用于制备戊型肝炎病毒样颗粒的蛋白质和方法【专利摘要】本发明涉及分子生物学和病毒学领域。特别地，本发明涉及一种能够在体外组装成戊型肝炎病毒（HepatitisEVirus,HEV)病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)的蛋白质，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防或治疗HEV感染及由HEV感染所导致的疾病，例如戊型肝炎等。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防或治疗HEV感染及由HEV感染所导致的疾病例如戊型肝炎等。此外，本发明还提供了制备HEV病毒样颗粒的方法。【专利说明】用于制备戊型肝炎病毒样颗粒的蛋白质和方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及分子生物学和病毒学领域。特别地，本发明涉及一种能够在体外组装成戊型肝炎病毒（HepatitisEVirus，HEV)病毒样颗粒（virus-likeparticle，VLP)的蛋白质，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防或治疗HEV感染及由HEV感染所导致的疾病，例如戊型肝炎等。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防或治疗HEV感染及由HEV感染所导致的疾病例如戊型肝炎等。此外，本发明还提供了制备HEV病毒样颗粒的方法。【
背景技术：
】[0002]戊型病毒性肝炎是由戊型肝炎病毒（ifepatitisEVirus，HEV)感染导致的，其是主要的病毒性肝炎之一，并且多数呈自限性。戊型病毒性肝炎的症状与甲型肝炎类似，但病死率更高，症状更重：孕妇病死率可高达20%，并且慢性肝病患者合并HEV感染易引发肝衰竭,死亡率达70%。[0003]HEV主要通过肠道传播，但亦可通过输血或垂直途径传播，常常导致大规模的爆发流行。近半个世纪以来，文献记载了万例以上的戊型肝炎大爆发近十起，其中规模最大的一次发生于1986-1988年的中国新疆，共发病119,280例，死亡707人，其中包括414名孕妇。由于人们对HEV的研究很有限，因此长期以来戊型肝炎处于一种被忽视的状态。进入21世纪以来，随着戊型肝炎诊断试剂的灵敏度和特异性的大幅度提高，越来越多的戊型肝炎病例被确诊。据统计，全球大约有三分之一的人口曾感染过HEV。[0004]越来越多的证据显示，戊型肝炎是一种人兽共患疾病。猪是HEV的最主要动物宿主，并且是人类戊型肝炎的重要传染源。我国学者对全国20个省市120个养猪场以及进口检疫的9,055只猪的HEV感染情况进行了血清学调查，结果证实我国商品猪中的HEV感染极其常见，总感染率高达83%，并且从国内多个地区的猪中分离到了HEV病毒株。[0005]戊型肝炎病毒（HEV)是一种单股正链的RNA病毒，其衣壳是由单一结构蛋白组装成的T=3的二十面体对称结构，包裹约7.2kb的基因组。HEV病毒颗粒的直径为约27?34nm，无包膜。HEV基因组包含5'端帽状结构和多聚A尾，并且包含三个相互重叠的开放性读码框（ORF:0RF1，0RF2和0RF3)，其两侧分别为一个短的5'端非编码区（5'UTR)和一个由多聚腺苷酸终止的短的3'端非编码区（3'UTR)。ORFl长约5kb，位于编码区的5'末端，是HEV最大的开放读码框，其主要作用为：在RNA合成酶的参与下，编码与病毒RNA复制有关的非结构蛋白（P〇RFl)。0RF2长约2kb，位于编码区的3'末端，为HEV的主要结构基因编码区，其主要作用为：编码病毒衣壳蛋白P0RF2--一种含660个氨基酸的糖基化蛋白。近来还针对0RF2蛋白与HEV基因组5'末端的特异RNA结合活性进行了研究，结果显示，两者的相互作用可能有助于病毒衣壳的形成。0RF3是一个小的开放读码框，功能尚未被阐明。目前有研究提示，HEV0RF3蛋白可能在细胞信号转导、HEV颗粒组装、释放及免疫等方面起着重要的作用。[0006]根据0RF2结构蛋白基因的同源性，HEV至少可分为4个主要的基因型。分子流行病学研究表明，HEV基因1型和2型主要感染人类，常导致爆发流行；基因3型和4型可同时感染动物和人类，呈散发性流行。四种型别的HEV代表株分别为缅甸株、墨西哥株、美国株和中国变异株。目前，将鸡HEV归为基因5型。各型HEV在0RF2氨基酸序列上具有较高的同源性，这导致在HEV血清学上世界各地的HEV均为同一血清型。[0007]目前，HEV的细胞培养和组织培养均未能获得成功。然而，由于HEV的病毒样颗粒（virus-likeparticle,VLP)可以较好的模拟天然HEV颗粒，用于活性及功能上的基础研究以及戊型肝炎疫苗的研制。因此，国内外HEV的病毒样颗粒研究主要如下：通过各种表达系统获得结构蛋白，然后在体内或体外将结构蛋白组装成为病毒样颗粒（VLP)，从而获得HEV的病毒样颗粒。目前，关于制备获得HEVVLP研究的报道包括如下：（1)通过利用杆状病毒/昆虫细胞表达HEV0RF2片段aall2-aa607,可在细胞裂解物中获得体内自组装的HEVVLP(Robinson等，ProteinExprPurif.1998,12(1):75-84);(2)通过利用杆状病毒/昆虫细胞表达HEV0RF2片段aal4-aa608,其可在体外自组装成为HEVVLP(Li等，邛(：.2010，即118丨18);(3)利用大肠杆菌表达冊￥01^2片段&&368-&&606，其可在体外自组装成为HEVVLP(Li等，Vaccine.2005,23:2893-2901;Li等，JBC.2005,28(5):3400-3406)。[0008]迄今为止，世界上进入临床试验的戊型肝炎疫苗有两种：一种是由GSK公司研制的包含杆状病毒/昆虫细胞表达的HEV0RF2片段aal12-606的VLP疫苗，其在尼迫尔进入了II期临床试验，显示了良好的免疫原性，然而由于各种原因，该研究被中断；另一种是包含大肠杆菌表达的HEV0RF2片段aa368-aa606的VLP疫苗，该蛋白以包涵体形式表达后在体外组装（Li等，JBC，2005;Yang等，ProteinScience,2013)，其已经完成III期临床试验，显示了良好的安全性和保护性（Zhu等，Lancet,2010)，并于2012年10月上市。由此可见，HEVVLP具有良好的免疫反应性和免疫原性，可用于研制戊型肝炎疫苗，是戊型肝炎疫苗的理想形式。[0009]如上所述，目前已可通过2种方法来制备和获得HEV病毒样颗粒：1)利用昆虫细胞可溶性表达HEV0RF2的蛋白片段（aall2-606)，其在昆虫细胞内组装成HEV病毒样颗粒；和2)利用大肠杆菌在包涵体内表达HEV0RF2的蛋白片段（aa368-606)，其在体外溶解、复性并组装成HEV病毒样颗粒。这2种方法各有优缺点。第一种方法的优点在于，其能够表达长度更大的蛋白，从而所获得的病毒样颗粒更加接近于野生型病毒，有利于被机体的免疫系统识别并诱发高效的免疫应答；其缺点在于，HEV病毒样颗粒在细胞内进行组装，从而存在着在HEV病毒样颗粒中引入宿主蛋白或核酸等杂质的风险。此外，第一种方法使用真核细胞表达系统，其成本高，周期长，且效率较低。第二种方法则恰好相反。[0010]然而，之前从未报道过，HEV0RF2片段aal12-606能够在体外重新组装成病毒样颗粒。事实上，本发明人已尝试利用大肠杆菌来表达野生型HEV0RF2片段aall2-606并体外组装HEV病毒样颗粒，以期消除第一种方法的缺点（S卩，避免在HEV病毒样颗粒中引入宿主蛋白或核酸等杂质，并通过利用高效、周期短的原核表达系统来降低成本)。然而，结果显示，该蛋白片段能够在包涵体中表达，却难以在体外进行复性和组装，无法获得HEV病毒样颗粒。[0011]因此，本领域需要提供一种新的制备HEV病毒样颗粒的方法，以解决上述技术问题。【
发明内容】[0012]在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。[0013]根据本发明，术语"大肠杆菌表达系统"是指由大肠杆菌（菌株）与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株）来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698,ER2566,BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。[0014]根据本发明，术语"载体（vector)"是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。[0015]根据本发明，术语"HEV0RF2"是指戊型肝炎病毒（HEV)基因组的0RF2,其序列是本领域公知的(参见，例如DDBJ数据登录号：D11092)，并且编码HEV的衣壳蛋白。在本发明中，当涉及HEV0RF2的序列时，其使用DDBJ数据登录号：D11092所示的序列来进行描述。例如，表述"HEV0RF2编码的多肽的第112-606位氨基酸残基"(在本文中也简写为，HEV0RF2片段aall2-aa606或HEV0RF2aall2-aa606)中的第112-606位氨基酸残基是指，Dl1092编码的多肽的第112-606位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HEV0RF2或其编码的多肽中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能(在本发明中即，编码能够形成HEVVLP的衣壳蛋白）。因此，在本发明中，术语"HEV0RF2"应包括所有此类序列，包括例如Dl1092所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HEV0RF2(或其编码的多肽）的序列片段时，其不仅包括D11092(或其编码的多肽）的序列片段，还包括D11092(或其编码的多肽）的天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述"HEV0RF2编码的多肽的第112-606位氨基酸残基"包括，D11092编码的多肽的第112-606位氨基酸残基，以及Dl1092编码的多肽的变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述"相应序列片段"或"相应片段"是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。[0016]根据本发明，术语"HEV衣壳蛋白"是指，由HEV0RF2编码的蛋白，其能够组装成HEV病毒样颗粒。[0017]根据本发明，当在蛋白/多肽的背景中使用时，术语"变体"是指这样的蛋白，其氨基酸序列与参照蛋白/多肽(例如，本发明的HEV衣壳蛋白）的氨基酸序列具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个）氨基酸差异(例如，保守氨基酸置换)，或者具有至少60%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%的同一性，并且其保留了参照蛋白/多肽的必要特性。在本发明中，蛋白/多肽(例如，本发明的HEV衣壳蛋白）的必要特性可以指，具有组装成HEV病毒样颗粒的能力。[0018]根据本发明，术语"同一性"用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的"百分数同一性"是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目Xioo的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性（总共6个位置中有3个位置匹配）。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序（DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人（1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序（版本2.0)的E.Meyers和W.MiIler(Comput.ApplBiosci.,4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一'I"生。此外，可使用已整合入GCG软件包（可在www.gcg.com上获得）的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重（gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。[0019]如本文中使用的，术语"保守置换"意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学功能的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等）的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcadSetUSA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文）。[0020]如本文中使用的，术语"p239"、"239蛋白"或"p239蛋白"是指HEV0RF2片段aa368_aa606(其在aa368之前还包含由起始密码子编码的甲硫氨酸)，其具有组装成为HEVVLP的能力，可用于制备戊型肝炎疫苗，并且可用于研究HEVVLP的组装机制。[0021]如本文中使用的，术语"p495"、"p495蛋白"或"495蛋白"是指HEV0RF2片段aal12_aa606(其在aal12之前还包含由起始密码子编码的甲硫氨酸)，其具有组装成为HEVVLP的能力，可用于研究HEVVLP的组装机制、感染机制，并且可用于HEVVLP的结构生物学的研究。[0022]根据本发明，术语"病毒样颗粒（VLP)"是指不含病毒核酸的、在结构上与天然的病毒颗粒相似的空壳结构，其通常由病毒衣壳蛋白或其变体或片段组成。由于VLP在结构上与天然的病毒颗粒十分相似，因此，其具有很强的免疫原性和免疫反应性。同时，由于VLP不含病毒的遗传物质，因此，其不具有感染性。由于上述优点，VLP已被开发用作疫苗，其中一些VLP疫苗已经成功应用于临床，举例但不限于：Merck的四价VLPGardasil疫苗，P239VLP疫苗等等。VLP在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLP，并且能够将外源性抗原展示在其表面。此外，大部分VLP还具有包裹核酸或其他小分子的能力，因此，其还可作为基因或药物的运载工具。病毒样颗粒在本申请中也简称为颗粒。如本发明中使用的，当蛋白质在不存在变性因素的条件下能够组装成病毒样颗粒时，该蛋白质被称为"具有组装成病毒样颗粒的能力"。在本发明中，"变性因素"是指，能够使蛋白质发生变性的因素，其包括但不限于，高温(例如，加热)，变性剂(例如尿素）等等。[0023]根据本发明，术语"239颗粒"和"495颗粒"分别是指，由239蛋白形成的HEV病毒样颗粒，和由495蛋白或其突变体形成的HEV病毒样颗粒。[0024]根据本发明，术语"组装"是指病毒的结构蛋白（例如衣壳蛋白）之间或结构蛋白与核酸之间通过各种相互作用，形成有规则的颗粒状结构的过程，其包括天然病毒颗粒的组装和病毒样颗粒的组装。[0025]根据本发明，宿主细胞的破碎可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。[0026]根据本发明，各种缓冲液是本领域公知的，包括但不限于，磷酸盐缓冲液等等。[0027]根据本发明，术语"复溶缓冲液"是指，能够将蛋白质沉淀溶解的溶液，其是本领域技术人员公知的，包括但不限于Tris-HCl缓冲液。[0028]根据本发明，术语"组装溶液"是指，能够使病毒的衣壳蛋白组装成病毒样颗粒的溶液。其通常是包含盐的温和缓冲液，例如包含盐的磷酸盐缓冲液。特别优选的是，包含NaCl的磷酸盐缓冲液。[0029]可用于本发明的方法中的盐包括但不限于酸式盐，碱式盐，中性盐，例如碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐或磷酸氢盐,特别是NaCl、NH4CU(NH4)2S04、Na2S04中的一种或几种。根据本发明，特别优选的盐是NaCl。[0030]根据本发明，术语"多肽"和"蛋白质"具有相同的含义，可互换使用。根据本发明，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。在本申请中，除非明确指出或者根据上下文可以明确确定，否则在描述氨基酸残基的位置时，通常以HEV0RF2的序列为参照。例如，aa244是指，HEV0RF2的第244位氨基酸残基；H244是指，HEV0RF2的第244位氨基酸残基，组氨酸。又如，H244L是指，HEV0RF2的第244位氨基酸残基由组氨酸突变为亮氨酸。类似地，aal88、aa284、aa335、V188A、L284P、A335T等具有类似的含义。[0031]根据本发明，术语"药学可接受的载体和/或赋形剂"是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences.EditedbyGennaroAR,19thed.Pennsylvania:MackPublishingCompany,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80;佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂);离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。[0032]本发明至少部分基于本发明人的出人意料的发现：包含H244L突变（S卩，HEV0RF2的第244位氨基酸残基组氨酸被突变为亮氨酸)的p495蛋白突变体能够在大肠杆菌的培养上清中可溶性表达，并且能够在体外组装成HEV病毒样颗粒，并且由此获得的HEV病毒样颗粒具有优良的免疫原性和免疫反应性，可用于制备戊型肝炎疫苗。[0033]因此，在一个方面，本发明提供了一种p495蛋白的突变体，其包含HEV0RF2的aall2_aa606,并且在与HEV0RF2的aa244相对应的位点上包含亮氨酸。[0034]在一个优选的实施方案中，与野生型HEV0RF2的aall2_aa606相比，所述突变体还包含一个或多个另外的突变，例如1个、2个或3个另外的突变。在一个优选的实施方案中，所述一个或多个另外的突变位于选自下述的位点：与HEV0RF2的aal88、aa284和aa335相对应的位点。在一个优选的实施方案中，所述突变体包含，在与HEV0RF2的aal88相对应的位点上的丙氨酸，在与HEV0RF2的aa284相对应的位点上的脯氨酸，和/或在与HEV0RF2的aa335相对应的位点上的苏氨酸。[0035]在一个优选的实施方案中，所述突变体具有SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10所示的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述突变体具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。[0036]在另一个方面，本发明涉及编码本发明的突变体的多核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。[0037]可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。[0038]在另一个方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。然而，特别优选的是，本发明的宿主细胞为大肠杆菌细胞。[0039]在另一个方面，本发明涉及一种HEV病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒含有本发明的P495蛋白的突变体，或者由本发明的p495蛋白的突变体组成或形成。[0040]在一个特别优选的实施方案中，本发明的HEV病毒样颗粒包含具有SEQIDNO:2，4,6,8或10所示序列的p495蛋白的突变体，或由所述突变体组成或形成。[0041]在另一个方面，本发明还涉及包含上述P495蛋白的突变体，或上述多核苷酸或载体或宿主细胞或HEV病毒样颗粒的组合物。在一个优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的p495蛋白的突变体。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的HEV病毒样颗粒。[0042]在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物或疫苗，其包含本发明的HEV病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的药物组合物或疫苗可以用于预防或治疗HEV感染或由HEV感染所导致的疾病例如戊型肝炎等。[0043]在一个优选的实施方案中，所述HEV病毒样颗粒以预防或治疗HEV感染或戊型肝炎有效量存在。[0044]本发明的药物组合物或疫苗可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在本发明中，特别优选的施用方式是注射。[0045]在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗以单位剂量形式进行施用。例如但不意欲限定本发明，每单位剂量中包含的HEV病毒样颗粒的量为5μg-80μg，优选20μg-40μg。[0046]在另一个方面，本发明涉及一种制备本发明的p495蛋白的突变体的方法，其包括利用大肠杆菌表达系统可溶性表达本发明的突变体，然后将含有该突变体的裂解上清进行纯化处理。[0047]在一个优选的实施方案中，用于大肠杆菌表达系统的可溶性表达的条件例如可以是，15°C异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)诱导10小时、20°C异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)诱导8小时或25°C异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)诱导8小时。在进一步优选的实施方案中，所述表达条件是25°C异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)诱导8小时。[0048]在一个优选的实施方案中，所述纯化处理包括，向裂解上清中添加硫酸铵(优选饱和硫酸铵）以将蛋白质沉淀出来，然后使用复溶缓冲液将蛋白沉淀进行复溶，然后使用阴离子交换层析对复溶的蛋白质进行纯化，从而获得经纯化的P495蛋白的突变体。[0049]在一个优选的实施方案中，所添加的硫酸铵的终浓度例如可以是10%、20%、30%、40%或50%，特别优选地是30%。在一个优选的实施方案中，所述复溶缓冲液是Tris-HCl缓冲液。在一个优选的实施方案中，所述阴离子交换层析可以是DEAEFF阴离子交换层析。[0050]本发明还涉及一种制备本发明的HEV病毒样颗粒的方法，其在如上获得本发明的突变体的基础上，包括步骤：将经纯化的突变体透析至组装溶液中，并使其自组装成VLP。[0051]在一个优选的实施方案中，用于组装的温度例如可以是4°C、15°C、25°C或37°C，特别优选地是37°C。在一个优选的实施方案中，组装溶液是本领域技术人员公知的，例如包含盐的磷酸盐缓冲液，特别优选的是包含NaCl的磷酸盐缓冲液。在一个优选的实施方案中，所述磷酸盐缓冲液浓度例如可以是10mM、20mM、50mM或IOOmM,特别优选地是50mM。在一个优选的实施方案中，所述磷酸盐缓冲液包含〇.4MNaCl、0.5MNaCl或0.6MNaCl，特别地优选地包含0.5MNaCl。在一个优选的实施方案中，所述的磷酸盐缓冲液pH例如可以是5·5、6·0、6·5、7.0或7.5,特别优选地是6.5。[0052]本发明还涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的HEV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。如上所论述的，所获得的疫苗可以用于预防或治疗HEV感染或由HEV感染所导致的疾病例如戊型肝炎等。[0053]在另一个方面，本发明涉及一种预防或治疗HEV感染或由HEV感染所导致的疾病的方法，其包括将预防或治疗有效量的根据本发明的HEV病毒样颗粒或药物组合物或疫苗施用给受试者。在一个优选的实施方案中，所述由HEV感染所导致的疾病包括但不限于，戊型肝炎。在另一个优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。[0054]在另一个方面，还涉及根据本发明的突变体或HEV病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防或治疗HEV感染或由HEV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述由HEV感染所导致的疾病包括但不限于，戊型肝炎。[0055]发明的有益效果[0056]目前用于制备HEV病毒样颗粒的表达系统可以分为真核表达系统和原核表达系统。[0057]在真核表达系统中表达的HEV衣壳蛋白天然构象破坏少，能自发形成VLP，往往表达出来后即为具有正确构象的VLP。但目前真核表达系统例如杆状病毒表达系统和酵母表达系统存在表达量低，培养成本高等缺陷，给大规模工业化生产带来了极大困难，并且不利于在细胞内研究VLP的组装机制。对于疫苗研制，需尽可能去除颗粒中的杂质，如宿主蛋白或核酸，该方法无法提供体外组装方法，对去除杂质造成大的困难。[0058]在原核表达系统中，大肠杆菌表达系统具有培养成本低，表达量高等优点。然而，在大肠杆菌中表达的蛋白往往失去正确的天然构象，以包涵体形式表达于沉淀中。以包涵体形式表达于沉淀中的蛋白质(例如，P495蛋白）的复性是一个世界性难题。在很多情况下，难以在体外有效地对包涵体形式的蛋白质(例如，P495蛋白）进行复性，恢复其天然构象。[0059]本发明人出人意料地发现，当将p495蛋白中的HEV0RE2的aa244突变成亮氨酸时，所获得的突变体能够在大肠杆菌中可溶性地表达，并且能够在体外组装成病毒样颗粒。与现有技术相比，本发明的方法采用了高效、周期短的原核表达系统，并且通过体外组装获得了HEV病毒样颗粒，其不仅避免了成本高、周期长、且效率较低的真核细胞表达系统的使用，消除了在细胞内进行组装时在HEV病毒样颗粒中引入宿主蛋白或核酸等杂质的风险，并且能够表达长度更大的蛋白（aall2_606)，从而所获得的病毒样颗粒更加接近于野生型病毒，有利于被机体的免疫系统识别并诱发高效的免疫应答。所获得的HEV病毒样颗粒可用于戊型肝炎疫苗的研制，HEV的结构测定、HEV假病毒的制备、蛋白颗粒组装机制和病毒感染机制等的研究。通过与已上市的P239疫苗的平行比较，本申请证实，本发明方法所获得的HEV病毒样颗粒具有优良的免疫反应性和免疫原性，可以用于制备戊型肝炎疫苗。[0060]从上面的分析可知，本发明至少具有下述优点：首先，本发明使用大肠杆菌表达系统来表达HEV衣壳蛋白（P495蛋白），确保了高表达量和低成本；其次，本发明的方法提供无需变性的、可控的体外颗粒组装方法，并证实组装得到的HEVVLP具有良好的免疫反应性和免疫原性，与天然病毒颗粒形态相似，更适合于对天然病毒颗粒感染机制及其结构生物学等方面的研究；第三，本发明可表达与昆虫细胞表达的P495长度相同的蛋白，更接近于天然戊型肝炎病毒颗粒，且VLP组装方法操作简单易行。[0061]下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。【专利附图】【附图说明】[0062]图1显示了495蛋白及其突变体的表达情况。[0063]图IA显示了HEV新疆株的495蛋白在大肠杆菌中的表达情况(通过考马斯亮蓝染色检测)，其中，泳道1，495蛋白在15°C诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道2,495蛋白在15°C诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道3,495蛋白在25°C诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道4,495蛋白在25°C诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达。图IA的结果表明，495蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达，而基本上不能够以可溶形式表达于大肠杆菌培养物的裂解上清中。[0064]图IB显示了HEV新疆株的495蛋白的突变体1在大肠杆菌中的表达情况(通过Western印迹分析检测)，其中，泳道1，蛋白分子量标记；泳道2,495蛋白在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道3,突变体1在15°C诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道4,突变体1在15°C诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体上清中的表达；泳道5,突变体1在20°C诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道6,突变体1在20°C诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体上清中的表达；泳道7,突变体1在25°C诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道8,突变体1在25°C诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体上清中的表达。图IB的结果表明，495蛋白的突变体1在大肠杆菌中主要以可溶形式表达于裂解上清中，而基本上不以包涵体形式进行表达。[0065]图IC显示了HEV新疆株的495蛋白的突变体2-5在大肠杆菌中的表达情况(通过Western印迹分析检测)，其中，泳道1:突变体2在大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道2:突变体2在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道3:突变体3在大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道4:突变体3在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道5:突变体4在大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道6:突变体4在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道7:突变体5在大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道8:突变体5在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达。图IC的结果表明，495蛋白的突变体2-5在大肠杆菌中主要以可溶形式表达于裂解上清中，而基本上不以包涵体形式进行表达。[0066]图ID显示了HEV新疆株的495蛋白的突变体6在大肠杆菌中的表达情况(通过Western印迹分析检测)，其中，泳道1，495蛋白对照；泳道2,突变体6在37°C诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道3,突变体6在37°C诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道4,突变体6在25°C诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道5,突变体6在25°C诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道6,突变体6在20°C诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道7,突变体6在20°C诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道8,突变体6在15°C诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道9,突变体6在15°C诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达。图ID的结果显示，495蛋白的突变体6在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达，而基本上不能够以可溶形式表达于大肠杆菌培养物的裂解上清中。[0067]图2显示了含有495蛋白突变体1的裂解上清的饱和硫酸铵沉淀。泳道1，蛋白分子量标记；泳道2,495蛋白的包涵体形式的对照；泳道3,使用10%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀；泳道4,使用20%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀；泳道5,使用30%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀；泳道6,使用40%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀；泳道7,使用50%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀。结果显示，10-50%的饱和硫酸铵溶液均能够沉淀上清中的蛋白，并且30%的饱和硫酸铵溶液沉淀效果较好。[0068]图3显示了495蛋白突变体1的饱和硫酸铵沉淀用不同缓冲液进行的复溶。泳道1，蛋白分子量标记；泳道2,用20mMTBpH9.0复溶后的沉淀；泳道3,用20mMTBpH9.0复溶后的上清；泳道4,用20mMTBpH8.5复溶后的沉淀；泳道5,用20mMTBpH8.5复溶后的上清；泳道6,用20mMTBpH8.0复溶后的沉淀；泳道7,用20mMTBpH8.0复溶后的上清；泳道8,495蛋白的包涵体形式的对照。结果显示，所使用的各种缓冲液均能够复溶突变体1的饱和硫酸铵沉淀，并且20mMTBpH8.5的复溶效果较好。[0069]图4A显示了495蛋白突变体1的DEAE柱层析纯化图谱。柱平衡缓冲液：20mMTB8.5;洗脱缓冲液：20mMTB8.5+0.1M/U3M/0.5M/1MNaCl;层析介质为DEAEFastFlow。[0070]图4B:495蛋白突变体1的DEAE柱层析纯化过程中收集的各级分的SDS-PAGE分析。泳道1，蛋白分子量标记；泳道2,用20mMTB8.5复溶后的上清；泳道3,穿透样品；泳道4,DEAE-FF层析的IOOmMNaCl洗脱级分；泳道5,DEAE-FF层析的300mMNaCl洗脱级分；泳道6,DEAE-FF层析的500mMNaCl洗脱级分；泳道7,DEAE-FF层析的IMNaCl洗脱级分；泳道8，DEAE-FF层析的IOOmMNaOH洗脱级分。结果显示，495蛋白突变体1主要集中于IOOmMNaCl洗脱级分中。[0071]图5A显示，经纯化的495蛋白突变体1的SDS-PAGE分析。泳道1，蛋白分子量标记；泳道2,未经沸水浴处理的经纯化的495蛋白突变体1;泳道3,经沸水浴处理10分钟的经纯化的495蛋白突变体1。[0072]图5B显示了经纯化的495蛋白突变体1的分子筛层析。min:分钟，下同；对照蛋白为E2蛋白。[0073]图5的结果显示，纯化后的495蛋白突变体1在溶液中主要以二聚体形式存在，并且不存在颗粒组分。[0074]图6A显示，盐浓度对495蛋白突变体1的颗粒组装的影响。选取的盐浓度为0.1M、0·3Μ、0·4Μ、0·5Μ、0·6M、1M。[0075]图6B显示，缓冲液的pH值对495蛋白突变体I的颗粒组装的影响。选取的pH为4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。[0076]图6C显示，温度对495蛋白突变体1的颗粒组装的影响。选取的温度为4°C、15°C、25°C、37°C。[0077]图6D显示，磷酸盐溶液的浓度对495蛋白突变体1的颗粒组装的影响。选取的磷酸盐缓冲液浓度为10mM、20mM、50mM、100mM。[0078]图7A显示了495颗粒的电镜观察结果。条棒（Bar)，100nm。[0079]图7B显示了495颗粒的分子筛层析结果。对照为239颗粒。[0080]图7C显示了495颗粒的动态光散射分析结果。[0081]图7D显示了495颗粒的沉降速率分析结果。[0082]图7E-7G显示了由突变体2-4形成的VLP的透射电镜观察结果。[0083]图8显示了495颗粒与各种HEV(I)特异性抗体的WB反应活性。所使用的抗体1-10(对应于泳道1-10)分别为：8C11、8G12、8H3、9F7、6F8、12A10、16D7、4A6、1B7、3G4。[0084]图9显示了495颗粒与HEV(I)特异性抗体的Elisa反应活性。所使用的抗体分别为：8C11、8G12、8H3、9F7、6F8、12A10、16D7、4A6、1B7、3G4;对照为239颗粒。[0085]图10显示了495颗粒与HEV(I)特异性抗体8C11的EC50分析。8C11初始浓度为4000ng/ml，连续两倍系列稀释24个梯度；对照为239颗粒。[0086]图11显示了495颗粒与HEV(I)特异性抗体8C11的WB反应活性。8C11稀释比例为1:2K;对照为239颗粒。[0087]图8-11的结果显示，由495蛋白突变体1组装的HEVVLP保留了良好的免疫反应性，能够被多种HEV特异性抗体所识别。[0088]图12显示了495颗粒吸附细胞的能力。阻断抗体为8C11，检测抗体为16D7,稀释比例为1:2Κ;对照为239颗粒。结果显示，495颗粒和239颗粒均能够吸附进入细胞，并且该过程能够被阻断抗体(例如单抗8C11)所阻断。[0089]图13显示了495假病毒的电镜观察结果。条棒（Bar)，lOOnm。[0090]图14显示了495假病毒的分子筛层析分析。A:495颗粒的双波长检测结果；B:N31-GFP质粒的双波长检测结果；C:495颗粒包裹N31-GFP质粒(形成假病毒）后的双波长检测结果；检测波长为260nm和280nm。结果显示，495颗粒能够包裹N31-GFP质粒，形成495假病毒，并且495假病毒的保留时间为10.8min。[0091]图15显示了495假病毒转染HepG2后的倒置荧光显微镜观察结果。图15A:单独的GFP质粒可成功转染H印G2细胞；图15B:495假病毒吸附细胞三天后的倒置荧光显微镜观察结果；图15C:495假病毒吸附细胞七天后的倒置荧光显微镜观察结果。结果显示，495假病毒能够感染H印G2细胞，并在细胞中表达报道基因GFP。[0092]图16显示了495颗粒的免疫原性。对照为239颗粒。使用的剂量分别为0.5ug(图16A)和5ug(图16B)。结果显示，495颗粒具有与239颗粒相似的免疫原性，均能够引发机体产生中和抗体。此外，结果还显示，在低剂量（〇.5ug)下，495颗粒甚至具有比239颗粒更高的免疫原性。[0093]序列信息[0094]本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。[0095]表1:序列的描述[0096]【权利要求】1.一种p495蛋白的突变体，其包含HEV0RF2的aall2-aa606,并且在与HEV0RF2的aa244相对应的位点上包含亮氨酸；任选地，与野生型HEV0RF2的aall2_aa606相比，所述突变体还包含一个或多个另外的突变，例如1个、2个或3个另外的突变；优选地，所述一个或多个另外的突变位于选自下述的位点：与HEV0RF2的aal88、aa284和aa335相对应的位点；优选地，所述突变体还包含，在与HEV0RF2的aal88相对应的位点上的丙氨酸，在与HEV0RF2的aa284相对应的位点上的脯氨酸，和/或在与HEV0RF2的aa335相对应的位点上的苏氨酸；优选地，所述突变体具有SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8或SEQIDNO:10所示的氨基酸序列；优选地，所述突变体具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。2.-种分离的核酸，其编码权利要求1的突变体。3.包含权利要求2的分离的核酸的载体。4.包含权利要求2的分离的核酸和/或权利要求3的载体的宿主细胞。5.-种HEV病毒样颗粒，其含有权利要求1的突变体，或者由权利要求1的突变体组成。6.-种组合物，其包含权利要求1的突变体，或权利要求2的分离的核酸，或权利要求3的载体，或权利要求4的宿主细胞，或权利要求5的HEV病毒样颗粒。7.-种药物组合物或疫苗，其包含权利要求5的HEV病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂，优选地，所述HEV病毒样颗粒以预防或治疗HEV感染或戊型肝炎有效量存在。8.制备权利要求1的p495蛋白的突变体的方法，其包括，利用大肠杆菌表达系统可溶性表达所述突变体,然后将含有该突变体的裂解上清进行纯化处理；优选地，用于大肠杆菌表达系统的可溶性表达的条件例如可以是，15°C异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)诱导10小时、20°C异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)诱导8小时或25°C异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)诱导8小时；优选地，所述纯化处理包括，向裂解上清中添加硫酸铵(优选饱和硫酸铵）以将蛋白质沉淀出来，然后使用复溶缓冲液将蛋白沉淀进行复溶，然后使用阴离子交换层析对复溶的蛋白质进行纯化，从而获得经纯化的P495蛋白的突变体。9.一种制备HEV病毒样颗粒的方法，其包括，将权利要求1的突变体透析至组装溶液中，并使其自组装成VLP;优选地，所述突变体是通过权利要求8的方法制备获得的经纯化的突变体。10.-种制备疫苗的方法，其包括将权利要求5的HEV病毒样颗粒或通过权利要求9的方法获得的HEV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。11.一种预防或治疗HEV感染或由HEV感染所导致的疾病的方法，其包括将预防或治疗有效量的权利要求5的HEV病毒样颗粒，或通过权利要求9的方法获得的HEV病毒样颗粒，或权利要求7的药物组合物或疫苗，或通过权利要求10的方法获得的疫苗施用给受试者，优选地，所述由HEV感染所导致的疾病是戊型肝炎。12.权利要求1的突变体，或权利要求5的HEV病毒样颗粒，或通过权利要求8的方法获得的突变体，或通过权利要求9的方法获得的HEV病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防或治疗HEV感染或由HEV感染所导致的疾病，优选地，所述由HEV感染所导致的疾病是戊型肝炎。【文档编号】A61K39/29GK104211784SQ201310218823【公开日】2014年12月17日申请日期:2013年6月4日优先权日:2013年6月4日【发明者】李少伟,王楠,张晓,王凯航,郑明华,夏宁邵申请人:厦门大学,厦门万泰沧海生物技术有限公司