专利名称：毛蚶中抗肿瘤活性多肽组分的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明公开了·一种从海洋生物毛蚶中经过一系列提取、分离、层析纯化等步骤得到强抗肿瘤活性组分的制备分离方法及该组分对一些肿瘤细胞株的药理活性的测试。本发明属于医药技术领域。
背景技术：
毛蚶属于软体动物门，瓣鳃纲，列齿目，蚶科。分布于中国、朝鲜和日本沿海，以中国渤海和东海近海较多。毛蚶资源丰富，营养价值高，富含维生素B12，其壳及肉已具有很久的入药历史，如其贝壳作为中药瓦楞子入药。经文献检索发现，人们对毛蚶的研究主要集中在多糖成分的分离及其抗氧化或免疫活性方面的研究，以及对所含糖蛋白其抗菌活性的研究。虽对其所含蛋白多肽抗肿瘤方面的也有零星报道，如:中国专利申请号98110478.9公开了 “一种能抗癌的海洋生物提取物”技术，所用的方法过于简单，得到的物质复杂而且无法进行定量，因其本身的局限性不利于药物的开发与利用；而中国专利申请号2005100043797.4公开了一种“一种毛蚶抗癌肽类提取物及其制备方法”和200610043222.7公开了一种“从毛蚶中提取小分子活性多肽的方法”，这两个专利主要仅对于毛蚶中分子量3千以下的小分子多肽进行了提取及活性研究，还有中国专利申请号200510043846.4公开了 “一种毛蚶糖肽类提取物及其制备方法”，其是针对毛蚶中分子量IOOOODa以下的糖肽类混合物。但上述专利对毛蚶活性物质的研究范围过窄，及未见对其体外抗肿瘤细胞活性方面的报道。
发明内容
本发明鉴于以上所述现有技术的不足及缺点，致力于发明一种简单有效的提取分离并同时伴随活性测试的方法，从海洋生物毛蚶中制备得到一种具有活性组分纯度高、有效成分较明确的高效抗肿瘤活性的多肽组分，其样品具有溶解性好、稳定性好、毒副作用小等优点。本发明与已有技术相比具有很多技术进步:1、本发明通过使用缓冲液混合后的匀浆技术和采用超声等方法从毛蚶中提取活性物质，能够使有效成分充分溶解于提取液中，同时也缩短了提取时间。2、本发明先经过硫酸铵沉淀法对提取物进行了初步的分离，此分离方法使用范围广，价格低廉，可一步除去大量无活性的杂质，起到了很好的分离除杂作用。3、本发明采用离子交换层析与其它专利中使用的凝胶柱的分离方法相比较，离子交换方法具有处理样品量大、方法简单、重复性好的优点。4、本发明在多肽蛋白的每个分离环节都使用MTT法对活性进行跟踪，具有效率高且能够准确的确定最佳活性部分的优点。5、本发明使用电泳等一些生物技术方法对其最终组分做了进一步的鉴定，明确了其主要含有的成分及一些相关的性质。
本发明的制备步骤如下:将新鲜毛蚶剥壳、取出内容物、清洗、加入缓冲液、匀浆、提取、离心、取上清液、硫酸铵分级沉淀、透析、干燥、采用柱层析分离、分别收集活性峰、冷冻干燥浓缩、透析脱盐、冷冻干燥，得到一组分子量范围在10.0 27.0kDa的抗肿瘤活性高的多肽组分。本发明制备的活性组分是通过天然提取的方法得到的物质，制备过程中一直都在水溶液中进行，未掺杂有机毒害物质及其它污染物，整个制备过程环保、卫生，并通过采用MTT法对肿瘤细胞株进行筛选，发现其对多种肿瘤细胞株的增殖生长都具有较强的抑制作用，在体外最高抑制率达到90%以上，能够适用于医疗用途。
:图1为实例I中通过盐析后中间活性组分I的电泳图谱，M表示所使用的蛋白标准品，其分子量分布为 14.4kDa、20kDa、26kDa、35kDa、45kDa、66.2kDa 和 94kDa。图2为实例I中通过经离子交换柱层析后的目的组分II的电泳图谱，M表示所使用的蛋白标准品，其分子量分布为 14.4kDa、20kDa、26kDa、35kDa、45kDa、66.2kDa 和 94kDa。具体实施实例:下面结合实施例对发明作进一步的描述。实例1:取毛蚶剥壳、取其内容物，用低温蒸馏水清洗三次，控干后称取150g，以固液比I: 3加入提取缓冲液(pH = 8.0,0.03M，磷酸钠缓冲液)，采用高速组织捣碎机，以8000rpm间隔匀浆3min至细腻无块状，将匀浆液置于低频超声仪中超声提取40min，使用低温高速离心机，10000rpm， 4°C，离心30min去渣，取上清液分步盐析沉淀，将量体积后的上清液置于冰浴的环境下加入70%饱和度的硫酸铵后，继续搅拌一段时间后，高速离心除去沉淀取上清液，再按照上清液的体积加到100%饱和度的硫酸铵进行盐析，再继续搅拌一段时间后，IOOOOrpm, 4°C，离心30min，收集沉淀。将沉淀用少量提取液溶解后置于3000Da透析袋中透析24h，每间隔6h更换外围蒸馏水。将透析脱盐后的中间活性组分I使用离子交换层析方法进一步分离纯化，阴离子交换剂为DEAE-Sepharose Fast Flow,用pH为8.0的0.030M的Tris-HCl缓冲液作为初始缓冲液，通过增加氯化钠的浓度进行阶段洗脱，在A28tl收集收集活性峰，透析脱盐、冷冻干燥得到多肽物质II，即是目的高抗肿瘤活性的多肽组分。取组分I和组分II通过使用SDS-PAGE凝胶电泳观测其在各个分离步骤中得到组分的蛋白分布情况，从电泳图谱中看到组分I有多条明显的条带，分子量分布广，而经离子交换柱层析后的目的组分II只含有一条明显条带，说明它含一种主要成分及几个微量成分，其分子量范围为10.0 27.0kDa0实例2:在整个实验中采用MTT法对提取过程中的组分进行活性跟踪检测。将处于对数生长期的肿瘤细胞(贴壁细胞需用胰酶消化)，用完全培养基吹打成细胞悬液，调整细胞浓度为4X IO3个/ml。将细胞悬液接种于96孔细胞培养板上，每孔100μ 1，在37°C、5% C02、100%相对湿度的培养箱中培养24h。之后将板内的培养液吸出，将以培养液稀释成不同浓度的样品加入96孔板中，设置四个样品浓度组，每个浓度设3个平行孔，以不加样品的培养液孔为阴性对照组，置于CO2培养箱中培养48h。吸去液体后于每孔加入20 μ I MTT, 5h后将其倒出并于每孔加入终止液DMS0100 μ 1，室温放置30min。在酶标仪上以570nm处测OD值。以顺钼为阳性对照。使用药理学方法计算出IC50值。通过盐析中间组分I其活性结果如表1:表1.组分I活性结果
权利要求
1.一种毛蚶中抗肿瘤活性多肽组分的制备方法和用途，其特征是将新鲜毛蚶剥壳、取出内容物、清洗、加入缓冲液、匀浆、提取、离心、取上清液、硫酸铵分级沉淀、透析、干燥、采用离子交换层析、分别收集活性峰、冷冻干燥浓缩、透析脱盐、冷冻干燥，得到分子量范围为10. O 27. OkDa的抗肿瘤活性高的多肽组分。
2.根据权利要求I所述的一种毛蚶中抗肿瘤活性多肽组分的制备分离方法，其特征在于加入的缓冲液为O. 01 O. 05M，pH为6. O 9. O的磷酸钠、磷酸钾或Tris碱缓冲液，其固液比为I : I I : 4。
3.根据权利要求I所述的一种毛蚶中抗肿瘤活性多肽组分的制备分离方法，其特征在于提取的方法为超声、搅拌器搅拌提取。
4.根据权利要求I所述的一种毛蚶中抗肿瘤活性多肽组分的制备分离方法，其特征在于采用硫酸铵分级沉淀，其沉淀方式为高中低三级或两级沉淀，其高级沉淀硫酸铵浓度范围为60 100%。
5.根据权利要求I所述的一种毛蚶中抗肿瘤活性多肽组分的制备方法，其特征在于所述的柱层析分离，为阴离子型层析柱，其填料为DEAE-Sephorose，DEAE-纤维素等，其洗脱初始缓冲液为pH为6. O 9. O的O. 020 O. 050M的Tris-HCl、磷酸钠盐缓冲液，通过增加氯化钠的浓度进行洗脱。
6.根据权利要求I所述的一种毛蚶中抗肿瘤活性多肽组分的制备分离方法，其特征在于所用的脱盐方法为使用IOOODa 3000Da范围内的透析袋脱盐，通过使用冷冻干燥的方式 或透析的方式浓缩并通过冷冻干燥的方法来干燥样品。
7.根据权利要求I所述的一种毛蚶中抗肿瘤活性多肽组分的制备分离方法，其特征在于活性多肽组分的分子量范围为10. O 27. OkDa，其主要包括一种主要成分及几个微量成分。
8.根据权利要求I所述的毛蚶中抗肿瘤多肽组分在制备抗肿瘤药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种毛蚶中抗肿瘤活性的多肽组分的制备方法和用途。所述制备方法包括将毛蚶剥壳、内容物清洗、加入缓冲液后匀浆、提取，离心除渣，取上清液，硫酸铵分级沉淀，经透析脱盐后得到活性组分，再经离子交换剂层析分离、透析脱盐，冷冻干燥后，得到一组具有高抗癌活性的多肽组分。本发明通过一系列的提取分离过程同时采用活性追踪的方法，得到分子量在10.0～27.0kDa，对多种肿瘤细胞具有很强抑制作用的糖肽组分。该方法具有提取工艺简单、组分纯度高、抗肿瘤活性好、毒副作用小的优点，适用于抗肿瘤新药的开发和应用。
文档编号A61K38/17GK103254303SQ20131011114
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月1日 优先权日2013年4月1日
发明者于荣敏, 石效健, 宋丽艳 申请人:于荣敏