Vii型新城疫病毒l基因突变的减毒疫苗株及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种应用反向遗传操作技术生产的Ⅶ型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株及其制备方法，属于生物制品和生物【技术领域】，VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株毒力均明显减弱，同时在鸡胚上具有高滴度、遗传性能稳定、与流行病毒的抗原匹配性高，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗，与常规疫苗（基因Ⅰ和基因Ⅱ型）相比，Ⅶ型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株将在控制新城疫的发病和流行方面显示出广阔的应用前景。
【专利说明】Vl I型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种应用反向遗传操作技术生产的VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株及其制备方法，属于生物制品和生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起,侵害鸡和火鸡,亦可感染其他禽类、鸟类的一种急性、高度传染性疾病，是世界公认的最重要的两大禽类传染病之一(另一个是高致病性禽流感)。NDV属于副粘病毒科腮腺炎病毒属，具有囊膜结构，基因组为单股负链不分节段的RNA病毒，由6种结构蛋白组成，分别为NP、P、M、F、HN和L蛋白:M、F和HN蛋白与病毒囊膜的形成相关；NP蛋白为核衣壳蛋白，P蛋白是病毒RNA合成的必需因子山蛋白为病毒最大的蛋白，它在NDV 6种结构蛋白中最为保守，具有RNA聚合酶、转录后修饰等生物学活性，可与NP和P蛋白共同构成病毒复制复合体，该复合体参与病毒基因组的转录和复制，L蛋白除了参与病毒基因组的复制外，还具有5’端加帽、帽依赖的甲基化转移酶活性及3’端添加多聚腺苷酸尾巴等功能。
[0003]不同NDV分离株之间的毒力差异很大，根据对鸡和鸡胚的致病性及毒力不同，可将NDV分成三类:即强毒型(速发型)、中等毒力型(中发型)和弱毒型(缓发型)。
[0004]以往研究认为NDV的感染性和毒力是由F基因决定，强毒株F蛋白裂解位点为RRQKRF,而弱毒株LaSota的F蛋白裂解位点为GRQGRL。但随着反向遗传学技术的不断发展及在NDV研究中的深入应用，NDV的致病机制又有了新的研究进展。PeeteriDe Leeuw和Panda等将弱毒株的F基因裂解位点突变为与强毒株一致的裂解位点后拯救出了新的重组病毒，实验表明虽然其毒力明显提高，但却并没有达到与强毒株毒力一致的水平，这就表明在NDV基因组中除了 F基因的裂解位点外，还可能存在其它能影响病毒毒力的基因。最近有研究指出，L、HN和V蛋白也与病毒的毒力和致病性有关，L蛋白可通过提高病毒的复制水平而增强NDV毒力。Rout等将NDV BC株的L基因替换为LaSota的L基因，病毒获救后毒力反而增强。另外，我们成功救获3株基因VI1-97 NDV L突变株(K1756A、K1917A和E1954Q位氨基酸突变)和I株基因VI1-97 NDV F与L共突变株(E1954Q+F)，通过病毒毒力指标测定发现，这4株VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株能够使病毒毒力减弱，我们有理由推断NDV L蛋白对病毒的毒力起着至关重要的作用。这些实验充分说明L蛋白与病毒的毒力存在联系。
[0005]当前世界上防控NDV主要疫苗株是LaSota和BI两种毒株，LaSota和BI两弱毒株都属于基因II型。但是国内的学者严维巍等在2000年首次报道了基因VII型NDV在中国大陆的存在；2001年，刘华雷等对1994年以来选取的国内不同地区的代表株进行遗传分析证实，所分离的8株毒株在裂解位点的氨基酸序列均与NDV的强毒株相似。通过遗传进化树分析表明，8株分离株中有7株为基因VII型NDV，这些数据充分表明我国当前主要流行基因VII型新城疫病毒。LaSota和BI两种弱毒疫苗作为疫苗毒株已经应用了几十年，疫苗尽管能提供一定的免疫保护，但不能阻止家禽的排毒和抑制病毒的传播能力，因此，新城疫依然是威胁养禽业发展的最主要的疫病之一，中国每年由此造成巨大的经济损失。而且当前中国流行的毒株主要是基因vn型，随着病毒的不断变异，针对基因vn型的同基因型疫苗的研发成为当前的主要任务，我国VD型的新城疫疫苗研制已经取得良好进展，一旦产业化后，必将成为规模化养殖场免疫程序中必要的一环。本发明为开展NDV减毒疫苗的研制和NDV相关基础研究奠定了坚实的基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的不足而发明的VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株及其制备方法，从而解决当前我国市场上所用的NDV疫苗株(基因I和基因II型)与目前NDV流行株(基因VII型)的基因型不一致而导致的保护效率不完全，不能有效阻止病毒传播的实际问题。
[0007]本发明是通过如下技术方案予以实现的:
一种VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株，其特征在于:VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株毒力均明显减弱，同时在鸡胚上具有高滴度、遗传性能稳定、与流行病毒的抗原匹配性高，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗，该VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株的抗原核苷酸序列为SEQ ID NO:1至SEQ ID N0:4所示。
[0008]一种所述的VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株的制备方法，其特征在于:
构建覆盖整个基因组的五个cDNA克隆片段，利用各片段间重叠部分的酶切位点，在转录载体质粒PBR322连接组装获得了 15192nt的完整cDNA克隆。在全长cDNA片段的5’末端前缀I7RNA聚合酶启动子，在cDNA片段后加入具有自我催化功能的丁肝病毒核酶(RiB)和17转录终止信号，构建好的质粒命名为prNDV-97 ;通过PCR基因组将基因组cDNA中的L蛋白编码区第14056位碱基由A同义突变为G，消除14056bp处的Hind III酶切位点，并作为拯救病毒的分子标记，构建完成的质粒命名为pmNDV-97 ;在!7聚合酶启动子于基因组cDNA的5’末端引入两个多余的G，有助于副粘病毒反向遗传操作的病毒拯救。
[0009]设计5对引物用于扩增NDV W -97株基因组SEQ ID NO: 5，引物序列如下:
Fl:5’ ATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGACCAAACAGAGAATCTG
TGAGGTACGATAA3，
Rl:5’ TAGGTACCCTTGCAGTGGCAGACTTAATCAATTCAGAG3’
F2:5’ GGGTGAAATGACGCTCAATAAACTCTCACA3’
R2:5’ ATGGTACCCTCCCTGTTGCAGATGTCCGAAGCACACCA3’
F3:5’ TGCAGAGATCACTCACACTCACATCAATAC3’
R3:5’ ACGGTACCAGGTGACCAGCTTCTGTTTCGGGCATAATC3’
F4:5’ ATTAGTTTCTTCCAATATGTGCTCGCTGAC3’
R4:5’ GTAGTAATGATACAGACCTGTAGGGTACCA3’
F5:5’ GGAGAGAGAATGCAGAAGAAAGTGACCTGACCTCAGATAAAGCAG3’
R5:5’ AGCCGGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCCACCAAACAG
AGATTTGGTGAATGACATC3’
设计2对用于突变14056bp也Hind III酶切位点引物，消除此酶切位点，引物序列如下:
【权利要求】
1.一种VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株，其特征在于:该VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株毒力明显减弱，同时在鸡胚上具有高滴度、遗传性能稳定、与流行病毒的抗原匹配性高，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗，该VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株的抗原核苷酸序列为SEQ ID NO:1至SEQ ID N0:4所示。
2.—种VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株的制备方法，其特征在于:构建了覆盖整个基因组的五个cDNA克隆片段，利用各片段间重叠部分的酶切位点，在转录载体质粒pBR322连接组装获得了 15192nt的完整cDNA克隆；在全长cDNA片段的5’末端前缀I7RNA聚合酶启动子，在cDNA片段后加入具有自我催化功能的丁肝病毒核酶(RiB)和T7转录终止信号，构建好的质粒命名为prNDV-97 ;通过PCR基因组将基因组cDNA中的L蛋白编码区第14056位碱基由A同义突变为G，消除14056bp处的Hind III酶切位点，并作为拯救病毒的分子标记，构建完成的质粒命名为pmNDV-97 ;同时在17聚合酶启动子于基因组cDNA的5’末端引入两个多余的G，有助于副粘病毒反向遗传操作的病毒拯救； 设计5对引物用于扩增NDV VI1-97株基因组SEQ ID NO:5，引物序列如下:
3.如权利要求2所述的VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株的制备方法，其特征在于: 以分离株NDV W-97的基因组L基因进行定点突变，对L蛋白结构域VI内进行单点氨基酸突变，得到高度致弱的NDV W-97 L减毒株K1756A、K1917A和E1954Q ;在E1954Q的基础上，对F蛋白裂解位点进 行突变，将强毒株的F蛋白裂解位点(RRQKRF)突变为LaSota弱毒株的F蛋白裂解位点(GRQGRL)，所获得的减毒株为E1954Q+F ； 用于突变F蛋白裂解位点的引物如下:
4.根据权利要求3所述VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株的制备方法，其特征在于: 1)NDV W -97株基因组全长cDNA的构建； 2)NDV W -97 L蛋白结构域VI内氨基酸定点突变和突变体全长cDNA的连接； 3)在E1954Q突变的基础上，NDVW -97 F蛋白裂解位点的突变和突变体全长cDNA的连接； 4)VII型新城疫病毒L基因突变的减毒疫苗株K1756A、K1917A、E1954Q 和E1954Q +F的拯救； 将质粒 PK1756A、pK1917A、pE1954Q 和 pE1954Q+F 分别与 pBSK-NP、pBSK-P 和 pBSK_L三个真核表达质粒共转染BHK-21细胞，转染72h后将细胞上清接种9-11日龄SPF鸡胚，每份样品接种3枚，0.2mL/枚，成功救获NDV W -97 L基因突变减毒株K1756A、K1917A和E1954Q及F蛋白与L蛋白共突变减毒疫苗株E1954Q +F。
【文档编号】A61P31/14GK103525777SQ201310456112
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年7月1日
【发明者】朱启运, 吉艳红, 付钰广 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所