋白，并促进核心组蛋白降解。以上发现表明PA200/Blml0特异性识别并促使核心组蛋白通过乙酰化介导的蛋白酶体降解，从而揭示了乙酰化调控组蛋白降解、DNA修复和精子发生的作用机理。根据本发明的一实施方案，发现PA200是精子发生过程中核心组蛋白程序性降解的关键。组蛋白的修饰模式被建议为“组蛋白密码”，用于基因表达的表观遗传调控，本发明阐述了在精子发生和体细胞DNA损伤应答过程中核心组蛋白降解的通路。哺乳动物中，大的睾丸特异性蛋白酶体(Lg)出人意料地拥有了免疫蛋白酶体特异的催化亚基βΠ、β2 和/或β 5i以及PA200。这些蛋白酶体在非变性胶中迁移的速率要慢于19S-20S和20S，但快于19S-20S-19S。因为免疫蛋白酶体特异的催化亚基是伴随着PA200 —起迁移的，所以在spermatoproteasome中检测到的这些免疫蛋白酶体亚基不单单是因为有典型的免疫蛋白酶体存在。尽管少量的PA200-20S和PA200-20S-19S复合物也存在在肌肉中，但a 4s和“免疫”亚基却没存在于肌肉中。所以蛋白酶体显示出的睾丸特异性是因其有一个或两个PA200在调节颗粒和0 1丨、02丨、05丨、048在205颗粒中。在睾丸中这些变换的20S亚基的功能意义还不清楚。不同于其他可变换的20S亚基，a4s是处在外α-环上，所以缺乏催化活性，但可能优先与调节颗粒结合，如ΡΑ200。正是这种独一无二的特征可用于开发针对于某些睾丸肿瘤或甚至是男性避孕的药物，这些药物通过阻断对精子发生过程起关键作用的蛋白酶体活性来特异性靶定于精子发生。过剩的组蛋白会阻断转录，从而增强了 DNA损伤的敏感性并导致染色体凝集或丢失。在ΡΑ200敲除小鼠中长形精细胞的核心组蛋白清除被延迟也导致了核心组蛋白的聚集而且诱导了其凋亡。所以，本发现可解释为什么小鼠ΡΑ200基因敲除会产生不正常的精细胞或精子从而导致雄性小鼠的生育能力急剧降低。根据本发明的另一实施方案，发现乙酰化和ΡΑ200介导核心组蛋白通过不依赖于多泛素化的蛋白酶体通路降解。酵母中核心组蛋白在DNA双链断裂处附近会被去除，而在DNA修复时ΡΑ200会聚集在染色质上。本发明显示在酵母和哺乳动物体细胞DNA损伤应答中提升乙酰化水平(通过添加HDAC抑制剂)可促进核心组蛋白的去除。而且，这个进程是依赖于PA200/Blml0。本发明还描述了 PA200/Blml0通过其非典型BRD结构域在DNA双链断裂处能特异性结合乙酰化的组蛋白，纯化的PA200能直接激活20S颗粒降解乙酰化的核心组蛋白。而在同样条件下对泛素化的蛋白质降解没有作用。许多HDAC的抑制剂作为抗癌药物正处在临床试验研究中，特别是与其它治疗方法，如化疗和放疗，一起使用。本发明描述了 HDAC抑制剂促进了由辐射或DNA损伤药物丽S诱导的乙酰化介导的组蛋白降解，而这一降解途径能被蛋白酶体抑制剂(MG132)所阻断。HDAC抑制剂同时也增强了细胞对DNA损伤的敏感性，促进细胞死亡。这提供了其在临床中运用的机制。根据本发明的另一实施方案，发现赖氨酸残基上的乙酰化也可作为蛋白酶体降解的信号。组蛋白乙酰化在基因表达 的表观调控上起决定性作用。几乎所有已知的能识别赖氨酸乙酰化残基的BRDs，都有适度的序列同源性。尽管PA200/Blml0的非典型BRD结构域结构上像BRD，但是它们却与已知的BRDs基本上没有任何序列同源性。本发明对于鉴定其它新的、有非典型的BRDs、能结合乙酰化赖氨酸的蛋白很重要。由于PA200/Blml0能识别赖氨酸乙酰化修饰，其它乙酰化的非组蛋白的蛋白质也可能通过PA200介导降解。根据本发明，总结精子发生和体细胞DNA修复过程中核心组蛋白降解模型。在精子发生过程中，减数分裂后的精细胞中核心组蛋白经历了 I)乙酰化及其它仍待鉴定的翻译后修饰，2)后被PA200/Blml0的非典型BRD结构域识别，3)再由生精蛋白酶体降解，4) TP蛋白临时取代，而TP蛋白最终被精蛋白替换。当DNA双链断裂时，体细胞中DNA损伤位点附近的核心组蛋白也被乙酰化后由含PA200/Blml0的蛋白酶体降解，以至于DNA修复蛋白能够到达损伤区域。另外，在体内可能还需要其它或翻译后修饰与乙酰化一起促使组蛋白降解。本发明开创了一个研究乙酰化介导的、通过PA200/Blml0蛋白酶体降解蛋白质及其调控DNA修复、基因调控和精子发生等众多细胞活动的全新领域，涉及组蛋白乙酰化修饰、蛋白质降解、基因表达的表观遗传调控及男性生殖领域，将有利于癌症和男性不育症等相关疾病的治疗及男性避孕药物的开发。本发明在如下四个方面取得了突破:
(I)发现乙酰化调控组蛋白降解、精子发生和DNA修复的机制。组蛋白乙酰化是组蛋白修饰的一种主要类型，它可以调控许多极为重要的细胞活动，如基因表达的表观遗传调控、DNA修复和精子发生。然而，乙酰化调控这些重要过程的机理仍不清楚。该发明发现PA200/Blml0的非典型BRD结构域可以识别乙酰化核心组蛋白(其它的翻译后修饰可能辅助这种结合)并促使其通过蛋白酶体降解，揭示了乙酰化在组蛋白降解、精子发生和DNA修复中的作用机制。(2)揭示乙酰化，而非泛素化，介导组蛋白通过PA200/Blml0蛋白酶体降解。蛋白酶体催化ATP和多聚泛素化依赖的细胞内多数蛋白的降解。为阐明组蛋白降解机制，人们一直试图通过寻找催化组蛋白多聚泛素化的酶，但是迄今为止并没有发现这样的酶。本发明发现PA200/Blml0蛋白酶体催化乙酰化而非多聚泛素化依赖的核心组蛋白降解。除组蛋白以外，其它蛋白质也可以被乙酰化修饰。因而，PA200/Blml0蛋白酶体也可能催化其它乙酰化蛋白质降解。已知典型的26S蛋白酶体抑制剂万河(Velcade)已用于治疗多发性骨髓癌，PA200/Blml0蛋白酶体及乙酰化通路的调控也有可能成为相关疾病治疗的一种手段。(3)发现新型含PA200的睾丸特异蛋白酶体(生精蛋白酶体)，并揭示核心组蛋白作为这些蛋白酶体的第一类生理底物。发现多数哺乳动物睾丸中的蛋白酶体(“生精蛋白酶体”)除了包含PA200外，还包含一个精细胞/精子特异的α亚基a 4s/PSMA8及免疫蛋白酶体的β催化亚基。作为蛋白酶体激活物的PA200/Blml0对体细胞DNA损伤和精子发生过程中核心组蛋白的及时清除是必不可少的。本发明发现了 PA200/Blml0的非典型BRD结构域可识别核心组蛋白中乙酰化的赖氨酸残基。这些发现可能会对于开发特异的抗肿瘤药物甚至男性避孕药物起到重要作用。(4)揭示组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂促进由DNA双链断裂诱导的、由乙酰化介导的组蛋白降解，增强细胞对DNA损伤的敏感性，容易弓I起细胞死亡。大量的组蛋白去乙酰化酶抑制剂作为抗肿瘤药物正在临床实验中，尤其是将它们与化疗或放疗结合。本发明发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进辐射或DNA损伤试剂MMS诱导的、乙酰化介导的组蛋白降解，为它们的临床应用提供了机制。
图1为PA200和H2BK5ac的共定位的结果。图2为PA200和H4K16ac的共定位的结果。图3为Y -电离辐射使PA200被招募至DNA损伤位点的结果。图4为PA200/Blml0识别乙酰化的结构域的结果。图5为各个融合蛋白与乙酰化组蛋白的结合能力的结果。图6为PA200-BRD-GST融合蛋白与乙酰化组蛋白的结合能力的结果。图7为哺乳动物睾丸中两种不同类型的蛋白酶体鉴定的结果。图8为生精蛋白酶体中的特有亚基和活性的结果。图9为小鼠PA200的敲除减缓了长形精细胞中核心组蛋白的降解的结果。图10为含PA200/Blml0的蛋白酶体选择性降 解乙酰化的核心组蛋白。图11为体细胞DNA损伤时PA200/Blml0是核心组蛋白乙酰化相关降解必需的的结果。
图12为模式图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。PA200蛋白的氨基酸序列如序列表的序列I所示，PA200基因的核苷酸序列如序列表的序列2所示。谷胱甘肽S转移酶的氨基酸序列如序列表的序列3所示。His标签的氨基酸序列为“HHHHHH”。a 4s蛋白的氨基酸序列如序列表的序列4所示。α 4蛋白的氨基酸序列如序列表的序列 5 所示。Gcn5 蛋白如 GENBANK ACCESSION N0.NP_011768.1 (linearPLN25-FEB-2013，G1:6321691)所示。组蛋白 H4 如 GENBANK ACCESSION N0.NP_778224.1(linear PRI24-MAR-2013, G1:28173560)所示。TIP60 蛋白如 GENBANK ACCESSIONN0.NP_874369 (linear PRI10-FEB-2013, G1:36287069)所示。RNF5 蛋白如 ACCESSIONN0.NP_008844.1 (linear PRI18-MAR-2013，G1:5902054)所示。Flag 标签的氨基酸序列为“DYKDDDDK”。实施例中的大鼠均为Wistar大鼠，均购自中国医学科学院实验动物中心(中国北京)。C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠，均购自中国医学科学院实验动物中心(中国北京)。实施例中所用的牛组织和兔组织均获自福成屠宰场(中国河北),动物屠宰后，立即剥离组织，浸没在液氮中，_8 0°C保存至使用。C0S-7细胞(非洲绿猴肾细胞)=ATCC,货号CRL-1651。大肠杆菌DH5 α:Invitrogen,货号为 4526。大肠杆菌 BL21:1nvitrogen,货号为 57672。pcDNA_6B 载体:1nvitrogen,货号为 524354661-41-2载体:Invitrogen,货号为 SASASZt5PET-ZSaG)载体:Invitrogen,货号为 235256。pET3a 载体:Novagen,货号 69418-3。p3XFlag 载体:Sigma,货号 E7908。293T 细胞(又称 HEK-293 细胞):ATCC，货号 CRL-1573。兔源PA200 抗体:Boston Biochem,货号为 AP124。小鼠源 HA 抗体:Santa Cruze,货号为SC-7392。兔源H4K16ac抗体(H4K16ac代表K16位点被乙酰化的组蛋白H4):Millipore,货号为07-329。小鼠源Y-H2AX抗体(Y-H2AX代表磷酸化的组蛋白H2AX):Millipore，货号为05-636。赖氨酸乙酰化抗体:Cell Signalling，货号为9441L。β 抗体、β Ii抗体、β 2抗体、β 2i抗体、β 5抗体、β 5i抗体、PA28 α抗体、ΡΑ200抗体、Rpt4抗体、Rpn7抗体均购自BioMol。GAPDH抗体购自Santa Cruz Biotechnologies。抗泛素抗体:Zymed，货号为 13-1600。Hl 抗体:Abcam，货号为 ab62884。H2A抗体:Abcam，货号为 abl8255。H4 抗体:Abcam，货号为 ab05-858。H2B 抗体:abcam，货号为 abl790。α 2 抗体:BioMol，货号 PW8105。ΡΑ28β 抗体:BioMol,货号 PW8240。PA28 Y 抗体:BioMol,货号 PW8190。H3 抗体:Abcam,货号为 abl791。蛋白酶体抑制剂MG132:Boston Biochem，货号为1-130。曲古抑菌素A(英文缩写为TSA，是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂):sigma，货号为T1952。甲基磺酸甲酯(丽S，引起DNA双链断裂的药物):sigma，货号为129925。GSH-珠子:GE，货号为17-0756-01。荧光多妝底物(succinyl LLVY-7-amino-4-methylcoumarin):Boston Biochem,货号为 S-280。
大鼠抗a4s抗体:用带His标签的a 4s片段免疫大鼠并收集血清；带His标签的a4s片段为a4s片段的C端与His标签的N端融合得到的融合蛋白；a 4s片段为a 4s蛋白自N末端第221-250位氨基酸残基；表达融合蛋白采用的出发载体为pET-28a(+)载体，外源DNA插入出发载体的EcoRI和NotI酶切位点之间，宿主菌为大肠杆菌BL21。大鼠抗α 4抗体:用带His标签的α 4片段免疫大鼠并收集血清；带His标签的α4片段为α 4片段的C端与His标签的N端融合得到的融合蛋白；α 4片段为α4蛋白自N末端第219-248位氨基酸残基；表达融合蛋白采用的出发载体为pET-28a(+)载体，外源DNA插入出发载体的EcoRI和NotI酶切位点之间，宿主菌为大肠杆菌BL21。PA200 敲除小鼠:Graduate School of Life and EnvironmentalSciences,University of Tsukubaj l-l—lTennodai，TsukubajIbaraki 305—8577，Japan ；PA200敲除小鼠是以C57BL/6小鼠为出发动物，通过基因打靶技术构建的，PA200/PSME4基因的外显子25和26编码三种推定的PA200亚型的保守域，基因组上的这一区域基因被含链霉素抗性的基因盒所取代。MEF细胞:Graduate School of Life and Environmental Sciences, Universityof Tsukuba, l-l-lTennodai, Tsukuba, Ibaraki305-8577, Japan ；MEF 细胞是从 C57BL/6 小鼠胚胎中分离得到的胚胎纤维细胞。Mut 细胞(敲除 PA200 基因的 MEF 细胞):Graduate School of Life andEnvironmental Sciences, University of Tsukuba, 1-1-lTennodai, Tsukuba, Ibaraki305-8577，Japan ；MEF细胞是从PA200敲除小鼠胚胎中分离得到的胚胎纤维细胞。从动物组织提取纯化蛋白酶体的方法参见:Xiao_Bo Qiu, Song-YingOuyang,Chao-Jun Li, Shiying Miao, Linfang Wang and Alfred L Goldberg.hRpnl3/ADRMl/GPllOis a novel proteasome subunit that binds the deubiquitinatingenzyme, UCH37.Embo J, 2006; 25 (24):5742-5753.。从动物组织提取纯化组蛋白的方法参见:David Shechter et.al Nature protocol.2007。实施例中涉及的各个蛋白、多肽或亚基的序列见表I。表I实施例中涉及的各个蛋白、多肽或亚基的序列
权利要求
1.PA200蛋白在制备广品中的应用；所述广品的功能为如下(I)至(4)中的至少一种: (1)结合乙酰化蛋白质； (2)促进乙酰化蛋白质降解； (3)参与体细胞DNA损伤修复； (4)参与精子形成。
2.PA200蛋白的BRD类似域在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(5)和/或(6): (5)结合乙酰化蛋白质； (6)促进乙酰化蛋白质降解； 所述PA200的BRD类似域为PA200蛋白自N末端第1650-1738位氨基酸残基组成的多肽。
3.PA200蛋白在促进精细胞中组蛋白积累中的应用或PA200蛋白在抑制精细胞中组蛋白降解中的应用。
4.a 4s亚基,为如下(C)或(d): (C)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质； Cd)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且在精细胞或精子中特异表达的由序列4衍生的蛋白质。
5.哺乳动物的生精蛋白酶体，由20S核心复合物、19S调节复合物和PA200调节颗粒组成；所述20S核心复合物中存在权利要求4所述的a 4s亚基。
6.权利要求5所述生精蛋白酶体在制备产品中的应用；所述产品的功能为降解乙酰化的蛋白质。
7.抑制PA200蛋白的表达的物质，或抑制PA200蛋白的活性的物质，或抑制生精蛋白酶体和乙酰化蛋白质结合的物质，在制备产品中的应用；所述产品为如下①或②或③或④或⑤: ①男性避孕药； ②促进睾丸中细胞的凋亡的产品； ③抗睾丸肿瘤的药物； ④促进精细胞中组蛋白积累的广品； ⑤抑制精细胞中组蛋白降解的产品。
8.一种男性避孕药，其活性成分为抑制PA200蛋白的表达的物质，或抑制PA200蛋白的活性的物质，或抑制生精蛋白酶体和乙酰化蛋白质结合的物质。
9.去乙酰化酶抑制剂在制备促进组蛋白降解的产品中的应用。
10.去乙酰化酶抑制剂和发生引起DNA双链断裂的射线的仪器在制备抗肿瘤产品中的应用，或去乙酰化酶抑制剂和引起DNA双链断裂的药物在制备抗肿瘤产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了PA200蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(1)至(4)中的至少一种(1)结合乙酰化蛋白质；(2)促进乙酰化蛋白质降解；(3)参与体细胞DNA损伤修复；(4)参与精子形成。本发明在如下四个方面取得了突破(1)发现乙酰化调控组蛋白降解、精子发生和DNA修复的机制。(2)揭示乙酰化，而非泛素化，介导组蛋白通过PA200/Blm10蛋白酶体降解。(3)发现新型含PA200，α4s的睾丸特异蛋白酶体，并揭示核心组蛋白作为这些蛋白酶体的第一类生理底物。(4)揭示组蛋白去乙酰化酶抑制剂促进由DNA双链断裂诱导的、由乙酰化介导的组蛋白降解，增强细胞对DNA损伤的敏感性，容易引起细胞死亡。
文档编号A61P15/08GK103191412SQ20131011039
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月1日 优先权日2013年4月1日
发明者邱小波, 钱民先, 逄也, 刘翠华, 王广菲, 朱倩倩, 张晓旭, 刘珊 申请人:北京师范大学