一种疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的猪圆环病毒2型抗原、免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪细小病毒抗原以及兽医学上可接受的载体。该疫苗组合物各抗原之间基本无相互干扰现象，甚至还出现一定的免疫协同作用，免疫后应激小，更为安全，免疫效果优于单苗的使用效果，而且避免了多次接种带来的应激反应，简化了繁琐的免疫程序，降低了防疫成本。
CCTCC No： V201118
2011.06.09
【专利说明】一种疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种三联疫苗，属于兽用生物制品领域。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒病或称猪圆环病毒相关性疾病是主要由猪2型圆环病毒（Porcine circ〇Viru2, PCV2)引起的免疫抑制性疾病，表现为断奶后仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎 肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍、仔猪心肌炎、增生性和坏死性肺炎和中枢神 经系统疾病等。猪圆环病毒是近几年新出现的一种危害养猪业较为严重的病原，是迄今发 现的一种最小的DNA病毒，对外界环境的抵抗力较强，猪群一旦感染猪圆环病毒就很难根 除。
[0003] 猪繁殖与呼吸道综合征，俗称猪蓝耳病，最早于1987年在美国报道，而后迅速蔓 延至欧洲及世界各地，我国最早在1996年报道该病存在，随后十几年间在全国各地猪场蔓 延，造成大量妊娠母猪流产、产死胎、产木乃伊胎以及仔猪出现呼吸道症状和死亡现象，给 我国养猪业构成很大的威胁。目前尚无治疗该病的特效药物，因此接种疫苗成为预防该病 的主要措施。
[0004] 猪细小病毒病由猪细小病毒（PPV)引起的母猪繁殖障碍疾病，特征是孕猪在怀孕 早期受到猪细小病毒感染经胎盘或胎儿引起母猪流产，不孕，产死胎、畸形胎及木乃伊胎 等。猪细小病在我国污染十分严重，阳性率达90%以上，几乎很难找到一个PPV阴性的猪场。 对养猪业造成长期重大的经济损失，严重阻碍了世界养猪业的健康发展。目前PPV尚无有 效的药物治疗方法，因此对该病的预防免疫就显的至关重要了。
[0005] 目前现有技术中预防PCV2, PRRSV和PPV的感染主要依赖于疫苗免疫，尚无特效药 物。市售有PCV2灭活疫苗、PPV灭活苗，PRRSV灭活以及活疫苗，但是并无 PCV2-PRRSV-PPV 三联疫苗"产品生产和销售。该预防方法需要分次免疫，至少需要免疫两针才能防止断奶仔 猪多系统综合征和母猪的繁殖障碍性疾病，成本高，操作程序繁琐，使感染的风险加大，弓丨 起猪群的应激反应加大，不同疫苗使用还会造成免疫干扰导致部分猪群免疫失败等问题。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种含有猪圆环病毒2型、猪蓝耳病病毒 和猪细小病毒抗原成分的三联灭活疫苗及其制备方法，该疫苗能有效的防治由此三种病毒 混合感染引起的断奶仔猪多系统综合征和母猪繁殖障碍性疾病。该三联疫苗组合物的免疫 效果等同于各单苗的效果，三价疫苗之间无免疫干扰，副反应小，血清抗体效价高，免疫期 持续长，耗时少，费力少，对猪的影响也小。这样既简化了免疫程序，又降低生产成本、运输 成本以及预防成本，实用性强。
[0007] 本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量 的猪圆环病毒2型抗原、免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪细小病毒抗原以及兽 医学上可接受的载体。
[0008] 本发明所述猪圆环病毒2型抗原是指包含至少一种猪圆环病毒2型抗原形式的任 何组合物。所述猪圆环病毒2型抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。 所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪圆环病毒2型全病 毒抗原，含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，含有猪圆环病毒2型免疫原 性氨基酸序列的多肽或亚单位成分。
[0009] 所述猪圆环病毒抗原可以是江苏南农高科猪圆环病毒2型灭活疫苗的SH株、成都 天邦和福州大北农猪圆环病毒2型灭活疫苗的DBN-SX07株、哈尔滨维科猪圆环病毒2型灭 活疫苗的LG株、武汉科前猪圆环病毒2型灭活疫苗的WH株中的一种或几种。
[0010] 本发明的猪繁殖与呼吸综合征抗原是指含有至少一种猪繁殖与呼吸综合征抗原 形式的任何组合物，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪繁殖与呼吸综合征感染的 免疫应答。优选地，所述的猪繁殖与呼吸综合征抗原为灭活形式、减毒形式的猪繁殖与呼吸 综合征全病毒，含有猪繁殖与呼吸综合征免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它至少 含猪繁殖与呼吸综合征免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成分。
[0011] 所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒可以是中国动物预防控制中心研制并由广东 大华农动物保健品股份有限公司等生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R 株）；南京农业大学研制并由江苏南农高科技股份有限公司等生产的猪繁殖与呼吸综合症 活疫苗（R98);中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制并由哈药集团生物疫苗有限公司等 生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（HUN4-F112株）；新疆天康畜牧生物技术股份 有限公司研制并生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（TJM-F92株）等中的一种或 几种。
[0012] 本发明的猪细小病毒抗原是指含有至少一种猪细小病毒抗原形式的任何组合物， 所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪细小病毒感染的免疫应答。优选地，所述的猪细 小病毒抗原为灭活形式、减毒形式的猪细小病毒全病毒，含有猪细小病毒免疫原性氨基酸 序列的嵌合病毒，任何其它至少含猪细小病毒免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他 成分。
[0013] 所述的猪细小病毒抗原可以是以下组合物中的任一种抗原，如：辉瑞公司生产的 PPV灭活疫苗，武汉中博生物股份有限公司的PPV灭活疫苗CP-99株，中牧实业股份有限公 司的PPV灭活疫苗WH-I株，上海科立特农科（集团）有限公司的猪细小病毒油乳剂灭活疫 苗。
[0014] 优选地，所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活全病毒抗原，所述猪繁殖 与呼吸综合征病毒抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活全病毒抗原，所述猪细小病毒抗原 为猪细小病毒灭活全病毒抗原。
[0015] 更优选地，所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型SH株灭活全病毒抗原，所 述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株灭活全病毒抗 原，所述猪细小病毒抗原为猪细小病毒HN-2011株灭活全病毒抗原。
[0016] PCV2SH株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日 期：2008年3月4日，保藏号为CGMCC No. 2389,公开于中国专利申请CN101240264A。
[0017] NVDC-JXAl株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保 藏日期：2007年3月9日，保藏号为CGMCC No. 1964,公开于中国专利申请CN101045917A。
[0018] HN-2011株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期：2011年6月9日， 保藏号为CCTCC No. V201118,保藏地址为中国武汉?武汉大学。
[0019] 本发明实施例仅用所述的猪圆环病毒2型抗原为PCV2SH株灭活株，所述猪繁殖与 呼吸综合征抗原为猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株，所述猪细小病毒抗原为猪细小病毒 HN-2011株灭活株，进一步说明本发明的发明目的。
[0020] 优选地，所述猪圆环病毒2型全病毒抗原含量为5X 105 5?107_°TCID5(l/ml，所述猪 繁殖与呼吸综合征病毒全病毒抗原含量为1〇 7_°?l〇9_°TCID5(l/ml，所述猪细小病毒全病毒抗 原含量为 1〇6 ° ?l〇8 °TCID5(l/ml。
[0021] 更优选地，所述猪圆环病毒2型全病毒抗原含量为106 5TCID5(l/ml，所述猪繁殖 与呼吸综合征病毒全病毒抗原含量为l〇8_°TCID 5(l/ml，所述猪细小病毒全病毒抗原含量为 IO7.0TCID50Ail。
[0022] 优选地，本发明疫苗组合物中，猪圆环病毒SH株灭活前含量为106_°?IO 7 tlTCID5ci/ ml，PRRSV NVDC-JXAl 株灭活前含量达 107_° ?109_°TCID5(l/ml，PPV HN-2011 株灭活前含量为 106_°?108_°TCID5(l/ml ;更优选地，本发明中猪圆环病毒SH株抗原灭活前含量为IO6 5TCID5tl/ ml，PRRSV 灭活前含量达 l(f°TCID5Q/ml，PPVHN-2011 株灭活前含量为 107 °TCID5Q/ml。
[0023] 优选地，所述兽医学上可接受的载体包括佐剂和赋形剂；所述佐剂为ISA206、氢 氧化铝胶、矿物油、卡波姆、GelOU蜂胶、ISA760VG的一种或几种组合物。
[0024] 其中，免疫佐剂为氢氧化错胶、矿物油、卡波姆（Carbomer)(商品名Carbopol)、 GelOl (法国 SEPPIC)、蜂胶、ISA206(法国 SEPPIC)、ISA760VG (法国 SEPPIC)，优选卡波姆 (Carbomer)(商品名 Carbopol)、Gel01 (法国 SEPPIC)、ISA206(法国 SEPPIC)、ISA760VG (法 国 SEPPIC)，更优选 GelOl (法国 SEPPIC)、ISA206(法国 SEPPIC)，更优选为 ISA206(法国 SEPPIC)。
[0025] 本发明的另一目的在于提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括：
[0026] 1)培养增殖猪圆环病毒2型，灭活；2)培养增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒，灭活； 3)培养增殖猪细小病毒，灭活；4)按比例混合所述猪圆环病毒2型全病毒抗原、所述猪繁殖 与呼吸综合征病毒全病毒抗原、所述猪细小病毒全病毒抗原以及佐剂。
[0027] 优选地，所述猪圆环病毒2型全病毒抗原、所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒 抗原、所述猪细小病毒全病毒抗原体积比为1:1:1。
[0028] 优选地，本发明中所述的制备方法，其中灭活方法为甲醛灭活，本发明的甲醛溶液 (以40%体积的含量计），浓度为0· 1%_0· 2%(V/V)。
[0029] 本发明的再一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和治疗由混合感染引 起的断奶仔猪多系统综合征和母猪繁殖障碍疾病的药物中的应用。
[0030] 本发明所述的猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸道综合征病毒和猪细小病毒三联灭 活苗，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便，与现有技术中的分次免疫相比，各抗原 之间基本无相互干扰现象，甚至还出现一定的免疫协同作用，免疫后应激小，更为安全，免 疫效果优于单苗的使用效果，而且避免了多次接种带来的应激反应，简化了繁琐的免疫程 序，降低了防疫成本。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0032] 本发明实施例中分别以PCV2SH株、PRRSV NVDC-JXA1株、PPV HN-2011株说明本发 明。
[0033] 实施例1、猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒和猪细小病毒三联灭活疫苗组合物，猪乙 型脑炎病毒和猪细小病毒二联苗的制备和检验
[0034] 1.毒株的来源
[0035] 本发明的三联疫苗中所述的PCV2病毒为PCV2SH株，已在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCC No2389。
[0036] 本发明的三联苗所述的PRRSV毒株为NVDC-JXAl株，已在中国普通微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2007年3月9日，保藏号为CGMCC Nol964。
[0037] 本发明的三联疫苗所述的PPV毒株为HN-2011株，已在中国典型培养物保藏中心 进行保藏，保藏日期=2011年6月9日，保藏号为CCTCC No V201118。
[0038] 2.疫苗半成品的制备及检验
[0039] 2. 1生产用毒种的制备
[0040] 2. I. 1猪圆环病毒2型SH株的制备：将PCV2SH株毒种用病毒稀释液（即无血清 MEM培养基）适当稀释，以0. 01M0I (感染复数）接种于长满单层的PK-15细胞培养，37°C吸 附30min，加入含4%(v/v)犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液， 37°C培养4日，冻融2?3次，收获病毒。
[0041] 2. 1. 2猪繁殖与呼吸综合征病毒的制备：将JEV NVDC-JXAl株毒种用病毒稀释液 (即无血清MEM培养基）适当稀释，以0· 01M0I (感染复数）接种于长满单层的Marc-145细 胞培养，37°C吸附lh，加入含4%(v/v)犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细 胞维持液，37°C培养4日，冻融2?3次，收获病毒。
[0042] 2. L 3猪细小病毒HN-2011株的制备：将PPV HN-2011株毒种用病毒稀释液（即 无血清的a -MEM培养基）适当稀释，以0. 01M0I (感染复数）接种于长满单层的ST细胞培 养，37°C吸附30min，加入含1%(ν/ν)犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞 维持液，37°C培养4日，冻融2?3次，收获病毒。
[0043] 2. 2病毒液的培养制备
[0044] 2. 2. 1猪圆环病毒2型SH株的制备：采用转瓶细胞培养法，将长满单层的PK-15细 胞，倒去细胞培养液，将毒种液按〇. 01M0I的接种量接种于PK-15细胞上，轻轻旋转细胞瓶 2周，37°C吸附30min，加入细胞维持液，置37°C旋转（10?12转/小时）培养。每日观察 1?2次，细胞生长良好，37°C培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20°C以下保存，应 不超过2个月。
[0045] 2. 2. 2猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株病毒液的制备：用转瓶细胞培养法。 将长满单层的Marc-145细胞，倒去细胞培养液，将毒种液按0. 01M0I的接种量接种于BHK 细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37°C吸附30min，加入细胞维持液，置37°C旋转（10?12转 /小时）培养。每日观察1?2次，细胞生长良好，37°C培养4日收获细胞和细胞液，冻融3 次，置-20°C以下保存，应不超过2个月。
[0046] 2. 2. 3猪细小病毒HN-2011株病毒液的制备：用转瓶细胞培养法。将长满单层的 ST细胞，倒去细胞培养液，将毒种液按0. 01M0I的接种量接种于ST细胞上，轻轻旋转细胞瓶 2周，37°C吸附30min，加入细胞维持液，置37°C旋转（10?12转/小时）培养。每日观察 1?2次，细胞生长良好，37°C培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20°C以下保存，应 不超过2个月。
[0047] 2. 3病毒液的过滤与浓缩
[0048] 猪圆环病毒2型SH株病毒液、猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株病毒液和猪 细小病毒HN-2011株病毒液分别用中空纤维滤柱（孔径10 μ m与0. 45 μ m)过滤，除去细胞 碎片。过滤后用超滤浓缩系统进行浓缩。
[0049] 2. 4病毒含量测定
[0050] 三种抗原浓缩后含量的测定结果
[0051] 按常规方法分别测定PCV2SH株、PRRSV NVDC-JXAl株和PPVHN-2011株病毒抗原含 量，PCV2SH 病毒液含量为 108_°TCID5Q/ml，PRRSV NVDC-JXA1 株病毒液的含量为 IOiq qTCID5q/ ml，PPVHN-2011 株病毒液含量为 Kf °TCID5Q/ml。
[0052] 表1各抗原浓缩后含量
[0053]
【权利要求】
1. 一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪圆环病毒2型抗原、免疫量 的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪细小病毒抗原以及兽医学上可接受的载体。
2. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2 型灭活全病毒抗原，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活全 病毒抗原，所述猪细小病毒抗原为猪细小病毒灭活全病毒抗原。
3. 根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒 2型SH株灭活全病毒抗原，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒 NVDC-JXA1株灭活全病毒抗原,所述猪细小病毒抗原为猪细小病毒HN-2011株灭活全病毒 抗原。
4. 根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒2型全病毒抗原含量 为5X 105 5?107_°TCID5(l/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒抗原含量为10 7_°? 109_°TCID5(l/ml，所述猪细小病毒全病毒抗原含量为10 6_°?108_°TCID5(l/ml。
5. 根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒2型全病毒抗原含量为 106_ 5TCID5(l/ml，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒抗原含量为108_ °TCID5(l/ml，所述猪细 小病毒全病毒抗原含量为l〇7_°TCID 5(l/ml。
6. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述兽医学上可接受的载体包括佐剂和 赋形剂；所述佐剂为ISA206、氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、GelOl、蜂胶、ISA760VG的一种或 几种组合物。
7. -种制备权利要求1所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括： 1) 培养增殖猪圆环病毒2型，灭活； 2) 培养增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒，灭活； 3) 培养增殖猪细小病毒,灭活； 4) 按比例混合所述猪圆环病毒2型全病毒抗原、所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒 抗原、所述猪细小病毒全病毒抗原以及佐剂。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其中，所述猪圆环病毒2型全病毒抗原、所述猪繁 殖与呼吸综合征病毒全病毒抗原、所述猪细小病毒全病毒抗原体积比为1:1:1。
9. 根据权利要求1?6所述的疫苗组合物在制备预防和治疗由混合感染引起的断奶仔 猪多系统综合征和母猪繁殖障碍疾病的药物中的应用。
【文档编号】A61P31/14GK104288760SQ201310304095
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月18日 优先权日:2013年7月18日
【发明者】张许科, 孙进忠, 田克恭 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司