预防和治疗炎症的小分子多肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种预防和治疗炎症的小分子多肽。本发明还涉及所述小分子多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度等。
【专利说明】预防和治疗炎症的小分子多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种新型的、预防和治疗炎性疾病的小 分子多肽，称之为H-RN。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合 物。
【背景技术】
[0002] 眼部葡萄膜炎是一类临床常见、治疗棘手的免疫原性疾病，可破坏血眼屏障，引起 眼内邻近组织的增生，从而导致白内障、黄斑水肿、继发性青光眼以及最终眼内组织损伤， 致盲率高，严重影响患者的视觉质量和生活质量。在欧美国家，约有35%的葡萄膜炎患者出 现不同程度的视力损害；国内葡萄膜炎致盲率为18. 76%。
[0003] 目前，葡萄膜炎的治疗方法主要是局部或全身使用非留体类消炎药、激素和免疫 抑制剂。然而，激素或免疫抑制剂不可避免存在一些严重的毒副作用，如白内障、高眼压、感 染以及肾毒性等；而非留体类消炎药局部刺激性强，且药物分子量大，因而眼部屏障的低通 透性在一定程度上限制了药物在眼组织局部的有效浓度。此外，针对葡萄膜炎造成的各种 病理结果如血管新生、组织增生等进行的药物筛选或对症治疗，往往只能相对减轻症状，而 无法对葡萄膜炎的基础病变即亢进的炎性反应进行有效的抑制。
[0004] 近年来，越来越多的生物制剂通过实验室或临床证实具有抑制眼部炎症的作用， 包括抗氧化剂(如苯磷硫胺、N-乙酰半胱氨酸等)、植物提取物、抗细胞因子单克隆抗体(如 IL-2受体α亚基单克隆抗体达珠单抗Daclizumab、抗TNF-α单克隆抗体英夫利昔单抗 Inf Iiximab)等。然而，这些生物制剂分子量大，体外合成方法复杂，存在制备过程中重组表 达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足；且容易因蛋白构象以及修饰改变而导致生物学活性 丧失；由于其分子量大，难以通过血眼屏障，需要经过反复玻璃体腔注射或者转基因等方法 发挥抗炎的作用，存在组织损伤等严重并发症的风险。
[0005] 在开发有效的眼部炎症抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。
[0006] 第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和 血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大 于76. 5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜血管。
[0007] 第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。
[0008] 第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，需加大给药 的浓度。但高浓度药物的毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给药。
[0009] 第四，目前虽然已经有一系列相对安全的内源性炎症抑制剂被先后证实，但由于 其分子量较大且空间构象复杂，故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留 等不足。
[0010] 多肽类炎症抑制剂与目前研究广泛的蛋白类炎症抑制剂相比具有合成方法简单、 容易进行化学修饰、免疫原性低、溶解性好、生物利用率高、组织穿透性强、给药途径多样、 价格低廉等突出优势。
[0011] 因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的安全有效的小分子炎症抑制剂。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的是提供一种适于眼球组织的安全有效的可抑制眼部炎症的小分子 多肽--H-RN多肽以及其片段、类似物和衍生物。
[0013] 本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。
[0014] 在本发明的第一方面，提供了一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐
[0015] [XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]
[0016] _[Xaa8]_[Xaa9]-[XaalO]-[Xaal l]_[Xaal2] (I)
[0017] 式中，
[0018] XaaO是无，或1-3个氨基酸构成肽段；
[0019] Xaal是选自下组的氨基酸：Arg、Lys或Gln ;
[0020] Xaa2是选自下组的氨基酸：Asn或Gln ;
[0021] Xaa3是选自下组的氨基酸：Pro或Ala ;
[0022] Xaa4是选自下组的氨基酸：Arg或Lys ;
[0023] Xaa5是选自下组的氨基酸：Gly或Ala;
[0024] Xaa6是选自下组的氨基酸：Glu或Asp ;
[0025] Xaa7是选自下组的氨基酸：Glu或Asp ;
[0026] Xaa8是选自下组的氨基酸：Gly或Ala;
[0027] Xaa9是选自下组的氨基酸：Gly或Ala;
[0028] XaalO是选自下组的氨基酸：Pro或Ala ;
[0029] Xaall是选自下组的氨基酸：Trp、Tyr或Phe ;
[0030] Xaal2是无，或1-3个氨基酸构成肽段；
[0031] 并且所述的多肽具有抑制炎症的活性。
[0032] 在另一优选例中，XaaO和Xaal2为无。
[0033] 在另一优选例中，Xaal 为 Arg，Xaa4 为 Arg，XaalO 为 Pro 和 Xaall 为 Trp。
[0034] 在另一优选例中，所述多肽选自下组：
[0035] (a)具有RNPRGEEGGPW(SEQ ID N0:2)所示氨基酸序列的多肽，且所述的多肽的长 度为11-15个氨基酸；
[0036] (b)将SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列经过1-2个氨基酸残基的取代、缺失或添加而 形成的，且具有抑制炎症功能的由（a)衍生的多肽。
[0037] 本发明还提供了抑制炎症功能的、式I化合物的二聚体和多聚体形式。
[0038] 在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明上述的多肽。
[0039] 在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有：
[0040] (a)本发明上述的多肽或其药学上可接受的盐；和
[0041] (b)药学上可接受的载体或赋形剂。
[0042] 在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂（如眼周和眼内注射液）、眼 用凝胶或眼药膏。
[0043] 在另一优选例中，所述组合物为缓释剂型。
[0044] 在本发明的第四方面，提供了一种本发明所述多肽或药学上可接受的盐的用途， 它们被用于制备用于抑制炎症或治疗与炎症相关疾病的药物。
[0045] 在另一优选例中，所述的与炎症相关疾病的选自下组：眼部炎性疾病、胰腺炎、炎 症性肠病、肺部炎症、皮肤炎症、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等。
[0046] 在另一优选例中，所述的眼部炎性疾病包括累及脉络膜、视网膜、结膜、角膜或虹 膜，包括睑缘炎、结膜炎、角膜炎、巩膜炎、葡萄膜炎、视网膜周围静脉炎、视神经炎等。
[0047] 在本发明的第五方面，提供了一种抑制哺乳动物炎症的方法，包括步骤：给需要的 对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。
[0048] 在另一优选例中，所述的对象是人。
[0049] 在另一优选例中，所述的炎症是与眼部炎性疾病相关的炎症。
【专利附图】
【附图说明】
[0050] 下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的 本发明范围。
[0051] 图1显不了 H-RN多肽对大鼠内毒素诱导的葡萄膜炎（Endotoxin-induced Uveitis，EIU)模型炎性细胞浸润的影响。A.正常Wistar大鼠对照组玻璃体腔注射PBS对 照组临床表现。B. LPS诱导玻璃体腔注射PBS组临床表现。C. LPS诱导玻璃体腔注射H-RN 组（10 μ g/ μ 1)临床表现。D.对照组、LPS组、DXM组及H-RN干预组（1、5、10 μ g/ μ I) EIU 临床评分。Ε.对照组、LPS组、DXM组及H-RN干预组（1、5、10μ g/μ 1)房水炎症细胞计数。 n=9-15, **p〈0. Olvs LPS 组。
[0052] 图2显示了 H-RN多肽对LPS诱导RAW264. 7细胞促炎细胞因子表达的影响。Α.正 常对照组、LPS组及H-RN干预组（1、10、100 μ M) RAW264. 7细胞上清液TNF- α浓度测定情 况。Β.正常对照组、LPS组及H-RN干预组（1、10、100 μ Μ) RAW264. 7细胞上清液IL-6浓度 测定情况。η=10, *ρ〈0· 05, #p〈0. Olvs LPS 组。
[0053] 图3显示了 RAW264. 7细胞在H-RN不同浓度（0. 1、1、10、10(^]?、11111)干预下细胞 的相对增殖率。η=6。
【具体实施方式】
[0054] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一种具有抑制炎症功能的，分子量 仅I. 254KD的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析 和生物学特性等分析，选定了数个候选序列，采用固相法将其合成后，再经内毒素诱导大鼠 葡萄膜炎模型筛选，获得了一类新型的、具有预防和治疗眼部炎症功能的小分子多肽，即 H-RN。
[0055] 本发明的小肽H-RN的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪 液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生 物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。
[0056] 肝细胞生长因子（HGF)
[0057] 肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF)是由分子量69kD的重链和分 子量34kD的轻链通过二硫键构成的二聚体，重链的N末端有一发夹状结构，靠近其C末端 由 4 个连续的 Kringle 环区构成。HGF 的 Genbank ID :AAA64239. 1。
[0058] HGF是一种作用广泛的细胞因子，除对肝细胞作用外，还对多种组织和细胞具有调 控作用，其主要生物学活性及生理作用有：启动肝再生、促进细胞分裂作用、促进细胞运动 作用、肿瘤坏死作用等。本发明人经过大量片段的筛选，获得了来自HGF的抗炎活性片段， 该片段长度仅为11个氨基酸，分子量小，易于穿透血眼屏障，在眼部局部抗炎中具有广阔 的应用前景。
[0059] LPS所致小鼠炎症模型
[0060] 脂多糖（LPS，Lipopolysaccharides)是一种淋巴细胞的多克隆刺激剂，体外实验 中它可直接活化B淋巴细胞使其发生活化，增殖等一系列变化。LPS进入血液循环后，通过 多种受体(如CD14、CD11 / 18和脂蛋白净化剂受体)与单核-吞噬细胞、内皮细胞等结合，激 发机体的非特异性免疫功能，诱导细胞因子和炎症介质的表达，如前炎症细胞因子TNF-α、 IL-1、IL-6、IL-8、IFNy等。其中TNF-α是主要的快速反应促炎介质，是启动促炎瀑布级 联反应的最上游介质，在一定程度上可反映病情的变化。
[0061] 目前，LPS所致的小鼠炎症模型可广泛应用于抗炎药物的筛选与测试，具有稳定、 良好的代表性。
[0062] 活性多肽
[0063] 在本发明中，术语"本发明多肽"、"H-RN多肽"、"H-RN小肽"或"肽H-RN"可互换 使用，都指具有炎症抑制活性的肽H-RN氨基酸序列（SEQ ID NO :2)的蛋白或多肽。此外， 所述术语还包括具有抑制炎症功能的、SEQ ID NO :2序列的变异形式。这些变异形式包括 (但并不限于）：1-5个（通常为1-4个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个）氨基酸 的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个（通常为5个以内， 较佳地为3个以内，更佳地为2个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的 氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个 或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。
[0064] 本发明还包括H-RN蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、 "衍生物"和"类似物"是指基本上保持抑制炎症功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍 生物或类似物可以是α)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基（优选保守性氨基酸残 基）被取代的多肽，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或（iii)H-RN 多肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合所形成的多肽， 或（iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽（与前导序列、分泌序列或6His 等标签序列融合而形成的然后蛋白）。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本 领域熟练技术人员公知的范围。
[0065] 一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3 个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这 些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。
[0066] 表 I
[0067]
[0068]
【权利要求】
1. 一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐 [XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7] -[Xaa8]-[Xaa9]-[XaalO]-[Xaal1]-[Xaal2] (I) 式中， XaaO是无，或1-3个氨基酸构成肽段； Xaal是选自下组的氨基酸：Arg、Lys或Gin ; Xaa2是选自下组的氨基酸：Asn或Gin ; Xaa3是选自下组的氨基酸：Pro或Ala ; Xaa4是选自下组的氨基酸：Arg或Lys ; Xaa5是选自下组的氨基酸：Gly或Ala ; Xaa6是选自下组的氨基酸：Glu或Asp ; Xaa7是选自下组的氨基酸：Glu或Asp ; Xaa8是选自下组的氨基酸：Gly或Ala ; Xaa9是选自下组的氨基酸：Gly或Ala ; XaalO是选自下组的氨基酸：Pro或Ala ; Xaall是选自下组的氨基酸：Trp、Tyr或Phe ; Xaal2是无，或1-3个氨基酸构成肽段； 并且所述的多肽具有抑制炎症的活性。
2. 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO和Xaal2为无。
3. 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，Xaal为Arg，Xaa4为Arg，XaalOPro和Xaall 为 Trp。
4. 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自下组： (a) 具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽，且所述的多肽的长度为11-15氨基酸； (b) 将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过1-2个氨基酸残基的取代、缺失或添而形成 的，且具有抑制炎症功能的由（a)衍生的多肽。
5. -种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。
6. -种药物组合物，其特征在于，它含有： (a) 权利要求1所述多肽或其药学上可接受的盐；和 (b) 药学上可接受的载体或赋形剂。
7. 如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为眼药水、针剂、 眼用凝胶或眼药膏。
8. 权利要求1所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备抑制炎 症或治疗与炎症相关疾病的药物。
9. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的与炎症相关疾病的选自下组：眼部炎 性疾病、胰腺炎、炎症性肠病、肺部炎症、皮肤炎症、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等。
10. -种抑制哺乳动物炎症的方法，其特征在于，给需要的对象施用权利要求1所述的 多肽或其药学上可接受的盐。
【文档编号】A61P19/02GK104371003SQ201310357596
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】许迅, 王莉莉, 徐艺 申请人:上海市第一人民医院