治疗慢性乙型肝炎的复制子dna疫苗的制作方法

专利名称：治疗慢性乙型肝炎的复制子dna疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域中的治疗性DNA疫苗，特别是涉及一种治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗。
背景技术：
乙肝病毒HBV (h印atitis B virus)慢性感染是全球范围内肝脏疾病的首要病因。目前，临床治疗慢性乙肝的主要药物是α-干扰素、拉咪呋啶、阿德福韦等抗病毒药物，这些药物虽然能够抑制病毒复制的某个环节，使病毒DNA含量下降或消失，可一旦停药，就会马上面临疾病复发和病毒反弹的困境(Margarita Pardo, JavierBartolomej Vicente Carren0.Current Therapy of Chronic Hepatitis B.Archives ofMedical Research, 2007, 38:661-677.)。与现有各种治疗药物相比，治疗性疫苗在逆转乙肝免疫耐受、激活免疫反应、清除病毒等方面，具有独特优势和作用，被认为是控制乙肝病毒慢性感染的潜在有效策略。国内外研究的乙型肝炎治疗性疫苗可分为蛋白类疫苗、肽类疫苗、自体DC疫苗和DNA疫苗等多种形式，DNA疫苗是20世纪90年代出现的一类新型疫苗，由于兼具预防和治疗双重功效，并且接种后产生的免疫反应与自限性乙肝患者体内的免疫反应极为相似，呈现多特异性的CD4+和CD8+T细胞反应，能够分泌抗病毒的细胞因子和抗HBV的抗体等，因此DNA疫苗的研究越来越受到关注。现有乙肝治疗性DNA疫苗中，HBV病毒的表面抗原(Hepatitis B surfaceantigen, HBsAg)是应用最早也最广泛的祀抗原。如乙肝第一例DNA疫苗的临床试验(Mancin1-Bourgine M，Fontaine H, Scott-Algara D，et al.1nduction or expansionof T-cell responses by a hepatitis B DNA vaccine administered to chronicHBV carriers.Hepatology2004; 40:874 - 882.)，其结果是接受治疗的部分患者(6/10和2/10)表现出病毒滴度下降和血清HBe`Ag抗原下降，其中两名病毒滴度最低的患者还表现出血清转阴的治疗效果。DNA免疫能够激活病毒HBsAg多表位特异性的T细胞免疫反应，而且特异T细胞免疫反应的激活与特异NK细胞亚型的百分比升高密切相关(Scott-Algara D，Mancin1-Bourgine M，Fontaine H，et al.Changes to the naturalkiller cell repertoire after therapeutic hepatitis B DNA vaccination.PLOS0ne2010;5:e8761.)。此外，乙肝核心抗原(Hepatitis B core antigen，HBcAg)因其独特的理化性质和免疫学特性，在乙肝治疗性疫苗研究中也被广泛关注。聚合酶抗原和pre S1、pre S2等抗原也是已知的非常重要的特异性靶抗原，在自限性乙肝患者体内能够激活特异性免疫应答。Veremeiko TA等把HBV外壳蛋白表位(HBsAg的137 147区域，PreSl的27 37区域和PreS2的131 145区域)插入到HBcAg，成功构建了 HBcAg-HBsAg融合蛋白，并以此免疫小鼠，产生了高滴度的针对插入表位HBsAg和载体蛋白HBcAg抗体(VeremeikoTA, Lebedev LR, Chikaev NA，et al.Humoral immume response of BALB/C mice immunizedwith chimer HBcAg proteins carrying the epitopes of surface hepatic B virusprotein.Vopr virusol, 2007, 52:40-45.)。孟加拉国 Bangladesh 研制的一种新型疫苗策略，联合应用重组HBsAg和HBcAg抗原命名为“NASVAC”，两种抗原协同作用促进T-和B-细胞免疫反应的产生，能够同时产生抗-HBc和抗-HBs血清转换(Akbar SM, Al-MahtabM, Rahman S，et al.A therapeutic nasal vaccine combining both HBsAg and HBcAg wassafe, has antiviral potential and induced antigen-specific immunity in patientswith chronic hepatitis B.Hepatol Int2010;4:159.XDNA疫苗的另一优势是能够方便地实现疫苗抗原和免疫佐剂的联合应用，来应对慢性乙肝患者体内的高度免疫耐受。许多临床试验中都评价了治疗性疫苗联合IL-2用来治疗慢性感染性疾病如HIV和HBV感染中的治疗效果(Dahmen A, Herzog-Hauff S，BocherW0, et al.Clinical and immunological efficacy of intradermal vaccine pluslamivudine with or without interleukin_2in patients with chronic hepatitisB.J Med Virol2002;66:452 - 460.) 其它细胞因子，如GM-CSF作为免疫佐剂，具有诱人的功能:是抗原提呈细胞增殖和迁移的主要介质，并诱导T细胞应答和B细胞的发育(Caux C, Dezutter-Dambuyant C，Schmitt D, et al.GM-CSF and TNF_a cooperate in thegeneration of dedritic Langerhans cells[J].Nature, 1992360 (6401):258 - 261.) B7分子作为第二信号和辅助T细胞表面的CD28结合从而激活辅助T细胞，在抗原有效提呈中发挥重要作用(Rebecca J.Greenwald, Gordon J.Freeman, Arlene H.Sharpe.The B7revisited[J].Annu.Rev.Tmmunol.2005, 23:515 - 548.)。FL 是主要表达于造血干细胞/祖细胞上的III型酪氨酸激酶受体Flt3的配体。FL联合其它细胞因子如GM-CSF、TNF-a、IL-4等，能够表现协同作用，在体内外显著扩增DC，刺激T细胞和NK细胞增殖，在抗肿瘤、抗病毒感染免疫应答中具有潜在的临床应用价值(Bohannon J, Cu i Yff1C oxR, et al.Prophylactic treatment with fms-like tyrosine inase_31igand after burninjury enhances global immune-responses to infect ion[J].J Immunol, 2008, 180(5):3038-3048.)。目前，乙肝治疗性DNA疫苗研究领域的一个关键性问题是如何提高疫苗的安全性和免疫保护力。因为存在与宿主染色体整合的可能性，DNA疫苗在未来实际应用中存在安全隐患；另外由于免疫力较低，DNA疫苗往往在动物模型中能够取得很好的免疫效果，而在临床试验研究中则效果较差，究其原因主要是难以克服长期处于慢性感染患者体内的免疫耐受，因此有必要对传统DNA疫苗进行免疫增效和升级换代(Pan Y, Zhao Q, Fang L, LuoR,Chen H, Xiao S.Efficient gene delivery into mammalian cells by recombinantbaculovirus containing a hybrid cytomegalovirus promoter/Semliki Forest virusreplicon.J Gene Med.2009Nov;11(11):1030-1038.)。近年来，国际上逐步发展起一种新型基因疫苗载体系统，称为复制子DNA疫苗载体。主要基于单股正链RNA病毒(如甲病毒)改构而成,其中以塞姆利基森林病毒SemlikiForest virus (SFV)的研究最为广泛(Hooper Jff, Ferro AM, Golden Jff, et al.Molecularsmallpox vaccine delivered by alphavirus replicons elicits protective immunityin mice and non-human primates.Vaccine.2009Decll;28(2):494-511.),例如由Invitrogen公司开发的市售载体pSFVl、及改造后的载体pSCAl。与传统DNA疫苗相比，复制子DNA疫苗在安全性和高效性两个方面都有重要突破。首先在安全性方面，复制子DNA疫苗的自我复制和转录均在胞浆内完成，被转染细胞最后会发生凋亡，因而消除了与宿主染色体整合的安全隐患。其次在高效性方面，复制子DNA疫苗不仅可以“自主复制”高水平表达抗原基因，而且在自主复制过程中产生的双链RNA中间体，是非常好的免疫佐剂，能够刺激细胞因子及分子伴侣产生。此外新型复制子DNA疫苗还保留了普通DNA疫苗稳定、低成本、激发免疫反应全面等优点。然而，无论是改造后的PSCAl还是原始载体pSFVl均属于氨苄抗性载体，而目前临床上常用的抗生素仍然是氨苄青霉素类药物，因而氨苄抗性载体在临床应用时会存在一定风险，不适于用于得到乙肝治疗性DNA疫苗。

发明内容
基于乙肝治疗性DNA疫苗的研究现状和发展趋势，本发明的目的是提供一种免疫及治疗效果较好的且能够适应临床上对生物治疗药物的实际需求，提高临床应用的安全性的治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗，该疫苗能够在低剂量下激活机体高效的抗原特异性细胞免疫反应，并具有抗病毒免疫效应。本发明所提供的治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗，是携带复合乙肝抗原基因的重组复制子DNA疫苗质粒。其中，所述复合乙肝抗原基因，命名为HBV-CS，其核苷酸序列如序列表中序列I所示，是自上游至下游顺次连接的HBV C区抗原基因(Genebank号G1:387538420)自5’端至3’端第l-225bp、通用CD4细胞表位PADRE、HBV大S区抗原PreSl (Genebank号 G1:387538384)自 5’ 端至 3’ 端第 61_141bp、HBV 大 S 区抗原 PreS2 (Genebank号 G1:387538384)自 5’ 端至 3’ 端第 397_435bp、HBV C 区抗原基因(Genebank 号G1: 387538420)自 5，端至 3，端第 253_453bp、HBV 大 S 区抗原 SCGenebank 号 G1: 387538384)自5，端至3，端第l_666bp。所述复合乙肝抗原基因HBV-CS的5’端还可连接佐剂基因，具体为FL (Genebank号G1:325197203)的胞外段基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示；将由FL的胞外段基因和复合乙肝抗原基因HBV-CS构成的融合基因命名为FL-CS，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。所述融合基因FL-CS的3’端还可连接人IgGFc段基因(GenBank号:Z17370)。所述人IgGFc段基因的3’端还连接GPI基因(GenBank号:XM676434)，该融合基因命名为FL-CS-Fc，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。所述FL-CS-Fc融合基因位于内部核糖体进入位点IRES的上游，在IRES的下游还连接了 GM-CSF 基因(Genebank 号 G1:NM_000758)和 B7.1 基因(Genebank 号 G1:NM_005191)等免疫分子基因，GM-CSF基因和B7.1基因之间通过一个能被弗林蛋白酶(furin)识别8肽编码序列连接，将该融合基因命名为FL-CS-Fc-1RES-GM/CSF-B7.1，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。用于构建治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗的出发载体优选为具有卡那霉素抗性的复制子DNA疫苗载体pSVK，pSVK是将pSCAl载体中的氨苄青霉素抗性基因置换为卡那霉素抗性基因得到的重组载体，其核苷酸序列如序列表中序列6所示。以pSVK为出发载体，构建的自上游至下游依次携带所述融合基因FL-CS、人IgGFc段基因、GPI基因以及GM-CSF基因 和B7.1基因的重组复制子DNA疫苗质粒为pSVK_HBVA，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。采用以上技术方案，本发明在自主构建的具有卡那霉素抗性的新型复制子DNA疫苗载体pSVK的基础上，针对慢性乙肝治疗中的核心难题“免疫耐受”，提供了乙型肝炎新型复制子DNA疫苗的免疫增效策略研究。除了选取HBV preSUpreS2,HBsAg和HBcAg的优势抗原区段组成复合乙肝抗原外，还在新型载体PSVK中融入多种免疫增效策略，将复合乙肝抗原与人FL、PADRE和人IgGFc段融合并通过GPI锚定信号表达在细胞膜上，同时还在复制子载体pSVK中嵌入GM-CSF和B7.1等免疫分子佐剂，全面增强疫苗的抗原递呈能力和免疫激活能力。此外还在新型复制子DNA疫苗的免疫接种方面采用先进的在体电穿孔技术，使机体细胞摄取DNA的效率显著提高。自主研发的乙肝新型复制子DNA疫苗pSVK-HBVA，从乙肝优势抗原组合、分子内免疫增效佐剂和免疫接种技术等多个方面入手，使新型治疗性疫苗在靶抗原摄入、表达、呈递和免疫应答激活等多个方面具备突出优势，有利于打破慢性乙肝的免疫耐受，具备开发潜力和应用价值。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。


图1为HBV复合抗原CS的结构示意2为PCR扩增的FL胞外段基因的I %琼脂糖凝胶电泳检测结果图3为载体pC1-GPI的物理图谱图4为重组表达质粒pC1-GP1-FL瞬时转染293T细胞后FL胞外段基因表达水平的流式细胞仪检测结果 图5为PCR扩增的FL-CS融合基因的I %琼脂糖凝胶电泳检测结果图6为重组质粒pC1-GP1-FL-CS的酶切鉴定结果图7为重组质粒pC1-GP1-FL-CS的物理图谱图8为重组质粒pVAX-HBVA的酶切鉴定结果图9为重组质粒pVAX-HBVA的物理图谱图10为重组表达质粒pVAX-HBVA瞬时转染293T细胞后乙肝复合抗原FL-CS-Fc和GM/B7表达水平的流式细胞仪检测结果图11为重组质粒pSVK-HBVA的酶切鉴定结果图12为重组质粒pSVK-HBVA的物理图谱图13为重组表达质粒pSVK-HBVA瞬时转染293T细胞后乙肝复合抗原FL-CS-Fc和GM/B7表达水平的流式细胞仪检测结果图14为pSVK-HBVA、pSVK-HBVA免疫BALB/c小鼠的体液免疫一抗体检测结果图15为pSVK-HBVA、pSVK-HBVA免疫BALB/c小鼠的细胞免疫一ELISP0T检测结果图16为pSVK-HBVA、pSVK_HBVA免疫BALB/c小鼠的细胞免疫一细胞增殖实验结果图17为pSVK-HBVA、pSVK-HBVA免疫BALB/c小鼠的细胞免疫一细胞因子释放实验
结果图18为pSVK-HBVA、pSVK-HBVA免疫HBV Tg转基因小鼠的细胞免疫一ELISP0T检测结果图19为pSVK-HBVA、pSVK-HBVA免疫HBV Tg转基因小鼠的细胞免疫一细胞因子释放实验结果图20为HBV Tg转基因小鼠体内HBV DNA在免疫治疗前后的动态变化图21为HBV Tg转基因小鼠体内用免疫组化对免疫治疗前后小鼠肝脏组织进行病理学检测结果
具体实施例方式本发明所提供的治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗，是携带复合乙肝抗原基因的重组复制子DNA疫苗。所述复合乙肝抗原基因，可命名为HBV-CS，其核苷酸序列如序列表中序列I所示，是自上游至下游顺次连接的HBV C区抗原基因(Genebank号G1:387538420)自5’端至 3’ 端第 l-225bp、通用 CD4 细胞表位 PADRE (Pan-allelic DR epitope, PADRE)、HBVPreSl 抗原(Genebank 号 G1:387538384)自 5’ 端至 3’ 端第 61_141bp、HBV PreS2 抗原(Genebank 号 G1: 387538384)自 5’端至 3’端第 397_435bp、HBV C 区抗原基因(Genebank 号G1: 387538420)自 5，端至 3，端第 253_453bp、HBV S 抗原基因(Genebank 号 G1: 387538384)自5’端至3’端第l-666bp ;其中，通用⑶4细胞表位PADRE的氨基酸序列如序列表中序列8所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示，能和人类及多种动物不同DR分子结合，提呈于细胞表面，进而激活CD4+T辅助细胞，发挥免疫调节作用[Tobias-MachadoM, Correa TD,De Barros EL, et al.1nt Braz J Urol.2003Jul_Aug;29 (4):313-319]。为了获得更好的免疫效果，所述复合乙肝抗原基因HBV-CS的5’端还可连接佐剂基因，具体可为FL (Genebank号G1:325197203)的胞外段基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示；可将由FL的胞外段基因和复合乙肝抗原基因HBV-CS构成的融合基因命名为FL-CS，其核苷酸序列如序列表中序列3 所示。为了加强复合抗原的免疫递呈，所述由FL的胞外段基因和复合乙肝抗原基因HBV-CS构成的融合基因FL-CS的3’端还可连接人IgGFc段基因(GenBank号:Z17370);为了使复合抗原能够富集在细胞膜上，进一步加强抗原的递呈和免疫激活，所述人IgGFc段基因的3’端还连接糖基化磷脂酰肌醇GPI基因(GenBank号:XM676434)，使复合抗原基因通过基因3’端的GPI锚定信号表达在细胞膜上，该融合基因包括FL-CS、人IgG Fe段和糖基化磷脂酰肌醇GPI基因，因为GPI序列较短，而且只参与细胞膜锚定，并不参与免疫应答环节，所以将该融合抗原基因命名为FL-CS-Fc，核苷酸序列如序列表中序列4所示。为了增强免疫激活和免疫共刺激，通过内部核糖体进入位点IRES实现复合抗原基因FL-CS-Fc与免疫调节因子基因在同一质粒中共表达，所述HBV复合抗原基因FL-CS-Fc位于IRES序列的上游，免疫调节因子GM-CSF基因(Genebank号G1:NM_000758)和B7.1基因(Genebank号G1:NM-005191)等免疫分子基因位于IRES序列的下游，将该融合基因命名为FL-CS-Fc-1RES-GM/CSF-B7.1，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。其中，FL、CS与Fe段之间为直接连接构成融合抗原，依靠抗原基因5’端的FL和3’端的Fe段实现融合抗原基因双向靶向DC的免疫功能；GM-CSF和B7.1之间通过一个能被细胞内普遍存在的弗林蛋白酶(furin)识别8肽连接(详见刘宁，阎瑾琦，冉多良等.肿瘤基因疫苗免疫增效载体PVAX1-1RES-GM/B7的构建与表达.军事医学科学院院刊，2008，32 (3): 249-52)。用于构建治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗的出发载体优选为具有卡那霉素抗性的复制子DNA疫苗载体pSVK，pSVK是将pSCAl载体中的氨苄青霉素抗性基因置换为卡那霉素抗性基因得到的重组载体，其核苷酸序列如序列表中序列6所示。以pSVK为出发载体，构建的自上游至下游依次携带融合基因FL-CS、人IgGFc段基因、GPI基因以及GM-CSF基因和B7.1基因的重组复制子DNA疫苗载体为pSVK-HBVA (参见图12重组质粒pSVK-HBVA的物理图谱)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。构建上述治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗的方法为本领域的常规方法。本发明治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗的免疫剂量一般为l-ΙΟΟμ g/kg，疗程为1-6个月。免疫剂量和疗程可根据实际情况进行调整。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.,Russell,David W.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。实验中用到的分子生物学试剂,如Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture和连接酶等均购自TaKaRa公司。所用引物均由英竣生物技术有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1、构建重组复制子DNA疫苗载体pSVK-HBVA及常规DNA疫苗载体pVAX-HBVA一、构建常规DNA疫苗质粒pVAX-HBVA以pVAXl-1RES-GM/B7 (参见文献:刘宁，阎瑾琦，冉多良等.肿瘤基因疫苗免疫增效载体PVAX1-1RES-GM/B7的构建与表达.军事医学科学院院刊，2008，32 (3):249-52)为出发载体，构建自上游至下游依次携带融合基因FL-CS、人IgGFc段基因、GPI基因以及GM-CSF基因和B7.1基因的常规DNA疫苗载体pVAX-HBVA(参见图9重组质粒pVAX-HBVA的物理图谱)，具体构建方法包括以下步骤:1、HBV复合抗原CS基因的设计与获得在NCBI网站中搜索HBV C、S、PreS等基因的相关序列(HBV C区抗原基因的Genebank 号为 G1:387538420 ;大 S 区抗原包括 S、PreSl 和 PreS2，其基因的 Genebank 号为G1: 387538384)，选取免疫优势抗原区段，将通用CD4细胞表位PADRE (Tobias-MachadoM, Correa TD, De Barros EL, et al.1nt Braz J Urol.2003Jul_Aug; 29 (4): 313-319)以及PreSl (61_141bp)和PreS2 (397_435bp)抗原表位插入并替换HBcAg (乙肝核心抗原C抗原)的刺突区(226-252bp)，然后再和乙肝表面抗原S抗原HBsAg (l_666bp)的基因区段进行融合，构成HBV复合抗原CS，其结构示意图如图1所示。自上游至下游顺次连接的HBV C区抗原基因(Genebank号G1:387538420)自5’端至3’端第l_225bp、通用CD4细胞表位PADRE (Pan-allelic DR epitope, PADRE) ,HBV PreSl 抗原(Genebank 号 G1: 387538384)自5，端至 3，端第 61_141bp、HBV PreS2 抗原(Genebank 号 G1: 387538384)自 5，端至 3，端第397-435bp、HBV C 区抗原基因(Genebank 号 G1: 387538420)自 5，端至 3，端第 253_453bp、HBV S抗原基因(Genebank号G1:387538384)自5’端至3’端第l_666bp。其中，通用CD4细胞表位PADRE (Pan-allelic DR epitope,PADRE)的氨基酸序列如序列表中序列8所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示，能和人类及多种动物不同DR分子结合，提呈于细胞表面，进而激活CD4+T辅助细胞，发挥免疫调节作用。由擎科生物技术有限公司合成HBV复合抗原CS基因后连入pMD18-T载体(TaKaRa公司)中，得到包含HBV复合抗原CS的测序质粒pMD18-T-CS，HBV复合抗原CS基因的核苷酸序列如序列表中序列I所示(1260bp)。2、佐剂FL胞外段基因的扩增与表达FL是酪氨酸激酶受体flt3的配体，能够促进DC和NK细胞生长、分化及成熟，是抗病毒感染免疫应答中一种重要的协同刺激细胞因子。FL基因在Genebank中的序列号为G1: 325197203，其胞外段基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示(468bp)。2.1FL胞外段基因的扩增以含有FL胞外段基因的质粒Teasy-FL (FL基因由擎科生物技术有限公司合成后连入Promega公司的pGEM_T easy载体构建而成)为模板，设计一对引物，并在两条引物的5’端添加限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切位点，引物序列如下:FL-F:5，-GGGCTCGAGACCCAGGACTGCTCCTTCCAACAC-3’FL-R:5，-CCCGAATTCCGGGGCTGTCGGGGCTGTGGCCTC-3>PCR 反应体系为·:10XPCR Buffer5 μ I, dNTP Mixture (2.5mM) 5 μ 1，引物(20pM)FL-F、FL-R 各 I μ 1，模板 Teasy-FLl μ 1，Taq DNA 聚合酶(5U/μ I) I μ 1，补加去离子水至总体积为50μ I ;PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30s、72°C延伸45s，扩增5个循环，72°C继续延伸IOmin ；PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(M:DNA Marker, 1:PCR扩增产物)，可以观察到大小为468bp的目的条带,与预期结果相符。3、重组载体pC1-GP1-FL的构建与表达将2.1中PCR扩增获得的FL胞外段基因和携带人IgGFc段基因与GPI基因的载体pC1-GPI (其物理图谱如图3所示)(参见专利ZL0610089097.3 “抗肿瘤血管内皮生长因子VEGF-E抗原及其编码基因与应用”实施例2中所述)分别用Xho I和EcoR I进行双酶切，纯化回收双酶切后的FL胞外段基因和载体pC1-GPI连接过夜(10-12小时)；连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序鉴定。测序结果显示，FL与载体pC1-GPI成功连接且序列完全正确，重组表达载体pC1-GP1-FL构建成功。按照Promega 公司 Wizard Plus Minipreps DNA Purification system 产品说明书提取pC1-GP1-FL质粒，脂质体法转染293T细胞(购自协和细胞库)，取对数生长期的293T细胞，胰酶常规消化后接种入6孔细胞培养板中，具体操作方法详见脂质体Lipofectamine2000 (Invitrogene公司)产品说明书。转染细胞48小时后，0.25%胰酶消化6孔板中的细胞，冰浴预冷的含有2%新生小牛血清的PBS (购自solarbio)清洗细胞3次，然后用FITC标记的兔抗人IgG抗体(购自eBioscience) 4°C孵育30min,再用冰浴预冷的含有2%新生小牛血清的PBS清洗细胞3次，流式细胞仪检测FL胞外段的表达情况。结果如图4所示(A:空白对照；B:pC1-GP1-FL转染细胞)，与空白对照相比(0.73%)，重组质粒pC1-GP1-FL在293T细胞中阳性表达率为42.42%，证明FL胞外段基因在真核细胞中能够有效表达。4、过渡质粒pC1-GP1-FL-CS的构建采用重叠延伸PCR法扩增FL-CS融合基因片段，共分三步进行:第一步以质粒PC1-GP1-FL为模版扩增FL胞外段基因，其上游引物与FL-F相同仍然带有Xho I酶切位点，下游引物为搭桥引物，除了与FL基因3’端有14个碱基互补之外，还与复合抗原CS的5’端有14个碱基互补，扩增后的FL胞外段基因全长488bp，引物序列如下:FL-F:5’ -GGGCTCGAGACCCAGGACTGCTCCTTCCAACAC-3’FL，-R:5，-GGGTCAATGTCCATCGGGGCTGTCGGGG-3’第二步以质粒pMD18-T-CS为模板PCR扩增HBV复合抗原CS基因，其上游引物为搭桥引物，引物5’端与FL基因的3’端有15bp的互补，下游引物带有EcoR I酶切位点，扩增后的CS基因全长为1281bp，引物序列如下:CS，-F:5，-GCCCCGACAGCCCCG ATGGACATTGACCCTTA-3’CS，-R:5，-CCCGAATTCGAGACAAAAGAAAATTG-3，经过前两步的PCR扩增，FL基因3’端和CS基因5’端出现30bp完全相同的搭桥序列，利用第三步的重叠延伸PCR可以将FL基因和CS基因融合，以FL基因和CS基因的扩增产物做为模板，再以FL-F和CS’ -R为引物，常规PCR扩增获得FL-CS融合基因。以上三步PCR 的扩增体系均为:10XPCR Buffer5 μ I, dNTP Mixture (2.5mM)5 μ I,引物(20pM)各I μ I,模板I μ I, Taq DNA聚合酶(5U/μ I) I μ I,补加去离子水至总体积50 μ I。PCR反应条件均为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，58°C退火30s、72°C延伸lmin，扩增25个循环；72°C延伸lOmin。PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示(L图M:DNA Marker, 1:CS’基因PCR扩增产物，2:FL’基因PCR扩增产物;R图M:DNA Marker, I:FL-CS融合基因PCR扩增产物)，可见图5L中I和2分别代表大小为1281bp和488bp的CS，基因和FL，基因，图5R中显示的是大小为1728bp的FL-CS融合基因。将扩增获得的FL-CS融合基因和pC1-GPI载体分别用Xho I和EcoR I双酶切，将酶切纯化后的FL-CS基因片段与载体pC1-GPI16°C连接过夜(10-12小时)，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经含50mg/L氨苄霉素的LB抗性平板筛选，挑选阳性克隆，提取质粒，用限制性内切酶Xho I和EcoR I进行酶切鉴定，鉴定结果如图6所示(M:DNAMarker ；1:重组质粒 pC1-GP1-FL-CS/Xho I+EcoR I ；2:重组质粒 pC1-GP1-FL-CS)，酶切后得到大小约为5000bp的载体片段和大小约为1700bp的FL-CS融合基因片段，表明重组质粒pC1-GP1-FL-CS构建成功，其物理图谱如图7所示。经测序分析，基因序列也完全正确，FL-CS融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示(1728bp)。5、构建重组质粒pVAX-HBVA
通过过渡质粒pC1-GP1-FL-CS的构建，能够实现FL-CS基因片段与人IgGFc段和GPI基因的融合，其连接顺序自上游至下游依次携带融合基因FL-CS、人IgGFc段基因和GPI基因，大小为3209bp，将该融合基因命名为FL-CS-Fc。先用Not I单酶切过渡质粒pC1-GP1-FL-CS,酶切产物纯化后再用Klenow I (New England Biolabs公司)补平,具体操作详见产品说明书。纯化回收后用Nhe I单酶切并纯化回收大小约为3209bp的FL-CS-Fc融合基因，此片段5’端为Nhe I的粘端，3’端是补平之后的平端。同样载体pVAXl-1RES-GM/B7 (参见文献:刘宁，阎瑾琦，冉多良等.肿瘤基因疫苗免疫增效载体PVAX1-1RES-GM/B7的构建与表达.军事医学科学院院刊，2008，32 (3):249-52)先用Pvu I单酶切，Klenow I补平，纯化回收后再用Nhe I单酶切，纯化回收备用。将融合基因FL-CS-Fc和载体PVAX1-1RES-GM/B7片段于16°C连接过夜(10-12小时)，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经含50mg/L卡那霉素的LB抗性平板筛选，挑选阳性克隆，提取质粒，用限制性内切酶Nhe I和Psi I进行酶切鉴定，鉴定结果如图8所示(M:DNA Marker ;1:酶切后补平的基因片段大小为3209bp ；2:酶切后补平的载体大小约为5000bp ；3:阳性重组质粒；4:重组质粒的酶切鉴定结果)，酶切后得到约5000bp的载体片段和约3000bp的基因片段，表明重组质粒(命名为pVAX-HBVA)构建成功,其物理图谱如图9所示。经测序分析,该重组质粒pVAX-HBVA中融合基因序列也完全正确。融合基因FL-CS-Fc的连接顺序自上游至下游依次携带融合基因FL-CS、人IgGFc段基因和GPI基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示(3209bp)。融合基因FL-CS-Fc连入载体pVAXl_IRES_GM/B7后，通过内部核糖体进入位点IRES实现复合抗原基因FL-CS-Fc与免疫调节因子GM-CSF和B7.1 (GM/B7)复合基因在同一质粒pVAX-HBVA中的共表达，将该融合基因命名为FL-CS-Fc-1RES-GM/CSF-B7.1，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。6、重组质粒pVAX-HBVA的表达按照Prom·ega 公司 Wizard Plus Minipreps DNA Purification system 产品说明书提取质粒pVAX-HBVA。采用脂质体法转染293T细胞(具体方法参见实施例1第2部分)。转染细胞48小时后，0.25%胰酶消化6孔板中的细胞，冰浴预冷的含有2%新生小牛血清的PBS清洗细胞3次，然后用FITC标记的兔抗人IgG抗体(购自eBioscience)和PE标记的鼠抗人⑶80抗体(购自eBioscience)4°C孵育30min,再用冰浴预冷的含有2%新生小牛血清的PBS清洗细胞3次，最后用I %多聚甲醛重悬细胞，流式细胞仪分别检测乙肝复合抗原FL-CS-Fc和GM-CSF、B7.1 (GM/B7)免疫分子的表达情况。结果如图10所示(A:空白对照；B:pVAXl-HBVA转染细胞)，转染重组质粒pVAXl_HBVA的293T细胞中，FITC标记和PE标记双染色的结果，乙肝复合抗原FL-CS-Fc的阳性表达率为7.15% (由单独表达的阳性率3.24%和共表达的阳性率3.91%相加所得)；GM/B7的阳性表达率为24.94%(同样由单独表达的阳性率21.03%和共表达的阳性率3.91%相加所得)，说明所构建疫苗获得了有效表达。二、重组复制子DNA疫苗载体pSVK-HBVA的构建与表达1、构建DNA复制子载体pSVK1.1构建携带PS与KANA融合基因(PS-KANA)的重组载体pUC19-PS_KANA重组载体pUC19-PS-KANA的构建方法如下:I)扩增PS基因:以含有氨苄青霉素抗性基因的复制子DNA疫苗载体 pSCAl (构建方法参见文献 Yu Y Z, Sun Z W，Yu W Y.Chinese Journal ofBiotechnology, 2005，21 (5): 33-38)为模板，在引物 PSCA_F(5’-CCGTCTAGAGATCATAATCAGCCAT-3 ’)和 PSCA-R (5 ’ -CCGGCATGCCTCGAGACTAGTCTGTCAGACCAAG-3 ’)的引导下 PCR 扩增氨苄青霉素抗性基因的旁侧序列，所述5’端旁侧序列含有限制性内切酶Xba I识别位点，所述3’端旁侧序列含有限制性内切酶Sph I识别位点，PCR反应体系为=IOXPCR缓冲液10 μ 1，MgCl2 (2.5mM) 10 μ I, dNTPs 混合物(2.5mM) 8 μ 1，合成引物(20 μ Μ) PSCA-F 和 PSCA-R 各
2μ 1，Taq DNA聚合酶(5U/μ I) 2 μ I，加去离子水至100 μ I ;PCR反应条件为:先94°C预变性5min ;然后94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30个循环；最后72°C继续延伸lOmin。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明经PCR扩增获得了全长1273bp的基因片段，回收并纯化该基因片段，测序，测序结果表明该基因片段的核苷酸序列如序列表中序列10所示，与预期结果相符，将该基因片段命名为PS0然后，将PS基因用限制性内切酶Xba I和Sph I进行双酶切后，与同样经Xba I和SphI双酶切的载体PUC19连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经浓度50 μ g/mL的氨苄青霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定，鉴定结果表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带PS基因的重组载体，命名为pUC19-PS。2)获得PS与KANA融合基因(PS-ΚΑΝΑ):以含有卡那霉素抗性基因的载体pVAXl(购自 Invitrogen 公司)为模板，在引物 KANA-F (5’ -CCGACTAGTATGATTGAACAAG-3’ )和 KANA-R(5 ’ -CCGCTCGAGTCAGAAGAACTCGTC-3 ’)的引导下PCR扩增5 ’端携带限制性内切酶Spe I识别位点、3’端携带限制性内切酶Xho I识别位点的卡那霉素抗性基因，PCR反应体系为:10XPCR 缓冲液 5 μ 1，MgCl2 (2.5mM) 5 μ 1，dNTPs 混合物(2.5mM) 4μ I，合成引物(20 μ Μ)KANA-F和KANA-R各I μ l，Taq DNA聚合酶(5U/μ 1)1 μ 1，加去离子水至50 μ I ;PCR反应条件为:先94°C预变性5min ;然后94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共30个循环；最后72°C继续延伸lOmin。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明经PCR扩增获得了全长795bp的基因片段，回收并纯化该基因片段，将该基因片段命名为KANA，其核苷酸序列如序列表中序列11所示，然后将KANA基因用限制性内切酶SpeI和Xho I进行双酶切后，与同样经SpeI和Xho I双酶切的载体pUC19_PS连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经浓度50 μ g/mL的氨苄青霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定，鉴定结果表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带PS与KANA融合基因(PS-KANA)`的重组载体，命名为pUC19-PS_KANA。1.2获得复制子DNA疫苗载体pSVK3)抗性基因置换:将复制子DAN载体pSCAl中的氨苄青霉素基因置换为卡那霉素基因，得到复制子DNA疫苗载体pSVK，具体方法为:将载体pSCAl先用SphI单酶切，回收并纯化后在DNA聚合酶I (Klenow)的作用下，将酶切后产生的粘性末端补平后回收、纯化，再用SpeI进行单酶切并回收、纯化后作为目的载体,再将重组质粒PUC19-PS-KANA先用Hind III单酶切，回收并纯化后在DNA聚合酶I (Klenow)的作用下，将酶切后产生的粘性末端补平后回收、纯化，然后再用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理，最后再用Xba I单酶切，回收并纯化约2100bp的DNA片段，利用SpeI和XbaI属于同尾酶的特性，将回收并纯化的目的载体和DNA片段连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，进行抗性筛选，重组质粒转化入大肠杆菌DH5 α中后在氨苄青霉素抗性的LB平板中不再生长，而在含有卡那霉素抗性的LB平板中生长良好，表明复制子DNA疫苗载体pSCAl中的氨苄青霉素基因成功置换为卡那霉素基因，再进行PCR和酶切鉴定，鉴定结果表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带卡那霉素抗性基因的复制子DAN疫苗载体，命名为pSVK，测序结果表明pSVK的核苷酸序列如序列表中序列6所示。2、构建重组复制子DNA疫苗pSVK-HBVA重组质粒pVAX-HBVA (参见实施例1之一)先用Nhe I和Pme I双酶切，可以将FL-CS-Fc和GM/B7整个融合基因从pVAX-HBVA中完整地切出来，纯化后利用Klenow I将酶切后产生的粘性末端补平，并纯化回收两端均为平端的FL-CS-Fc与GM/B7的融合基因大片段，大小约为5000bp。将已构建好的DNA复制子载体pSVK(参见实施例1之二步骤I)用平端酶Sma I单酶切后纯化回收线性化的载体。将融合基因大片段和载体pSVK片段于16°C连接过夜(10-12小时)，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经含50mg/L卡那霉素的LB抗性平板筛选，挑选阳性克隆，提取质粒，用限制性内切酶BamH I和BssH II进行酶切鉴定，鉴定结果如图11所示(Ml:DL5000 ；M2::DL15000 ；1:双酶切片段；2:单酶切载体；
3:pSVK-HBVA ；4:PCR鉴定结果；5:酶切鉴定结果)，酶切鉴定可得到大小约Ilkb和5kb的基因片段，表明重组复制子DNA疫苗(命名为pSVK-HBVA)重组质粒构建成功，其物理图谱如图12所示。测序结果表明pSVK-HBVA的核苷酸序列如序列表中序列7所示。3、重组复制子DNA疫苗pSVK-HBVA的表达按照Promega 公司Wizard Plus Minipreps DNA Purification system 产品说明书提取质粒pVAX-HBVA。采用脂质体法转染293T细胞(具体方法参见实施例1第2部分)。转染细胞48小时后，0.25%胰酶消化6孔板中的细胞，冰浴预冷的含有2%新生小牛血清的PBS清洗细胞3次，然后用FITC标记的兔抗人IgG抗体(购自eBioscience)和PE标记的鼠抗人⑶80抗体(购自eBioscience)4°C孵育30min,再用冰浴预冷的含有2%新生小牛血清的PBS清洗细胞3次，最后用I %多聚甲醛重悬细胞，流式细胞仪分别检测乙肝复合抗原FL-CS-Fc和GM-CSF和B7.1 (GM/B7)免疫分子的表达情况。结果如图13所示(A:空白对照:pSVK-HBVA转染细胞)，重组质粒pSVK-HBVA转染293T细胞后，乙肝复合抗原FL-CS-Fc阳性表达率 为7.48% (由单独表达的阳性率0.09%和共表达的阳性率7.39%相加所得)，GM/B7的阳性表达率为37.84% (同样由单独表达的阳性率28.45%和共表达的阳性率7.39%相加所得)，且抗原和佐剂通过载体中IRES的作用在同一个真核细胞中进行共表达。实施例2、pSVK-HBVA免疫BALB/c小鼠的免疫学功能检测参见实施例1，在构建新型复制子DNA疫苗pSVK-HBVA的过程中，还构建了以普通质粒载体PVAXl为基础的常规DNA疫苗pVAXl-HBVA。分别设立两种疫苗的高(100 μ g)中(10 μ g)低(I μ g)三个剂量组，免疫健康Balb/c小鼠，检测免疫后小鼠的体液免疫和细胞
免疫应答。免疫分组情况:选取6-8周龄Balb/c雌性小鼠随机分为10组分别是:①空白组，②生理盐水组，③PVAXl空载体组，④pSVK空载体组，⑤pVAX-HBVAl μ g，⑥ pVAX-HBVA10 μ g,⑦ pVAX-HBVA100 μ g,⑧ pSVK-HBVAlμ g,⑨ pSVK-HBVA10 μ g,⑩ pSVK-HBVA100 μ g, 10 只 / 组。免疫方案:分别按各组剂量免疫小鼠腿部肌肉，借助在体电穿孔技术递送疫苗，免疫三次，间隔十天。免疫学活性检测:
1、体液免疫一抗体检测选择HBV表面抗原S以及pre-Sl、pre-S2和C区抗原包被酶联板，对免疫后Balb/c小鼠眼眶采血，分离血清，倍比稀释后检测抗体滴度。检测结果如图14(A为pVAX-HBVA常规DNA疫苗不同剂量组的抗体滴度检测，B为pSVK-HBVA新型复制子DNA疫苗不同剂量组的抗体滴度检测)所示，其中HBcAg抗原抗体反应比较稳定，效果明显。可见在pSVK疫苗组和pVAX疫苗组曾现出了相似的趋势，抗体滴度呈一定的剂量依赖，随着免疫剂量的升高，抗体滴度也逐步升高。2、细胞免疫一ELISP0T检测、细胞增殖实验和细胞因子释放实验2.1ELISPOT 检测分离末次免疫后一周的Balb/c小鼠脾脏淋巴细胞，选用酶联免疫斑点法ELISP0T检测乙肝特异性抗原复合肽刺激下，各组小鼠抗原特异性IFN-Y释放(ELISP0T检测试剂盒购自达科为生物技术有限公司)，从而判断各组小鼠在疫苗免疫后的细胞免疫激活情况，操作步骤详见说明书。结果如图15所示(A为pVAX-HBVA常规DNA疫苗不同剂量组的ELISP0T检测，B为pSVK-HBVA新型复制子DNA疫苗不同剂量组的ELISP0T检测)，从图中可以看到复制子DNA疫苗pSVK-HBVA在I μ g也就是常规DNA疫苗1/100的剂量下，即可激活高效的细胞免疫应答，而作为对照的pVAX-HBVA组在低中剂量I μ g或10 μ g时激活的免疫应答较低，只有在高剂量100 μ g时才能激活高效的免疫应答，表明常规DNA疫苗发挥免疫治疗作用存在明显的剂量依赖性，这也能部分解释为什么临床上研发的常规治疗性DNA疫苗在小动物实验中表现良好，而在大动物或人体实验中则效果较差的疑问。疫苗的应用剂量恐怕是很重要的影响因素之一，而复制子DNA疫苗在低剂量下起效的优势将会在临床应用中显示出良好的应用潜质。2.2细胞增殖实验分离末次免疫后小鼠的脾脏淋巴细胞，在乙肝特异性抗原HBcAg刺激下，检测淋巴细胞的体外增殖活性，选用细胞增殖-毒性检测试剂盒Cell Counting Kit, CCK-8法检测(CCK-8检测试剂盒购自日本D0JIND0)，操作步骤详见说明书。结果如图16所示，pSVK组在剂量为I μ g时，细胞增殖活性最强，而PVAX组则要在高剂量100 μ g时才表现出较强的增殖活性。2.3细胞因子释放实验分离末次免疫后小鼠的脾脏淋巴细胞，用乙肝特异性重组HBcAg抗原刺激，培养72小时后收集上清，采用ELISA定量检测试剂盒(购自欣博盛生物科技有限公司)分别检测IL-2和IFN- Y的释放。结果如图17所示(A为pVAX-HBVA和pSVK-HBVA两种类型疫苗不同剂量组IL-2细胞因子释放检测，B为pVAX-HBVA和pSVK-HBVA两种类型疫苗不同剂量组IFN-Y细胞因子释放检测)，pSVK-HBVA疫苗组的淋巴细胞在重组抗原刺激下能有效分泌Thl类细胞因子如:IL-2和IFN- Y，并且以低剂量组I μ g效果最佳，而pVAX-HBVA疫苗组的整体功能活性弱于复制子DNA疫苗组，且各剂量组差异不明显。实施例3、pSVK-HBVA免疫HBV Tg转基因小鼠的细胞免疫学检测实施例2表明新型复制子DNA疫苗pSVK-HBVA在低剂量I μ g时即可激活健康Balb/c小鼠体内强烈的体液和细 胞免疫应答，本实施例进一步探究新型复制子DNA疫苗pSVK-HBVA在转乙肝全长基因的HBV Tg (Transgenic，Tg)转基因小鼠体内激活免疫应答的能力。HBV Tg转基因小鼠(购自458医院)与慢性乙肝患者相类似，转基因小鼠体内长期携带乙肝基因，并对乙肝抗原高度免疫耐受，能够在这一模型中激活细胞免疫应答是治疗慢性乙肝的重要基础。转基因小鼠的免疫分组和免疫方案制订与实施例2中的免疫普通Balb/c小鼠的免疫程序相同。1、ELISP0T 检测分离末次免疫后一周的转基因小鼠脾脏淋巴细胞，选用酶联免疫斑点法ELISP0T检测乙肝特异性抗原复合肽刺激下，各组小鼠抗原特异性IFN-Y释放(ELISP0T检测试剂盒购自达科为生物技术有限公司)，操作步骤详见说明书。结果如图18所示(A为pSVK-HBVA新型复制子DNA疫苗不同剂量组的ELISP0T检测，B为pVAX-HBVA常规DNA疫苗不同剂量组的ELISP0T检测)，可以看到复制子DNA疫苗pSVK-HBVA能够在转基因小鼠模型中激活细胞免疫应答，只是激活有效免疫应答的细胞浓度为I X 106，略高于普通细胞小鼠4X105，所构建的新型复制子DNA疫苗pSVK-HBVA仍然在低剂量I μ g时即可激活高效的细胞免疫应答，常规DNA疫苗pVAXl-HBVA则在高剂量100 μ g组效果较好，趋势与普通小鼠体内激活的免疫应答相一致。2、细胞因子释放实验分离末次免疫后转基因小鼠的脾脏淋巴细胞，用乙肝特异性重组HBcAg抗原刺激，培养72小时后收集上清，采用ELISA定量检测试剂盒(购自欣博盛生物科技有限公司)，操作步骤详见说明书。对Thl类细胞因子IL-2和IFN-Y的释放检测，同样也反应了免疫小鼠T细胞在特异性病毒抗原刺激下的免疫活性，间接反应疫苗免疫后激活的抗病毒免疫效应。结果如图19所示(A为pVAX-HBVA和pSVK-HBVA两种类型疫苗不同剂量组IL-2细胞因子释放检测，B为pVAX-HBVA和pSVK-HBVA两种类型疫苗不同剂量组IFN- Y细胞因子释放检测)，PSVK-HBV疫苗免疫组在重组抗原刺激下能有效分泌Thl类细胞因子如:IL-2和IFN-Y，并且以低剂量组I μ g效果最佳，而p VAX-HBV疫苗组的整体功能活性弱于pSVK-HBV复制子DNA疫苗组，免疫组小鼠IFN- Y的释放能力高于IL-2。实施例4、pSVK-HBVA免疫转基因小鼠的抗病毒免疫治疗作用检测分别取HBV Tg转基因小鼠(购自458医院)免疫治疗前后的血清，用乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒(购自湖南圣湘生物科技有限公司)，检测转基因小鼠体内HBV DNA在免疫治疗前后的动态变化。并利用免疫组化对小鼠肝脏组织进行病理学检测。从基因组和病理组织变化两个方面综合评价新型疫苗的治疗效果。1、HBV Tg转基因小鼠体内HBV DNA在免疫治疗前后的动态变化对HBV Tg转基因小鼠在免疫前后，进行眼眶采血分离血清备用，利用针对HBV核酸保守物设计的一对特异性引物(包含在湖南圣湘生物科技有限公司生产的乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒)，制备特异性荧光探针(也是核酸定量测定试剂盒提供)，在荧光定量PCR仪(购自BIO-RAD公司)上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现HBV-DNA的定量检测。结果如图20 (A为pVAX-HBVA常规DNA疫苗不同剂量组的HBV-DNA的定量检测，B为pSVK-HBVA新型复制子DNA疫苗不同剂量组的HBV-DNA的定量检测)所示，可见常规DNA疫苗pVAX-HBVA对转基因小鼠体内HBVDNA的拷贝数有一定降低作用，但效果不十分明显，但新型复制子DNA疫苗pSVK-HBVA降病毒的效果明显优于普通疫苗组，而且还显示出低中剂量时效果较好的趋势。
2、HBV Tg转基因小鼠体内用免疫组化对免疫治疗前后小鼠肝脏组织进行病理学检测手术剥离末次免疫后各组小鼠的肝脏组织，福尔马林固定，石蜡包埋，切片后进行脱蜡，抗原修复，应用鼠抗人乙肝病毒核心抗原HBcAg单克隆抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)免疫组化染色。结果如图21所示(A为pSVK-HBVA新型复制子DNA疫苗不同剂量组的免疫组化检测，B为pVAX-HBVA常规DNA疫苗不同剂量组的免疫组化检测)，在肝脏组织的胞浆和胞核中可观察到数量不一的棕褐色颗粒，从照片中可以观察到复制子疫苗pSVK-HBVA低剂量组治疗效果最为明显，与空载体对照组相比，棕褐色颗粒明显减少，而普通疫苗组pVAX-HB VA各剂量之间差异不大，也未见非常显著的治疗作用。
权利要求
1.治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗，是携带复合乙肝抗原基因的重组复制子DNA疫苗质粒。
2.根据权利要求1所述的治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗，其特征在于:所述复合乙肝抗原基因，命名为HBV-CS，其核苷酸序列如序列表中序列I所示，是自上游至下游顺次连接的HBV C区抗原基因(Genebank号G1: 387538420)自5，端至3，端第l_225bp、通用CD4细胞表位PADRE、HBV大S区抗原PreSl (Genebank号G1: 387538384)自5’端至3，端第 61-141bp、HBV 大 S 区抗原 PreS2 (Genebank 号 G1: 387538384)自 5，端至 3’ 端第397-435bp、HBV C 区抗原基因(Genebank 号 G1: 387538420)自 5，端至 3’ 端第 253_453bp、HBV 大 S 区抗原 S (Genebank 号 G1: 387538384)自 5’ 端至 3’ 端第 l_666bp。
3.根据权利要求1或2所述的治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗，其特征在于:所述复合乙肝抗原基因HBV-CS的5’端还可连接佐剂基因，具体为FL (Genebank号61:325197203)的胞外段基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示；将由FL的胞外段基因和复合乙肝抗原基因HBV-CS构成的融合基因命名为FL-CS，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。
4.根据权利要求3所述的治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗，其特征在于:所述融合基因FL-CS的3’端还可连接人IgGFc段基因(GenBank号:Z17370)。
5.根据权利要求4所述的治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗，其特征在于:所述人IgGFc段基因的3’端还连接GPI基因(GenBank号:XM676434)，该融合基因命名为FL-CS-Fc,其核苷酸序列如序列表中序列4所示。
6.根据权利要求5所述的治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗，其特征在于:所述FL-CS-Fc融合基因位于内部核糖体进入位点IRES的上游，在IRES的下游还连接了 GM-CSF基因(Genebank 号 G1:NM_000758)和 B7.1 基因(Genebank 号 G1:NM_005191)等免疫分子基因，GM-CSF基因和B7.1基因之间通过一个能被弗林蛋白酶(furin)识别8肽编码序列连接，将该融合基因命名为FL-CS-Fc-1RES-GM/CSF-B7.1，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。
7.根据权利要求1-6任一所述的治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗，其特征在于:用于构建治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗的出发载体优选为具有卡那霉素抗性的复制子DNA疫苗载体pSVK，pSVK是将pSCAl载体中的氨苄青霉素抗性基因置换为卡那霉素抗性基因得到的重组载体，其核苷酸序列如序列表中序列6所示。
8.根据权利要求7所述的治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗，其特征在于=WpSVK为出发载体，构建的自上游至下游依次携带所述融合基因FL-CS、人IgGFc段基因、GPI基因以及GM-CSF基因和B7.1基因的重组复制子DNA疫苗质粒为pSVK_HBVA，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。
全文摘要
本发明公开了一种治疗慢性乙型肝炎的复制子DNA疫苗。该疫苗是携带复合乙肝抗原基因的重组复制子DNA疫苗载体质粒。所述复合乙肝抗原基因命名为HBV-CS，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述复制子DNA疫苗载体命名为pSVK。以pSVK为出发载体，构建的自上游至下游依次携带融合基因FL-CS、人IgGFc段基因、GPI基因以及GM-CSF基因和B7.1基因的重组复制子DNA疫苗质粒为pSVK-HBVA，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。
文档编号A61P31/20GK103239717SQ20131018042
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月15日 优先权日2013年5月15日
发明者于继云, 阎瑾琦, 王宇, 张巍, 徐元基, 贾锐, 张亮, 肖毅, 朱晓明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所