一种疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含免疫量的番鸭细小病毒抗原和免疫量的番鸭细小病毒抗体。该疫苗组合物既可应用于雏番鸭的免疫，也可直接应用于番鸭胚免疫，且免疫效果不受母源抗体的影响，且免疫力产生速度更快，在免疫后第2天即可产生理想的保护，使用强毒攻击后，免疫鸭5/5无发病，而对照鸭则5/5发病死亡。
【专利说明】一种疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于预防番鸭细小病毒病的疫苗组合物。
【背景技术】
[0002] 番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒（MPV)引起的雏番鸭的一种传染病，该病主要 侵害1?3周龄的雏番鸭，俗称"三周病"。其发病率为26%?62%，病死率为22%?43%，病 愈鸭大部分成为僵鸭，给养鸭业带来一定损失。该病具有高度传染性，多以腹泻、喘气和进 行性消瘦及脚发软为主要症状。
[0003] 目前对番鸭细小病毒病的预防主要是使用番鸭细小病毒病弱毒活疫苗，这其中的 弱毒活疫苗由于免疫力产生速度快，因而得到了较为广泛的应用。但由于活疫苗受母源抗 体的影响较大，而雏番鸭或高或低总会从种鸭获取部分的母源抗体，因此活疫苗的免疫也 受到了母源抗体的影响。此外，也有少量的灭活疫苗在使用。
[0004] 番鸭细小病毒可在番鸭胚和鹅胚中繁殖，因此，使用番鸭胚或者鹅胚培养的方法 即可获取番鸭细小病毒的全病毒，并且使用该全病毒可制备相应的抗血清和蛋黄抗体。MPV 属于细小病毒科细小病毒属，与鹅细小病毒（GPV)-样，具有3种结构多肽，VPl(91ku)、VP2 (78ku)和VP3 (61ku)，其中VP2为MPV的主要免疫保护抗原，能够诱导机体产生中和抗体。 在无 VPl存在的情况下，VP2蛋白可自我组装成具有免疫原性，而不具有传染性的病毒样颗 粒。已有文献报道，使用真核表达系统(毕赤酵母表达、昆虫细胞表达）和原核表达系统(大 肠杆菌表达)表达MPV的VP2蛋白，获取具有免疫原性的蛋白。使用表达的免疫原蛋白同样 可以制备多抗血清或者多克隆蛋黄抗体。
[0005] 有关已公开的番鸭细小病毒抗原相关关键技术有：
[0006] (1)免疫原性蛋白VP2的表达
[0007] 已有文献报道，使用大肠杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统和昆虫细胞表达系统 表达番鸭细小病毒的VP2蛋白。
[0008] (2)多克隆抗体的制备
[0009] 使用制备的全病毒或者免疫原蛋白，加入适当佐剂制备疫苗，免疫动物或者种禽， 收集免疫动物的血清或者种禽所下的种蛋，即可制得多克隆抗血清和多克隆蛋黄抗体。
[0010] (3)抗原和抗体复合物的配制方法
[0011] 将制备的番鸭细小病毒全病毒的活病毒或者具有免疫原性的VP2蛋白，按适当比 例与相应的多克隆抗血清或者多克隆蛋黄抗体混合孵育，即可制成抗原和抗体复合物。
[0012] 福建省农业科学院畜牧兽医研究所利用番鸭细小病毒弱毒Pl株和番鸭源鹅细小 病毒弱毒D株为种毒，经增殖后按一定比例混合，制成能够同时预防和控制番鸭细小病毒 病和番鸭小鹅瘟病的二联活疫苗(福建省农业科学院畜牧兽医研究所，番鸭细小新型疫苗 的制备方法：中国，1〇1880651Α[Ρ]，2010. 11. 10)。然而，由于雏鸭普遍存在针对番鸭细小 病毒的母源抗体，弱毒活疫苗的免疫效果会受到较大程度的影响。其次，使用该发明制备的 疫苗免疫1日龄雏番鸭，雏番鸭在免疫后7天才能产生针对强毒的保护，虽然免疫鸭使用强 毒攻击后10/10无发病，而对7日龄之前的攻毒并不能产生理想的保护。
[0013] 王永坤等人利用番鸭细小病毒M91-G27株接种鹅胚，收获感染鹅胚液，制备番鸭 细小病毒冻干活疫苗，使用该疫苗免疫1日龄雏番鸭，在免后10天可提供较为理想的保护 (王永坤，钱钟，钱淑美等，雏番鸭细小病毒和小鹅瘟病毒特性比较及二联活苗的应用[J]， 中国禽业导刊，2004, 21 (9) : 18-20)。然而，由于雏鸭普遍存在针对番鸭细小病毒的母源抗 体，弱毒活疫苗的免疫效果会受到较大程度的影响。
【发明内容】
[0014] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种番鸭细小病毒抗原和番鸭细小病毒的 疫苗组合物，该疫苗组合物既可应用于雏番鸭的免疫，也可直接应用于番鸭胚免疫，且免疫 效果不受母源抗体的影响。
[0015] 本发明使用抗原抗体复合物技术所制备的番鸭细小病毒病疫苗组合物，能够克服 母源抗体的影响，并且免疫力产生速度更快，在免疫后第2天即可产生理想的保护，使用强 毒攻击后，免疫鸭5/5无发病，而对照鸭则5/5发病死亡。
[0016] 本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量 的番鸭细小病毒抗原和免疫量的番鸭细小病毒抗体。
[0017] 本发明所指的番鸭细小病毒抗原是指：包含至少一种对番鸭给药后能诱导、刺激 或增强抗番鸭细小病毒感染的免疫应答的抗原的任何组合物。本发明所指的番鸭细小病毒 抗体是指：含至少一个，优选两个重链可变区（VH)和/或至少一个，优选两个轻链可变区 (VL)的蛋白，且该蛋白重链和轻链的可变区含有可与番鸭细小病毒VP2蛋白相互结合的区 域。
[0018] 优选地，所述番鸭细小病毒抗原为番鸭细小病毒全病毒，优选灭活形式、改良的活 的形式或减毒形式的番鸭细小病毒，含有至少番鸭细小病毒的免疫原性氨基酸序列的嵌合 病毒，任何其它含至少番鸭细小病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽或蛋白；所述番鸭细小 病毒抗体为使用番鸭细小病毒抗原制备的蛋黄抗体和/或抗血清。
[0019] 更优选地，所述番鸭细小病毒抗原为减毒形式的番鸭细小病毒活病毒或番鸭细小 病毒VP2蛋白；所述番鸭细小病毒抗体为使用减毒形式的番鸭细小病毒活病毒或番鸭细小 病毒VP2蛋白制备的蛋黄抗体和/或抗血清。
[0020] 进一步优选，所述番鸭细小病毒抗原为番鸭细小病毒M91-G27株，番鸭细小病毒 Pl株，番细小病毒Q株活病毒，或为番鸭细小病毒M91-G27株，番鸭细小病毒Pl株，番细小 病毒Q株VP2蛋白；所述番鸭细小病毒抗体为使用番鸭细小病毒M91-G27株，番鸭细小病毒 Pl株，番细小病毒Q株灭活疫苗制备的蛋黄抗体和/或抗血清，或为番鸭细小病毒M91-G27 株，番鸭细小病毒Pl株，番细小病毒Q株VP2蛋白制备的蛋黄抗体和/或抗血清。
[0021] 更优选地，所述番鸭细小病毒抗原含量为5?IO5ELD5tlA). 2ml或所述番鸭细小病 毒抗原含量为VP2蛋白1?100ng/ml ;所述番鸭细小病毒抗体LPAI抗体滴度为1 : 2? 1 : 90。
[0022] 本发明的另一目的在于提供一种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法，所述方 法包括：
[0023] 1)增殖培养所述减毒形式的番鸭细小病毒活病毒；2)用所述番鸭细小病毒灭活疫 苗制备蛋黄抗体或用所述番鸭细小病毒灭活疫苗制备抗血清；3)按比例配制所述番鸭细小 病毒活病毒抗原和所述番鸭细小病毒抗体组合物。
[0024] 本发明的再一目的在于提供一种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法，所述方 法包括：
[0025] 1)表达所述番鸭细小病毒VP2蛋白；2)用所述番鸭细小病毒灭活疫苗制备蛋黄抗 体或用所述番鸭细小病毒灭活疫苗制备抗血清；3)按比例配制所述番鸭细小病毒活病毒抗 原和所述番鸭细小病毒抗体组合物。
[0026] 本发明的又一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和治疗番鸭细小病毒 病的药物中的应用。
[0027] 优选地，所述疫苗组合物施用动物为雏番鸭、番鸭胚。
[0028] 更优选地，所述番鸭胚为20?29日龄的番鸭胚。
[0029] 本发明所提供的番鸭细小病毒抗原抗体复合物疫苗可用于雏番鸭的免疫，当用于 雏番鸭时，可使雏番鸭在易感日龄对抗番鸭细小病毒的感染。
[0030] 本发明所提供的番鸭细小病毒抗原抗体复合物可用于20?29日龄番鸭胚的接 种，当用于番鸭胚的接种时，可使孵化出的雏番鸭即具有对抗番鸭细小病毒的感染的抵抗 力。
[0031] 更优选地，所述雏番鸭、番鸭胚为高母源抗体水平的雏番鸭、番鸭胚。
[0032] 本发明技术方案带来的有益效果
[0033] 本发明利用番鸭细小病毒抗原和番鸭细小病毒的抗体混合，制备抗原抗体疫苗组 合物。该疫苗组合物经皮下接种1日龄雏番鸭，可在接种后第5天即产生理想的保护，并且 免疫效果不受母源抗体的影响。同时，该疫苗复合物还可经胚内途径进行接种，所接种的番 鸭胚孵化率不受影响，且在孵化后即可产生针对番鸭细小病毒强毒的保护力。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0035] 本发明实施例分别以番鸭细小病毒M91-G27株、番鸭细小病毒Pl株、番鸭细小病 毒Q株说明本发明。
[0036] 实施例1番鸭细小病毒M91-G27株抗原抗体复合物疫苗的制备和应用
[0037] I. 1番鸭细小病毒M91-G27株抗原的制备
[0038] I. I. 1番鸭细小病毒M91-G27株全病毒抗原的制备
[0039] 取番鸭细小病毒M91株，使用已经公开的方法(王永坤，钱钟，钱淑美， 等.雏番鸭细小病毒和小鹅瘟病毒特性比较及二联活苗的应用[J]，中国禽业导 干IJ，2004, 21 (9) : 18-20)，首先在番鸭胚中传代3代，命名为M91株，然后在12日龄鹅胚中连 续传代27代，命名为M91-G27株。取M91-G27株接种鹅胚进行繁殖，收获感染鹅胚液，制成 番鸭细小病毒M91-G27株全病毒抗原。测定该全病毒抗原的病毒含量为10 6_5ELD5(l/0. 2ml。
[0040] I. I. 2番鸭细小病毒M91-G27株VP2蛋白的真核表达
[0041] 使用番鸭细小病毒M91-G27株的感染鹅胚液，参考文献中的方法(娄华等，番 鸭细小病毒VP2基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的鉴定[J]，中国预防兽医学 报，2004, 26(3) :202-206)，表达M91-G27株的VP2蛋白并进行纯化，收集蛋白洗脱液作为 VP2蛋白抗原。测定该蛋白洗脱液中的蛋白浓度为110ng/ml。
[0042] 1. 2番鸭细小病毒M91-G27株抗体的制备
[0043] 1. 2. 1番鸭细小病毒M91-G27株全病毒蛋黄抗体的制备
[0044] 将收获的M91-G27株感染鹅胚液，使用0. 3%甲醛溶液进行灭活，按等体积加入 弗氏完全佐剂制成油乳剂灭活疫苗。选取已开产的健康母鸡，每只经腿部肌肉注射疫苗 0. 5ml，每隔10天进行一次加强免疫，共免疫4次。在第4次注射后20天，收集母鸡所下的 蛋，无菌操作取其蛋黄倒入消毒好的组织捣碎机内，用灭菌生理盐水做1:3稀释，以1500r/ min匀浆2分钟后，用6层消毒纱布过滤，分装到灭菌塑料瓶中，IOOml/瓶，并加入青、链霉 素各3000U/ml，即为针对番鸭细小病毒全病毒的蛋黄抗体。使用乳胶凝集抑制试验（LPAI) 测定蛋黄中抗番鸭细小病毒M91-G27株的抗体滴度为1 : 45。
[0045] 1. 2. 2番鸭细小病毒M91-G27株全病毒抗血清的制备
[0046] 将收获的M91-G27株感染鹅胚液，使用0. 3%甲醛溶液进行灭活，按等体积加入弗 氏完全佐剂制成油乳剂灭活疫苗。使用30Kg以上的山羊，每头山羊经皮下注射疫苗lml，以 后每隔7天进行一次注射，每次lml，共注射4次，至第4次注射后11天，在无菌环境下采 用颈动脉一次放血的方法收集免疫山羊的血液，并分离血清。将分离的血清以8000r/min 离心10分钟去除杂质，按照1:7的比例加入灭菌生理盐水进行稀释混匀，然后分装到灭菌 玻璃瓶中，IOml/瓶，并加入青、链霉素各3000U/ml，即为针对番鸭细小病毒全病毒的抗血 清。使用乳胶凝集抑制试验（LPAI)测定血清中抗番鸭细小病毒M91-G27株的抗体滴度为 1 : 115。
[0047] 1. 2. 3抗番鸭细小病毒M91-G27株VP2蛋白蛋黄抗体的制备
[0048] 使用表达并纯化的VP2蛋白洗脱液，加入等体积的弗氏完全佐剂制成油乳剂疫 苗。选取已开产的健康母鸡，每只经腿部肌肉注射疫苗0. 5ml，每隔10天进行一次加强免 疫，共免疫4次。在第4次注射后20天，收集母鸡所下的蛋，无菌操作取其蛋黄倒入消毒好 的组织捣碎机内，用灭菌生理盐水做1:3稀释，以1500r/min匀浆2分钟后，用6层消毒纱 布过滤，分装到灭菌塑料瓶中，IOOml/瓶，并加入青、链霉素各3000U/ml，即为针对番鸭细 小病毒VP2蛋白的蛋黄抗体。使用乳胶凝集抑制试验（LPAI)测定蛋黄中抗番鸭细小病毒 M91-G27株的抗体滴度为1 : 8。
[0049] 1. 2. 4抗番鸭细小病毒M91-G27株VP2蛋白抗血清的制备
[0050] 使用表达并纯化的VP2蛋白洗脱液，加入等体积的弗氏完全佐剂制成油乳剂疫 苗。使用30Kg以上的山羊，每头山羊经皮下注射疫苗lml，以后每隔7天进行一次注射，每次 lml，共注射4次，至第4次注射后11天，在无菌环境下采用颈动脉一次放血的方法收集免 疫山羊的血液，并分离血清。将分离的血清以8000r/min离心10分钟去除杂质，按照1:7的 比例加入灭菌生理盐水进行稀释混匀，然后分装到灭菌玻璃瓶中，IOml/瓶，并加入青、链霉 素各3000U/ml，即为针对番鸭细小病毒VP2蛋白的抗血清。使用乳胶凝集抑制试验（LPAI) 测定蛋黄中抗番鸭细小病毒M91-G27株的抗体滴度为1 : 24。
[0051] 1. 3抗原抗体复合物疫苗的制备
[0052] 将制备的番鸭细小病毒M91-G27株全病毒抗原用灭菌生理盐水分别稀释至 IOELD5tlA). 2ml和10000ELD5(l/0. 2ml，将制备的番鸭细小病毒全病毒的蛋黄抗体用灭菌生理 盐水分别稀释至和1 : 16和1 : 4,将制备的番鸭细小病毒全病毒的抗血清用灭菌生理盐 水分别稀释至1 : 32和1 : 90。然后将不同抗原含量的番鸭细小病毒全病毒抗原与不同 抗体浓度的蛋黄抗体或抗血清按体积比为I : 1分别混合，在37°C下孵育1小时，即分别制 成不同的疫苗复合物，详细数据见表1。
[0053] 表1番鸭细小病毒全病毒抗原抗体复合物疫苗的配制
[0054]
【权利要求】
1. 一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的番鸭细小病毒抗原和免疫量 的番鸭细小病毒抗体。
2. 如权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述番鸭细小病毒抗原为番鸭细小病毒全 病毒，优选灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的番鸭细小病毒，含有至少番鸭细小病毒 的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少番鸭细小病毒的免疫原性氨基酸序列 的多肽或蛋白；所述番鸭细小病毒抗体为使用番鸭细小病毒抗原制备的蛋黄抗体和/或抗 血清。
3. 如权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述番鸭细小病毒抗原为减毒形式的番鸭 细小病毒活病毒或番鸭细小病毒VP2蛋白；所述番鸭细小病毒抗体为使用减毒形式的番鸭 细小病毒活病毒或番鸭细小病毒VP2蛋白制备的蛋黄抗体和/或抗血清。
4. 如权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述番鸭细小病毒抗原为番鸭细小病毒 M91-G27株，番鸭细小病毒P1株，番细小病毒Q株活病毒，或为番鸭细小病毒M91-G27株，番 鸭细小病毒P1株，番细小病毒Q株VP2蛋白；所述番鸭细小病毒抗体为使用番鸭细小病毒 M91-G27株，番鸭细小病毒P1株，番细小病毒Q株灭活疫苗制备的蛋黄抗体和/或抗血清， 或为番鸭细小病毒M91-G27株，番鸭细小病毒P1株，番细小病毒Q株VP2蛋白制备的蛋黄 抗体和/或抗血清。
5. 如权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述番鸭细小病毒抗原含量为5? 105ELD5(l/0. 2ml或所述番鸭细小病毒抗原含量为VP2蛋白1?100ng/ml ;所述番鸭细小病 毒抗体LPAI抗体滴度为1 : 2?1 : 90。
6. -种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法，所述方法包括： 1) 增殖培养所述减毒形式的番鸭细小病毒活病毒； 2) 用所述番鸭细小病毒灭活疫苗制备蛋黄抗体或用所述番鸭细小病毒灭活疫苗制备 抗血清； 3) 按比例配制所述番鸭细小病毒活病毒抗原和所述番鸭细小病毒抗体组合物。
7. -种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法，所述方法包括： 1) 表达所述番鸭细小病毒VP2蛋白； 2) 用所述番鸭细小病毒灭活疫苗制备蛋黄抗体或用所述番鸭细小病毒灭活疫苗制备 抗血清； 3) 按比例配制所述番鸭细小病毒活病毒抗原和所述番鸭细小病毒抗体组合物。
8. 如权利要求1所述的疫苗组合物在制备预防和治疗番鸭细小病毒病的药物中的应 用。
9. 如权利要求8所述的应用，所述疫苗组合物施用动物为雏番鸭、番鸭胚。
10. 如权利要求9所述的应用，所述番鸭胚为20?29日龄的番鸭胚。
11. 如权利要求9所述的应用，所述雏番鸭、番鸭胚为高母源抗体水平的雏番鸭、番鸭 胚。
【文档编号】A61K39/23GK104288766SQ201310304536
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月18日 优先权日:2013年7月18日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司