专利名称：Rapamycin的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及Rapamycin的新用途。
背景技术：
疼痛在广义上可分为急性痛和慢性痛。前者是躯体不可缺少的一种保护机制，后者则由外伤、感染、炎症和肿瘤等各种病因引起，因其病程长，恢复慢，发病机制复杂等，已成为当前危害人们健康的重要原因。由于慢性痛在临床上缺乏有效的缓解策略，现有的药物如吗啡、非留体类抗炎药等存在镇痛效果不佳、成瘾以及毒副作用等问题。因此，阐明其分子机理并寻找有效的镇痛策略，已成为生命医学领域的重点。为了模拟人类慢性痛的临床症状，前人建立了若干不同类型的炎症痛和神经病理痛实验动物模型。由于不同动物模型所模拟的临床症状有所不同，其致病机制也可能有着天壤之别。尽管慢性痛的病因非常复杂，但其临床症状主要都表现为自发痛(spontaneouspain),痛觉过敏 (hyperalgesia)和触诱发痛(allodynia)。自发痛指无外来刺激自发产生痛；痛觉过敏定义为机体对伤害性刺激产生夸大的痛反应；而触诱发痛则指非伤害性轻触刺激可产生疼痛感受。发生于损伤区的痛敏称为原发性痛敏(primary hyperalgesia),包括机械和热痛敏；机体损伤对侧的痛觉过敏称为镜像痛敏(mirror image hyperalgesia)。我们从东亚钳蝎粗毒中分离纯化得到单一成份BmK I，经大鼠足底皮下注射可剂量依赖性地诱发大鼠产生痛反应。利用这一炎症痛模型，可同时模拟诸多临床病征，并为理解致病机制，筛选新型抗炎镇痛药物提供良好的研究载体。哺乳动物雷帕霉素祀蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是表达在哺乳动物体内重要的丝/苏氨酸蛋白激酶。mTOR信号通路在细胞代谢、增殖与存活中非常重要，并具有神经保护和促进神经再生的功能。Rapamycin是一种新型的免疫抑制剂，特异地作用于mTOR中的FRB (FKBP-12-rapamycin binding)结构域从而抑制蛋白活性，从而在脊髓损伤和中枢神经系统退变性疾病中产生神经保护、神经再生效应的作用，进而为脊髓损伤的临床治疗提供新的参考。2007年，美国食品药品管理局已正式批复，准许Rapamycin的衍生物Temsirolimus用于治疗晚期肾细胞癌，也开启了癌症治疗的新策略。另外，Rapamycin以非凋亡的方式阻断活化T细胞增殖治疗器官或骨髓移植中发生的排斥反应，能够阻断蛋白合成和诱导细胞循环停滞在G1期，比传统治疗方法副作用更少。越来越多的证据表明mTOR信号途径在痛觉的中枢调控中也发挥着不可替代的作用，这与动物模型本身的差异密不可分。mTOR信号通路是否参与实验性蝎蜇痛的相关反应，Rapamycin又是否能提供该炎性痛模型的药物设计开发祀点,都有较高的研究价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Rapamycin在制备缓解炎性疼痛药物中的应用。上述的炎性痛模型涉及实验性自发痛及大发作现象、实验性镜像机械痛敏及热痛敏。
本发明将Rapamycin在BmK I足底注射前30分钟鞘内注入大鼠脊髓L5-L6间隙，观察Rapamycin对于大鼠自发痛、大发作、双侧机械痛敏及热痛敏的缓解情况。结果证明，大鼠的自发缩足反射次数、痛觉大发作次数均可被三种剂量的Rapamycin所抑制。Rapamycin对大鼠自发痛的一直时间持续至少2 h。诱发痛方面,三种剂量的Rapamycin均可剂量依赖性地抑制BmK I诱导的镜像机械痛敏和单侧热痛敏，而不影响对侧热痛阈。本发明中采用天然蝎毒素BmK I构建的诱导实验性蝎蜇痛模型，新颖之处在于该模型不仅能够稳定的模拟临床常见的自发痛、热痛敏、机械痛敏等症状，更能很好的模拟临床镜像机械痛症状和阵发性痛觉大发作症状，较其他模型的镇痛研究有着更高的研究价值。
图1为大鼠鞘内注射不同剂量Rapamycin后缓解自发缩足反应持续时程。
图2为大鼠鞘内注射不同剂量Rapamycin后缓解BmK I注射2小时内痛觉大发作总次数。图3为不同剂量Rapamycin缓解注射侧机械痛敏持续时程。图4为不同剂量Rapamycin缓解注射对侧机械痛敏持续时程。图5为不同剂量Rapamycin缓解注射侧热痛敏持续时程。图6为不同剂量Rapamycin缓解注射对侧热痛敏持续时程。
具体实施例方式BmK I 蝎蜇痛模型建立实验请参见 Bai ZT, Liu T, Jiang F，Cheng M, PangXYj Hua LMj Shi Jj Zhou JJj Shu XQj Zhang JWj Ji YH.Phenotypes and peripheralmechanisms underlying inflammatory pain-related behaviors induced by BmK I， amodulator of sodium channels.Exp.Neurol.，226 (2010) 159 - 172.实施例一:不同剂量Rapamycin缓解大鼠自发缩足及痛觉大发作反应的观察在铺有一面玻璃镜的桌上放一高75 cm支架，架上置一 20 X 20 X 30cm3透明有机玻璃盒子，自桌上的镜中观察大鼠足底给药后的反应。药物注射前，将大鼠提前30分钟置于盒中适应实验环境。足底注射BmK I后，动物放回检测盒，持续观测自发痛行为。以每5分钟自发抬足次数、撕叫等痛觉大发作次数来评价伤害性自发痛反应。Rapamycin的给药方式为BmK I注射前30分钟分别在大鼠鞘内注射浓度为20 μ M，200 μ M或2mM的10 μ I药品。Rapamycin对大鼠自发痛及痛觉大发作行为的缓解情况详见图1 图2。结果发现，大鼠的自发缩足反射次数、痛觉大发作次数均可被上述三种剂量的Rapamycin所抑制。Rapamycin对大鼠自发痛的抑制时间持续至少2 h。自发痛相关反应可很好的模拟临床急性痛症状，阵发性痛觉大发作行为可以很好的模拟临床阵发性痛觉发作症状。实施例二:不同剂量Rapamycin缓解大鼠双侧机械痛敏反应的观察
实例一中自发痛基本消失后，将大鼠置于在钢丝网格(Icm2)上的有机玻璃盒(20X20X30 cm3)中。用一系列 Von Frey 纤维(58011，Stoelting C0., USA)(从 0.6 到26 g)来测量机械缩足反射阈值。当大鼠注射侧后足接触地面并正常负重时即可测量。从网格下刺激动物注射侧后肢足底中心皮肤，每根纤维弯曲至适当程度停留2-3秒，两次测量间隔10秒。Von Frey纤维的刺激强度由小到大。如果没有缩足反射，使用更大克数的纤维继续测量，测量最大值为26 g。取能引起50%缩足反应的最小克数值为机械缩足反射阈值。机械痛阈值取毒素注射后4小时、8小时的时间点进行采集。Rapamycin对大鼠双侧机械痛敏的缓解情况详见图3 图4。结果发现，三种剂量的Rapamycin均可剂量依赖性地抑制BmK I诱导的双侧机械痛敏。诱发的双侧机械痛敏可很好的模拟临床镜像痛的症状。实施例三:不同剂量Rapamycin缓解大鼠热痛敏反应的观察
将一个20X20X30 cm3的有机玻璃罩放置在一块厚度为2毫米的玻璃板上,大鼠置于其中，玻璃下方是热痛刺激仪的卤素灯照射头(150 W，24 V，西安风岚器械厂出品，RTY-3型)。照射头距玻璃板的下表面调至3 cm，照射光圈直径调至3 mm照射在玻璃板下方。热刺激直接施加在大鼠后足足心。测量自动切断时间为15秒，以免损伤组织。同一位点重复测量5次。同一位点测量每两次间隔至少10分钟，不同位点测量每两次间隔5分钟。测三次，取平均值作为热缩足反射阈值。热痛阈值取毒素注射后4小时、8小时的时间点进行采集。Rapamycin对大鼠热痛敏的缓解情况详见图5 图6。结果发现，三种剂量的Rapamycin均可剂量依赖性地抑制BmK I诱导的单侧热痛敏，而不影响对侧热痛阈。诱 发的热痛敏可以很好的模拟临床热痛觉过敏症状。
权利要求
1.Rap amycin在制备缓解炎性疼痛药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及Rapamycin在制备缓解炎性疼痛药物中的应用。本发明将三个剂量的Rapamycin在BmKI注射前30分钟注入大鼠鞘内L5-L6骶骨间隙，研究不同剂量Rapamycin在实验性自发痛、阵发性痛觉大发作、双侧机械痛敏和单侧热痛敏等现象中的缓解作用。该项发明建立在实验性动物炎症痛模型上，为研究mTOR信号途径相关的镇痛分子机制及研发新型镇痛药物提供了依据。
文档编号A61K31/436GK103230396SQ201310178309
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月15日 优先权日2013年5月15日
发明者吉永华, 姜峰, 华黎明, 焦云露, 吴静秋 申请人:上海大学